侯孟典，宋仁德，王 會，柴志欣，楊玉文，尕才仁，汪永洲，信金偉，鐘金城*

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.青海省玉樹州畜牧獸醫(yī)工作站，青海 玉樹 815099；3.青海省玉樹曲麻萊縣畜牧獸醫(yī)工作站，青海 曲麻萊 815500；4.青海省玉樹雜多縣畜牧獸醫(yī)工作站，青海 雜多 815300；5.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850009)

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原特有的家畜品種，是我國重要的牛種資源，現(xiàn)已成為青藏高原地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的獨(dú)立板塊[1]。玉樹牦牛主要分布在海拔3 700 m以上的高寒地區(qū)，具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力[2]。經(jīng)過長時(shí)間的自然選擇，牦牛在形態(tài)、生理特性上已經(jīng)獲得穩(wěn)定的遺傳特征[3]。

線粒體DNA具有不易發(fā)生重組、母系遺傳、變異速度快等特點(diǎn)，因此被廣泛用于種群內(nèi)或是種群間的遺傳變異、遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等研究[4-6]。線粒體DNA D-環(huán)控制區(qū)(D-Loop)，其進(jìn)化速度比線粒體快10倍左右[7]。D-Loop區(qū)是線粒體DNA基因組中進(jìn)化速率最快、最具遺傳突變區(qū)的序列區(qū)域，由于自然選擇等原因會存在巨大的變異，是目前常用的一種遺傳標(biāo)記方法[8-9]。

宋喬喬等[10]對西藏牦牛mtDNA D-Loop區(qū)序列多樣性分析表明，西藏牦牛群體中的錯(cuò)那牦牛是比較純的牦牛類群，日多牦牛、類烏齊牦牛、丁青牦牛、隆子牦牛、仲巴牦牛、聶榮牦牛、申扎牦牛等牦牛類群在進(jìn)化過程中可能出現(xiàn)基因相互交流的情況；張成福等[11]研究發(fā)現(xiàn)，西藏牦?？赡艽嬖趦蓚€(gè)母系起源；李瑞哲等[12]發(fā)現(xiàn)了青海雪多牦牛19種單倍型，可分為兩個(gè)分支，推測雪多牦牛有兩個(gè)母系起源；馬志杰等[13]對野牦牛和中甸牦牛的D-Loop區(qū)分析，表明野牦牛具有豐富的遺傳多樣性；涂世英等[14]在中甸牦牛的研究中，以羊?yàn)橥鈱賹?2個(gè)牛種進(jìn)行對比分析，推測中甸牦?？赡芘c麥洼牦牛因地理位置相近而存在基因交流。

前人對于各個(gè)類群生物的mtDNA D-Loop區(qū)序列的遺傳多樣性都有相應(yīng)的研究[15-25]，但對玉樹高原牦牛和類烏齊牦牛、斯布牦牛、申扎牦牛、帕里牦牛mtDNA D-Loop的比較研究還未見報(bào)道。本研究對玉樹牦牛的遺傳多樣性進(jìn)行探究，為玉樹牦牛遺傳資源的保護(hù)和利用研究奠定分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

共采集216頭成年健康牦牛耳組織樣品，其中青海省玉樹州玉樹牦牛64頭、西藏自治區(qū)申扎縣申扎牦牛36頭、西藏自治區(qū)拉薩市斯布牦牛39頭、西藏自治區(qū)日喀則亞東縣帕里牦牛30頭、西藏自治區(qū)類烏齊縣類烏齊牦牛47頭。組織于75%乙醇中保存帶回實(shí)驗(yàn)室，放置在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提取試劑盒與DNA純化回收試劑盒均購于天根生化科技有限公司(北京)；DNA聚合酶及dNTPs購于Thermo Fisher Scientific公司(上海)；2000 bp marker購于TaKaRa公司(大連)。

1.2 基因組DNA的提取及檢測

使用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取各類群牦牛耳樣的基因組DNA。提取產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測其質(zhì)量和濃度。置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)及mtDNA D-Loop區(qū)序列的擴(kuò)增

參照NCBI中已發(fā)布的牦牛mtDNA D-Loop區(qū)序列(AY：684273)，使用Premier 5軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的上、下游引物。引物序列為F：5'CTACAGTCTCACCGTCAACC'3，R：5'GGGGTGTAGATGCTTGC'3，由上海賽默飛公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系25 L。其中滅菌ddH2O加入9.5 L、DNA模板加入1 L、上下游引物各加入1 L、2×long Taq聚合酶12. 5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；58.5 ℃復(fù)性1 min；72 ℃延伸1 min；共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸5 min，16 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段長度，粗略檢測是否為目的條帶。確認(rèn)為目的條帶的產(chǎn)物，經(jīng)過膠回收試劑盒回收純化后，由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司(成都)測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

從NCBI中下載的牦牛mtDNA D-Loop區(qū)全序列，用BioEdit ClustalW Multiple alignment功能和DNAMAN對比分析D-Loop區(qū)與NCBI中發(fā)布的牦牛mtDNA D-Loop 區(qū)的差異，并輔以人工校對保證結(jié)果的可靠性及準(zhǔn)確性。采用MEGA5.2軟件統(tǒng)計(jì)mtDNA D-Loop區(qū)的堿基組成。使用DnaSPv5軟件統(tǒng)計(jì)和計(jì)算序列中的單倍型數(shù)目(number of haplotypes，h)、單倍型多樣度(haplotypediversity，Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(Average number of nucleotide differences，k)等群體遺傳學(xué)指標(biāo)，并做Tajima'sD中性顯著性檢驗(yàn)。運(yùn)用MEGA 5.2軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ) 功能對所有序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)群體牦牛mtDNA D-Loop區(qū)擴(kuò)增結(jié)果分析

根據(jù)NCBI中牦牛mtDNA D-Loop區(qū)序列(AY：684273)，設(shè)計(jì)PCR引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢，擴(kuò)增目的片段大小約為1 000 bp(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明擴(kuò)增成功可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 玉樹牦牛與其余四個(gè)牦牛群體mtDNA D-Loop區(qū)序列遺傳多樣性分析

2.2.1 mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸組成及變異 本實(shí)驗(yàn)對玉樹牦牛和其他4個(gè)牦牛群體216個(gè)個(gè)體的D-Loop區(qū)序列進(jìn)行分析。測得mtDNA D-Loop區(qū)長度為945 bp，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)四種核苷酸中A+T的平均比例為60.295% (60.163%～60.373%)，C+G的平均含量為39.705%(39.627%～39.837%)。其中玉樹牦牛四種核苷酸比例中平均A+T含量為60.372%， C+G含量為39.627%；類烏齊牦牛A+T含量為60.350%，C+G為39.650%；帕里牦牛A+T含量為60.267%，C+G含量為39.733%；申扎牦牛A+T含量為60.325%，C+G為39.675%；斯布牦牛A+T含量為60.163%，C+G為39.837%。表明5種牦牛mtDNA D-Loop區(qū)富含A、T堿基，具有一定的A/T堿基偏好性。

以牦牛線粒體D-loop(GenBank: AY374125.1)全序列為標(biāo)準(zhǔn)，分析216個(gè)個(gè)體D-Loop區(qū)，共發(fā)現(xiàn)序列中堿基的插入、缺失、顛換和轉(zhuǎn)換4種變異位點(diǎn)共127處(圖2)。玉樹牦牛序列中共存在變異位點(diǎn)74個(gè)，占所有序列總變異位點(diǎn)的34%。所有變異位點(diǎn)主要集中在135～390 bp和695～820 bp處，位于序列的兩端位置，在539～693 bp區(qū)間沒有變異位點(diǎn)存在。排除所有變異位點(diǎn)中的36個(gè)插入和缺失位點(diǎn)，剩下轉(zhuǎn)換和顛換位點(diǎn)共91個(gè)，這91個(gè)位點(diǎn)中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)有63個(gè)，主要存在于135～390 bp處；顛換位點(diǎn)28個(gè)，其中25個(gè)位點(diǎn)主要集中在755～850 bp區(qū)間；顛換位點(diǎn)中A?T之間的轉(zhuǎn)換15次，占顛換總數(shù)的53.57%；A?C之間的轉(zhuǎn)換7次，占25.00%；G?C之間的轉(zhuǎn)換5次，占17.86%；G?T之間的轉(zhuǎn)換1次，占3.57%。

2.2.2 mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸單倍型及其多樣性 使用DnaSPv5軟件對5個(gè)牦牛群體216個(gè)個(gè)體的單倍型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共發(fā)現(xiàn)單倍型71個(gè)，單倍型多樣度(Hd)為0.909±0.016，核苷酸多樣性(pi)為0.082。各類群分別的單倍型數(shù)、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(K)見表1。

表1 5個(gè)牦牛群體的mtDNA D-Loop區(qū)序列單倍型數(shù)(h)、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異數(shù)(K)Table 1 mtDNA D-Loop region sequence haplotype, haplotype diversity, nucleotidediversity and average nucleotide difference in 5 yak populations

由表1可知，玉樹牦牛具有最多的單倍型數(shù)。5個(gè)牦牛群體的單倍型多樣度(Hd)在0.885～0.956之間，核苷酸多樣性(Pi)在0.0134～0.1993之間，平均核苷酸差異數(shù)(K)在12.682～164.809之間。結(jié)果表明，各群體內(nèi)個(gè)體間平均核苷酸差異數(shù)和核苷酸多樣度呈正比例關(guān)系。各群體具有豐富的單倍型數(shù)目，玉樹牦牛單倍型多樣度、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)均最低，申扎牦牛單倍型多樣度、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)均最高，說明其品種遺傳一致性較高。

5個(gè)牦牛群體的Tajima's D檢驗(yàn)見表2。表2表明玉樹牦牛(P<0.05)Tajima's D檢驗(yàn)差異顯著，說明玉樹牦牛不遵循中性進(jìn)化，可能是自然選擇導(dǎo)致群體擴(kuò)增的結(jié)果。類烏齊牦牛、申扎牦牛、帕里牦牛和斯布牦牛Tajima's D檢驗(yàn)(P>0.1)差異不顯著，說明這4個(gè)牦牛群體符合中性進(jìn)化。

表2 5個(gè)牦牛群體的Tajima's D檢驗(yàn)Table 2 Tajima's D test of 5 yak populations

2.3 牦牛群體D-Loop區(qū)序列的遺傳距離和系統(tǒng)進(jìn)化分析

由表3可見，玉樹牦牛與類烏齊牦牛和帕里牦牛的遺傳距離較近(0.023、0.018)，申扎牦牛與斯布牦牛的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.533)。

系統(tǒng)發(fā)育樹也稱為系統(tǒng)進(jìn)化樹，是一種用類似于樹木分支樣的圖，用于表示物種之間的親緣關(guān)系，進(jìn)而可以用來推測物種的進(jìn)化歷史。核苷酸序列、蛋白序列等是構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的主要依據(jù)[26]。利用MEGA 5. 2 軟件中的鄰接法( Neighbor-Joining，NJ) 對5個(gè)群體的216個(gè)個(gè)體的mtDNA D-Loop區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，并做自舉分析( Boot strap test) 1 000 次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)系統(tǒng)樹各分支的置信度。從圖3中可以看出這216個(gè)個(gè)體主要有兩個(gè)分支，斯布牦牛和申扎牦牛的14個(gè)個(gè)體為單獨(dú)一支，其他個(gè)體為一支。

表3 5個(gè)牦牛群體mtDNA D-Loop區(qū)序列Kimura 雙參數(shù)遺傳距離Table 3 Kimura two-parameter genetic distance of mtDNA D-Loop region sequence of 5 yak populations

圖4五個(gè)牦牛群體mtDNAD-Loop區(qū)序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.3 mtDNA D-Loop region sequence NJ phylogenetic tree
of five yak populations

3 討 論

3.1 牦牛mtDNA D-Loop區(qū)序列核苷酸變異特征

本研究測定了216個(gè)牦牛個(gè)體的mtDNA D-Loop區(qū)序列，測得序列長度為945 bp，其中四種核苷酸A+T的含量為60.295% (60.163%～60.373%)，C+G含量為39.705%(39.627%～39.837%)，5個(gè)牦牛群體的核苷酸含量相差不大。王彥環(huán)等[27]、宋喬喬等[10]及張成福等[11]分別對夏南牛和西藏牦牛mtDNA D-Loop區(qū)中堿基含量進(jìn)行分析，表明夏南牛與西藏牦牛A+T含量在60.9%～62%，與本研究的結(jié)果基本一致，均符合動物mtDNA中A/T含量偏高的特性。

對216個(gè)序列分析后共發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)127個(gè)，占總分析位點(diǎn)的13.44%，玉樹牦牛共發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)74個(gè)，所有的變異位點(diǎn)都集中在序列的兩端，因此推測兩端序列為主要高變區(qū)域。顛換、轉(zhuǎn)換、缺失、插入4種變異類型都存在，其中以轉(zhuǎn)換為主與王彥環(huán)等[27]的研究結(jié)果相一致。變異位點(diǎn)中既有顛換又有轉(zhuǎn)換的位點(diǎn)，顛換位點(diǎn)中A/T顛換占顛換總數(shù)的53.57%，與張成福等[11]對西藏牦牛的研究表明A/T顛換為主的結(jié)果基本一致，推測玉樹牦牛mtDNA D-Loop區(qū)存在較多突變可能與該地區(qū)特殊的環(huán)境有關(guān)。

3.2 玉樹牦牛與另外4個(gè)牦牛的遺傳多樣性

mtDNA具有高變的特征[28]，D-Loop進(jìn)化速度比線粒體快10倍左右，符合中性進(jìn)化等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于動物遺傳多樣性的研究。分析結(jié)果表明216個(gè)個(gè)體共存在71個(gè)單倍型，其中玉樹牦牛就存在27個(gè)單倍型，與涂正超等[29]用酶切的方法分析了5個(gè)牦牛群體90個(gè)個(gè)體的mtDNA D-Loop區(qū)表明牦牛mtDNA D-Loop區(qū)缺少多樣性的結(jié)果存在差異，可能是由于試驗(yàn)方法及樣本量不同所造成。

單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異數(shù)(K)是衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo)。賴松家等[30]研究表明麥洼牦牛的平均核苷酸差異數(shù)最大(19)，核苷酸多樣度為0.02132，犏牛的平均核苷酸差異數(shù)最小為3.0，核苷酸多樣度為0.00336。郭松長等[31]研究發(fā)現(xiàn)，青海環(huán)湖牦牛的單倍型多樣性最高(0.9848) ，巴州牦牛最低(0.8000)。這些牦牛遺傳多樣性均高于本研究中牦牛群體，而本研究中玉樹牦牛單倍型多樣度、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)均最低(Hd為0.885、Pi為0.0134、K為11.837)，但是單倍型數(shù)最高，說明玉樹牦牛群體可能經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)，雖然生存在惡劣的生態(tài)環(huán)境中，但是由于人工選擇等原因使遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大改變。通過Tajina's D檢驗(yàn)結(jié)果可知玉樹牦牛中性檢驗(yàn)顯著，其余四個(gè)群體均為不顯著，表明申扎牦牛、類烏齊牦牛、斯布牦牛和帕里牦牛符合中性進(jìn)化，玉樹牦?？赡苡捎谧匀贿x擇等原因出現(xiàn)過群體擴(kuò)張。

3.3 玉樹牦牛與另外4個(gè)牦牛的遺傳分化

根據(jù)Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算群體遺傳距離和NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知，玉樹牦牛、類烏齊牦牛、帕里牦牛、申扎牦牛和斯布牦?？梢苑譃閮蓚€(gè)大的分支。遺傳距離分析結(jié)果可知玉樹牦牛與申扎牦牛和斯布牦牛的遺傳距離最遠(yuǎn)。玉樹牦牛、類烏齊牦牛、帕里牦牛、申扎牦牛和斯布牦牛均屬于西藏牦牛，13個(gè)申扎牦牛和斯布牦牛單獨(dú)分為一支，其他個(gè)體和玉樹牦牛分為一支，這與遺傳距離分析的結(jié)果一致。說明申扎牦牛和斯布牦?？赡苡袃蓚€(gè)母系遺傳起源，與宋喬喬等[10]將西藏8個(gè)牦牛群體分為兩大類的研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

本研究用mtDNA D-Loop區(qū)分子標(biāo)記方法分析玉樹牦牛與4個(gè)西藏牦牛群體D-Loop區(qū)序列，表明這5個(gè)牦牛群體具有豐富的遺傳性，玉樹牦牛與類烏齊牦牛和帕里牦牛的遺傳距離最近，與斯布牦牛和申扎牦牛的遺傳距離相對較遠(yuǎn)。5個(gè)牦牛類群個(gè)體可以分為兩個(gè)分支。