田 林，尹丹丹，成鐵龍，夏新莉，尹偉倫

(1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091；3. 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

土壤高鹽是限制植物生長發(fā)育、地理分布的主要環(huán)境脅迫因子之一[1]。世界上有超過6%的土地被鹽化，超過20%的灌溉土地遭受鹽害[2-4]。鹽生植物作為可以在鹽化土壤中正常生存的一類植物，被廣泛地用于鹽堿地的生態(tài)改良和植被保護。因此，研究鹽生植物的耐鹽機制、發(fā)掘和選育耐鹽植物對充分利用鹽化土地、改善生態(tài)環(huán)境具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟意義。

蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺屬（Nitraria）植物廣泛生長在亞洲、非洲和歐洲鹽堿地，因其較強的耐鹽性，被應(yīng)用于鹽堿地的植被改善和生態(tài)環(huán)境改良。有關(guān)白刺耐鹽的特性和生理生化機制研究已有一定的進展，研究報道白刺屬可以耐受高達500 mmol·L-1的 NaCl脅迫條件[5-6]，NaCl脅迫可以顯著增加 Na＋濃度，降低 K+濃度[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，唐古特白刺（N. tangutorum）可能通過將Na+積聚在液泡內(nèi)進行隔離，并對其它礦質(zhì)營養(yǎng)離子進行選擇性吸收，進而控制Na+/K+比值，以提高白刺耐鹽性[8]。唐古特白刺幼苗經(jīng)高鹽處理7 d時，葉綠素含量隨鹽脅迫濃度升高而呈現(xiàn)先升后降的變化，當(dāng)NaCl濃度達 300 mmol·L-1時，葉綠素含量最高[9]；鹽脅迫也提高了游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量[10-12]。低濃度NaCl處理可以提高葉片中超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性，進而提高植物對鹽分脅迫的適應(yīng)性[13]。

關(guān)于白刺耐鹽的分子機制研究可以歸結(jié)為兩個方面：一方面，在500 mmol·L-1NaCl 高鹽脅迫時，唐古特白刺幼苗體內(nèi)涉及到的光合過程、氧化還原、逆境、防御、能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)折疊和裝配、轉(zhuǎn)錄、膜運輸、激素合成等途徑的蛋白質(zhì)表達發(fā)生了顯著改變[4]；另一方面，200 mmol·L-1NaCl 中等鹽脅迫誘導(dǎo)了比拉底白刺 (N. billardieri)幼苗葉片內(nèi)多條代謝途徑的蛋白質(zhì)表達水平的改變，其中涉及到的有碳水化合物代謝、光合過程、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)折疊和組裝、蛋白質(zhì)合成、氧化還原、次級代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架、細(xì)胞防御、能量代謝、膜與運輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[14]。上述2個白刺研究均是通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，不同強度鹽脅迫導(dǎo)致了一些相同類別蛋白質(zhì)的表達及變化趨勢，同時也呈現(xiàn)出一些細(xì)微的差別。

上述研究工作為了解白刺耐鹽的生理生化與分子機制奠定了一定的基礎(chǔ)，而基因作為植物應(yīng)答環(huán)境脅迫的早期響應(yīng)分子，對調(diào)控植株應(yīng)對脅迫生存條件并適應(yīng)脅迫環(huán)境起到關(guān)鍵作用。為了尋找白刺應(yīng)答鹽脅迫的基因并解析其分子機制，本研究以比拉底白刺幼苗為材料，運用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘200 mmol·L-1NaCl 脅迫下比拉底白刺幼苗葉片內(nèi)的差異表達基因，并運用生物信息學(xué)方法分析差異表達基因的生物學(xué)功能及其參與的代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

比拉底白刺幼苗的培養(yǎng)參照Tian等[14]方法，并稍作調(diào)整。將經(jīng)溫水浸種24 h后的比拉底白刺種子播種于裝有純凈河沙的塑料盆（高14 cm，直徑12 cm，底部有孔），5個塑料盆放在一個塑料桶里（高15 cm，直徑80 cm）；然后放置在溫室中培養(yǎng)，在（27± 2）℃ 下光照 (400～800 μmol·m-2·s-1)培養(yǎng)14 h和在（25±1）℃黑暗培養(yǎng)10 h，溫室的相對濕度維持在60%～80%。待幼苗生長至2個月時，選取長勢整齊的幼苗分為兩組，第一組用200 mmol·L-1NaCl處理，第二組為對照，每組3個重復(fù)。7 d時分別取樣，放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 葉片總 RNA 樣品的提取

取比拉底白刺幼苗葉片放于已滅過菌的研缽中，添加適量液氮快速研磨，然后取0.3 g 磨好的樣品全部裝入1mL EP 管中；加入1 mL Trizol 試劑，搖勻后靜置10 min；加入0.3 mL氯仿，搖勻后靜置10 min，然后離心15 min (4℃, 12 000 g) ；吸取上清液。再加入等體積異丙醇，靜置4 h后離心15 min (4℃, 12 000 g) ；去上清液，并用75%酒精洗滌，然后同樣在高速冷凍離心機上離心5 min(4℃, 12 000 g) ；用 75% 乙醇重復(fù)洗滌后，在冰上晾干；用無 RNAase 的水溶解后，分別用 1% RNA瓊脂糖凝膠電泳和 Nanodrop 儀檢測 RNA 樣品的質(zhì)量和濃度。

1.3 RNA-seq 測序

總RNA經(jīng)DNase I消化后，通過富集含有polyA尾巴的mRNA、mRNA打斷成200 nt的小片段、反轉(zhuǎn)錄成第一條鏈cDNA、合成第二鏈cDNA等步驟，用 QIA quick PCR extraction kit 進行純化，然后進行末端修復(fù)加 polyA。經(jīng)回收純化、PCR 富集獲得 cDNA 文庫。文庫構(gòu)建完成后，使用 Agilent 2100 Bioanalyzer和 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System 分別對文庫的插入片段長度和有效濃度進行檢測，樣品合格后在 Iilumina 測序平臺 (Illumina HiSeqTM2000) 進行高通量測序。將得到的序列原始文件 Raw Reads 進行過濾、比對、de novo組裝、Unigene 功能注釋、基因定量、差異基因篩選。其中，差異表達基因的篩選條件是FDR (False Discovery Rate) ＜0.001 且基因表達差異倍數(shù) (fold change) 大于2倍，選取這些基因作為應(yīng)答鹽脅迫的差異基因，用于后續(xù)分析。

1.4 差異基因的功能注釋與富集分析

1.4.1 GO 功能注釋 利用 Blast2GO 軟件將比對到 Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫中的所有差異基因進行GO 功能注釋和分類[15]，網(wǎng)站是 http://www.geneontology.org/，獲得轉(zhuǎn)錄本的GO 功能注釋信息。

1.4.2 GO 顯著性富集分析 差異表達基因比對Gene Ontology數(shù)據(jù)庫后，進行映射，得到目的GO條目（term）。以這些GO term為單位，通過超幾何檢驗（phyper），得到檢驗p值，Bonferroni校正后，對于correctedp-value＜0.05的GO term定義為在差異表達基因中顯著富集的GO term。

1.4.3 KEGG 顯著性富集分析 將差異表達基因應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測其參與的代謝途徑。以correctedp-value≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選在差異表達基因中顯著富集的代謝途徑。

1.4.4 基因互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用分子相互作用分析軟件(STRING)和相互作用蛋白數(shù)據(jù)庫（DIP）進行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測，運用Cytoscape程序構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)[16]。

1.5 實時熒光定量 PCR

以分別提取的對照組及鹽脅迫處理7d時的幼苗葉片RNA為模板，使用Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈作為實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 反應(yīng)的模板。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中隨機選擇7個差異表達基因，利用 Primer 5.0 設(shè)計 qRTPCR 引物，如表1。以18S rRNA 作為內(nèi)參，引物為 5 ′-GCTGGATTTGCTGGTGGTAT-3′ 和 5 ′-TTCCTGGGTCTGTGCCTGT-3 ′ (表 1)。 使 用SYBR? Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒進行熒光定量檢測。每個樣品進行3次重復(fù)，采用 2-ΔΔCt計算相對表達量。

表 1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 鹽脅迫下比拉底白刺葉片轉(zhuǎn)錄組分析

以鹽脅迫處理及對照組白刺葉片為材料，分別提取RNA后建立cDNA文庫，用Illumina HiseqTM2000測序。通過de novo拼接、組裝后共獲得168 463條unigenes。對測序獲得的所有unigenes分別與COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、NR七大功能數(shù)據(jù)庫進行比對和功能注釋，注釋率分別為 21.5%、41.2%、14.2%、37.2%、42.4%、40.4%、59.7%（表2）。結(jié)果共注釋到101 016條unigenes，占所有unigenes的60.0%，剩余67 447條（40.0%）unigenes未得到注釋。在注釋到的所有unigenes里，長度在300～1 000 bp的有24 329條，占24.1%；長度≥1 000 bp的有76 687條，占75.9%（表 2) 。

表 2 Unigene在多個數(shù)據(jù)庫中注釋結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Statistics of annotation results in the databases

2.2 鹽脅迫下比拉底白刺葉片差異表達基因

對鹽脅迫處理及未處理對照的比拉底白刺幼苗葉片RNA-seq測序后得到的所有基因進行差異表達篩選，以log2fold change (基因差異表達倍數(shù))的絕對值＞1且錯配率FDR＜0.001為差異表達基因(DEG）的篩選標(biāo)準(zhǔn)， 鹽脅迫7 d時，共篩選得到差異表達基因196個，其中，79條DEGs在鹽脅迫響應(yīng)中上調(diào)表達，下調(diào)表達DEGs有117條。基因表達差異變化絕大部分集中在3倍左右，其中，comp73009_c0_seq1差異變化為-7.10，下調(diào)變化最大，該unigene注釋為5′-甲基硫腺苷/s-腺苷同型半胱氨酸核苷酶（5′-methylthioadenosine/S-adenosyl-homocysteine nucleosidase）；comp79737_c1_seq2和comp82550_c1_seq4差異變化分別為5.29和5.21，上調(diào)變化最高，然而前者尚未得到注釋，功能未知，后者注釋為赤霉素調(diào)節(jié)蛋白（Gibberellin-regulated protein）。推測以上顯著差異unigenes可能參與比拉底白刺的耐鹽過程，需要進一步研究。

2.3 鹽脅迫下白刺差異表達基因的 GO 分析

Gene Ontology（GO）分析能夠比較全面地描述差異表達基因的主要生物學(xué)功能，是一個國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類系統(tǒng)。對鹽脅迫處理7 d的比拉底白刺葉片DEGs進行GO分析，劃分為64個功能組（圖1），GO數(shù)據(jù)庫中的結(jié)構(gòu)根據(jù)功能組的不同又進一步分為三類描述：生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分圖1顯示了比拉底白刺鹽脅迫后差異基因表達譜的總體情況。生物學(xué)過程主要集中在代謝過程、單體過程、細(xì)胞過程和刺激反應(yīng)。在分子功能中，注釋為結(jié)合和催化活性的差異基因最多，其次為轉(zhuǎn)運活性和抗氧化活性。在細(xì)胞組分大類中，差異基因被注釋到最多的亞類依次為細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器、膜、細(xì)胞器組分和膜部分（圖1）。以上注釋較多的過程涉及到的基因可能參與了比拉底白刺的鹽脅迫響應(yīng)過程，進一步挖掘這些差異表達基因有助于研究其抗逆機制和品質(zhì)改良。

圖 1 鹽脅迫下比拉底白刺葉片差異表達基因的GO功能聚類注釋圖Fig. 1 Gene Ontology classification annotation of differentially expressed genes in the leaves of N. billardieri under salt stress

通過進一步對比拉底白刺葉片DEGs的GO富集分析（校正后p-value＜0.05）發(fā)現(xiàn)：在生物學(xué)過程中DEGs富集最顯著的GO term分別是細(xì)胞壁高分子分解代謝過程、幾丁質(zhì)分解代謝過程、多糖分解代謝過程、氨基糖代謝過程、防御反應(yīng)。在細(xì)胞組分中，富集最顯著的GO term分別是液泡、葉綠體類囊體膜、細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)外體、細(xì)胞壁。在分子功能中的DEGs富集最顯著的GO term分別是幾丁質(zhì)結(jié)合、幾丁質(zhì)酶活性、氧化還原酶活性、醌結(jié)合、血紅素結(jié)合。

2.4 鹽脅迫下白刺差異表達基因的 KEGG 分析

在生物體中，基于通路的分析有助于進一步了解基因的生物學(xué)功能和上下游基因的相互作用，深入理解基因與功能的關(guān)系。本文使用KEGG功能富集分析鹽脅迫處理7 d時比拉底白刺幼苗葉片的差異表達基因可能涉及的代謝通路，發(fā)現(xiàn)比拉底白刺響應(yīng)鹽脅迫的DEGs涉及到25條KEGG代謝通路（圖2），其中，碳水化合物代謝過程的差異基因最多，占14%，其次為運輸和分解代謝，占9%；蛋白質(zhì)折疊、分類、降解和其它次級代謝產(chǎn)物的生物合成均占7%，免疫應(yīng)答系統(tǒng)占6%，氨基酸代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分別占5%和4%。與鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)的環(huán)境適應(yīng)占2%（圖2）。KEGG分析可以從功能的角度聚焦到通路及基因，也可以從基因的角度鎖定功能和互作關(guān)系，直觀地顯示了比拉底白刺在鹽脅迫下差異表達基因的代謝過程和信號通路，有助于更好地研究比拉底白刺響應(yīng)鹽脅迫的分子機制。

圖 2 鹽脅迫下比拉底白刺葉片差異表達基因的KEGG通路分析Fig. 2 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes in the leaves of N. billardieri under salt stress

以校正后p-value＜0.05為篩選閾值，鹽脅迫7 d比拉底白刺葉片差異表達基因的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，有9條代謝途徑產(chǎn)生顯著變化（圖3），分別是苯丙烷類生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、托烷，哌啶和吡啶生物堿的生物合成、抗原加工和呈現(xiàn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、核苷酸切除修復(fù)、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、內(nèi)吞作用、嘌呤代謝（圖3）。以上9條代謝通路有助于獲得比拉底白刺在抵御鹽脅迫時的代謝信息，以便更清楚地理解其在鹽脅迫應(yīng)答中的過程。

2.5 鹽脅迫下白刺差異表達基因的互作網(wǎng)絡(luò)

為了研究比拉底白刺幼苗是如何通過基因之間的相互作用來傳遞鹽脅迫信號，通過String數(shù)據(jù)庫和搜索軟件構(gòu)建了鹽應(yīng)答基因在細(xì)胞內(nèi)的互作網(wǎng)絡(luò)（圖4、表3）。在基因作用網(wǎng)絡(luò)中檢測到一組相互作用的基因簇，共包含32個基因（圖4）。組成相互作用網(wǎng)絡(luò)的這些基因主要與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原平衡、蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)折疊和組裝、蛋白質(zhì)降解、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、次級代謝、細(xì)胞拯救/防御等途徑相關(guān)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控和氧化還原平衡在基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著重要位置，它們可能在比拉底白刺幼苗響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)中起重要作用。此外，基因 comp71223_c0_seq1、基因 comp83599_c0_seq4和基因comp71691_c0_seq2，作為節(jié)點，占據(jù)了網(wǎng)絡(luò)的中心位置。

2.6 差異表達基因的 qRT-PCR 驗證

為了驗證RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機選擇7個差異表達基因，取對照和鹽脅迫7 d的比拉底白刺葉片進行qRT-PCR實驗。結(jié)果顯示：這7個基因在qRT-PCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析的趨勢一致（圖5），而在表達變幅倍數(shù)上有些許差異，可能是由于兩類實驗的檢測靈敏度及數(shù)據(jù)分析方法不同造成的。鹽脅迫處理前后，7個差異基因的表達特征與測序結(jié)果呈現(xiàn)相同的變化趨勢，驗證了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。

圖 3 鹽脅迫下比拉底白刺葉片差異表達基因的KEGG富集分析Fig. 3 KEGG Enrichment Analysis of differentially expressed genes in the leaves of N. billardieri under salt stress

圖 4 鹽脅迫誘導(dǎo)的差異表達基因相互作用網(wǎng)絡(luò).Fig. 4 The interaction network of differentially expressed genes induced by salt stress.

3 討論

本研究進行了多次預(yù)實驗，通過觀察鹽脅迫下植株的表型發(fā)現(xiàn)，鹽生植物比拉底白刺在7 d時開始出現(xiàn)葉片輕微卷曲的現(xiàn)象，之后開始逐漸萎蔫，到9 d時萎蔫癥狀較明顯。相對于非鹽生植物，鹽生植物能夠耐受一定強度的鹽脅迫環(huán)境一段時間，在一定鹽濃度范圍的土壤環(huán)境下正常生長[17-18]。為了研究比拉底白刺應(yīng)答鹽脅迫的分子機制，本實驗選擇在其表型性狀剛開始出現(xiàn)時進行取樣和轉(zhuǎn)錄組測序分析，以便更好地理解鹽生植物特有的耐鹽機制。

表 3 鹽脅迫誘導(dǎo)的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中差異表達基因的名稱及注釋Table 3 The name and annotation of differentially expressed genes responding to salt stress in gene interaction network analysis

圖 5 差異表達基因的qRT-PCR驗證Fig. 5 Verification of differently expressed genes using qRT-PCR

植物鹽脅迫是一個由多個基因參與表達調(diào)控的作用網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)錄組提供了基因的多樣性、表達水平差異以及時空變化，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的實用性和高效性可以促進植物響應(yīng)非生物逆境脅迫的分子機制研究[19-20]。本研究采用Illumina HiseqTM2000高通量測序技術(shù)對鹽脅迫7 d與未做處理的比拉底白刺幼苗葉片進行了轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得了168 463條unigenes，與七大數(shù)據(jù)庫的注釋率達60.0%，注釋結(jié)果較好，大部分基因功能得到注釋，與泡泡刺（N. sphaerocarpa）的注釋率（62.1%）接近[21]。剩余67 447條（40.0%）unigenes未得到注釋，可能是比拉底白刺中的新基因。

植物中各類轉(zhuǎn)錄因子對于調(diào)控各種誘導(dǎo)型基因的表達以及植物生長發(fā)育、適應(yīng)環(huán)境等起主要作用[22]。該研究篩選出的差異基因中涉及到了WRKY轉(zhuǎn)錄因子（comp85183_c0_seq4、comp85183_c0_seq10、comp74597_c0_seq1）、乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子（comp82253_c0_seq3）、NAC轉(zhuǎn)錄因子（comp-69459_c1_seq1）、GATA轉(zhuǎn)錄因子（comp74878_c0_seq4）、發(fā)病機制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（comp83152_c0_seq5），這些unigenes在鹽脅迫下均有顯著響應(yīng)，其中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，研究表明能夠參與損傷、衰老、發(fā)育、抗病等抗逆反應(yīng)[23]。乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子（ERF）家族屬于AP2/ERF超轉(zhuǎn)錄因子家族，具有保守的一個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，在植物生長發(fā)育、環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)（干旱、低溫、高鹽、病蟲害等脅迫）中具有重要作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)的幾個轉(zhuǎn)錄因子需要進一步挖掘其功能，以期為探究比拉底白刺的耐鹽機理作出貢獻。

通過鹽脅迫誘導(dǎo)的差異表達基因GO分析結(jié)果可見，鹽脅迫主要引起了比拉底白刺葉片內(nèi)與代謝過程、環(huán)境刺激應(yīng)答、防御反應(yīng)等有關(guān)的生物學(xué)過程變化，以及與催化活性、結(jié)合活性、轉(zhuǎn)運活性和抗氧化活性有關(guān)的分子功能的變化，這與比拉底白刺在蛋白質(zhì)水平上對鹽脅迫的應(yīng)答模式有些類似[14]。初步表明，比拉底白刺在受到低鹽脅迫時，可能通過合成或者降解一些蛋白酶類，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和含量，以抵抗低鹽逆境。

從比拉底白刺幼苗葉片差異表達基因參與的代謝途徑可見，鹽脅迫主要引起了白刺幼苗葉片內(nèi)與碳水化合物、氨基酸代謝相關(guān)的基因表達發(fā)生變化，同時也誘導(dǎo)了與蛋白質(zhì)折疊、分類和降解相關(guān)的基因表達發(fā)生改變，這可能與鹽脅迫導(dǎo)致了幼苗葉片內(nèi)一些蛋白質(zhì)代謝變化相關(guān)[4,14]。比拉底白刺幼苗葉片在受到低鹽逆境脅迫時，氨基酸和核苷酸糖代謝途徑有顯著富集，可能其光合作用也受到一定影響，碳水化合物代謝活躍，推測其可能通過減少物質(zhì)合成，控制能量代謝來抵抗低鹽環(huán)境[25]。由鹽脅迫引起的植株葉片表型的輕微變化可能是由于差異表達基因所參與的代謝途徑的改變引起的，正是由于植株體內(nèi)代謝途徑的改變引起了諸如光合作用、質(zhì)膜滲透力等生理現(xiàn)象的變化，進而導(dǎo)致表型的變化[4,14]。

將比拉底白刺幼苗葉片響應(yīng)鹽應(yīng)答差異基因在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)，作為網(wǎng)絡(luò)中的“hubs”（連接到許多其他的蛋白質(zhì)）和“bottlenecks”（在一個網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵連接器），如基因comp71223_c0_seq1注釋為熱激同源蛋白（Heat shock cognate 70 kDa protein），基因 comp83599_c0_seq4注釋為L型凝集素域受體激酶（L-type lectin-domain containing receptor kinase IV.1），和基因comp71691_c0_seq2注釋為Win類蛋白（Win-like protein），它們占據(jù)了網(wǎng)絡(luò)的中心位置，可能在白刺幼苗葉片對鹽脅迫處理的響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。因此，通過基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析可以初步了解這些基因在比拉底白刺響應(yīng)鹽脅迫過程中起的作用，互作關(guān)系有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過對鹽脅迫 7 d 與未處理的比拉底白刺葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序及相關(guān)生物信息學(xué)分析，共獲得168 463條 unigenes ，篩選到196條差異表達基因。通過GO 功能和 KEGG 通路分析，理清了差異表達基因富集的分子功能與代謝通路。此外，進一步構(gòu)建了差異基因互作網(wǎng)絡(luò)，得到了重要的節(jié)點基因。綜上所述，本研究為挖掘和找尋重要耐鹽候選基因提供了參考，同時為研究比拉底白刺響應(yīng)鹽脅迫的分子機制，以及為下一步培育比拉底白刺耐鹽新品種奠定了基礎(chǔ)。