張運峰，馬超穎，胡 芬，陳 超

（1. 唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000；2. 華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210）

細胞骨架由微管、微絲以及中間絲組成，是真核細胞的重要結(jié)構(gòu)組分，參與了細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、細胞器的定位和細胞分裂等許多重要的細胞生命活動。細胞骨架的發(fā)現(xiàn)在細胞生物學(xué)發(fā)展歷程上具有里程碑式的意義[1]，早已成為生命科學(xué)研究的熱點。細胞骨架的觀察實驗是細胞生物學(xué)本科實驗教學(xué)中開出率最高的項目之一[2]，可以幫助學(xué)生深刻理解細胞活動的復(fù)雜性，還可以提高他們深入探索細胞奧秘的興趣[2]。傳統(tǒng)的本科細胞骨架教學(xué)實驗一般是以洋蔥表皮細胞為實驗材料，采用考馬斯亮藍對細胞骨架染色后用普通的光學(xué)顯微鏡觀察。由于考馬斯亮藍染料能對所有的蛋白著色，并不具有針對細胞骨架染色的特異性[3-4]，因此導(dǎo)致學(xué)生實驗中難以分辨清楚洋蔥內(nèi)表皮細胞中的微絲結(jié)構(gòu)。

免疫熒光試驗是用特異性抗體與標(biāo)本中相應(yīng)抗原反應(yīng)后，再用熒光素標(biāo)記的第二抗體（抗抗體）與之結(jié)合，然后在熒光顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。該法具有特異性強、可操作性和重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定、受環(huán)境因素影響小等優(yōu)點，在科研中被廣泛應(yīng)用[5]。我們嘗試將這一技術(shù)引入到骨架細胞觀察實驗教學(xué)中，取得了較好教學(xué)效果

1 材料

1.1 細胞株

Hela 細胞，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2；1640培養(yǎng)基，含10%小牛血清及1%雙抗。

1.2 主要試劑和儀器

細胞固定液、PBS 緩沖液、TritonX-100、抗熒光淬滅封片劑，均購自索萊寶生物技術(shù)公司；鼠抗人的單克隆抗體和FITC 標(biāo)記的羊抗鼠的熒光二抗，均購自Sigma 公司。

細胞成像系統(tǒng)（Thermofisher，EVOS FL），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermofisher，4111）。

2 方法

2.1 細胞的培養(yǎng)

實驗前一天，選擇生長狀態(tài)良好的Hela 細胞，經(jīng)過胰酶消化、細胞計數(shù)板計數(shù)和全培養(yǎng)基稀釋，獲得1×104/ml 的細胞懸液。按照200 μL/孔的標(biāo)準(zhǔn)，接種細胞于48 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。

2.2 細胞的固定、通透和封閉

（1）洗滌：取出細胞，用500 μL/孔的PBS緩沖液洗滌2 次，每次10 min。

（2）固定：200 μL/孔的多聚甲醛進行細胞固定，室溫靜置20 min。

（3）通透：0.3%PBS-TritonX-100 200 μL/孔，室溫靜置5 min。

（4）洗滌：去掉PBS-TritonX-100 處理液，500 μL/孔PBS 緩沖液洗滌2 次，每次10 min。

（5）封閉：吸去PBS 緩沖液，加入100 μL/孔1%PBS-BSA 封閉液，37 ℃，30 min。

2.3 抗體的標(biāo)記和DAPI 染色

將封閉液去掉，滴加100 μL 一抗稀釋液，37 ℃孵育30 min，用PBS 緩沖液洗滌3 次，每次3 min；滴加100 μL FITC 標(biāo)記熒光二抗，37 ℃孵育20 min，PBS 洗滌1 次，5 min；滴加100 μL的抗熒光淬滅劑。

2.4 細胞的熒光觀察

使用屏幕式倒置熒光顯微鏡觀察細胞骨架。

3 影響實驗效果的因素分析

免疫熒光技術(shù)應(yīng)用到細胞骨架觀察實驗教學(xué)中，是一種新的嘗試。經(jīng)過大量實驗，發(fā)現(xiàn)實驗材料的選取、細胞融合度的選擇、細胞爬片的選擇、觀察裝置的選擇、教學(xué)組織形式的選擇等因素對實驗教學(xué)效果影響較大。

3.1 實驗材料的選取

選取生長較快、易于培養(yǎng)的細胞系，實驗成功率更高。

3.2 細胞融合度的選擇

細胞的密度控制在50%～80%，能取得最佳效果，過高的融合度會形成很強的干擾效應(yīng)，降低熒光成像清晰度。

3.3 細胞爬片的選擇

實驗沒有采用傳統(tǒng)的細胞爬片[6,7]，而是改進為48 孔板接種，這不僅簡化了實驗準(zhǔn)備步驟，降低實驗過程的難度，利于學(xué)生的操作，同時也增強了指導(dǎo)教師對學(xué)生的操作過程掌控，保證了教學(xué)的效果。

3.4 觀察裝置的選擇

選擇屏幕式倒置顯微鏡或者帶顯微照相系統(tǒng)的熒光顯微鏡進行觀察，實時呈現(xiàn)并記錄保存實驗結(jié)果。圖像的即時呈現(xiàn)有利于學(xué)生初步了解和分析實驗結(jié)果，及時保則便于多組間的結(jié)果比較，并減少熒光淬滅現(xiàn)象對實驗結(jié)果細節(jié)的影響。

3.5 教學(xué)組織形式的選擇

熒光顯微鏡數(shù)量是免疫熒光實驗教學(xué)效果的一個制約因素。采用分組實驗的模式，通過優(yōu)化實驗步驟，使分組數(shù)量和小組各步驟間隔時間相適應(yīng)；再通過合理延長個別步驟的時間，可以使各組按序進行，避免不同組重疊交叉，保證教學(xué)組織有序、迅捷。

4 結(jié)果與討論

FITC 標(biāo)記的細胞骨架經(jīng)藍光激發(fā)后，綠色熒光覆蓋了整個細胞，絲狀骨架結(jié)構(gòu)明顯（圖1）。在細胞的中心位置有一個熒光強度較弱的近圓形區(qū)域暗區(qū)，推測其為細胞核；熒光由其向四周延展，充滿整個細胞，且越靠近該區(qū)域，熒光的強度越強，骨架纖維越明顯。實驗的熒光圖像結(jié)果與細胞骨架在細胞中實際分布高度一致，確定了本實驗的準(zhǔn)確性。當(dāng)學(xué)生熟悉這一技術(shù)的操作后，可以讓學(xué)生探索溫度、抗體結(jié)合時間、抗體濃度等因素對實驗結(jié)果的影響。有條件的實驗室也可開展用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色觀察微絲、采用多色免疫熒光分別標(biāo)記不同細胞骨架，使實驗結(jié)果更豐富、有趣。

圖1 Hela 細胞骨架的間接免疫熒光觀察