李婧慧，李淑琴，朱波，曹陽(yáng)，金彥龍，喬艷清，張新宇，孫杰，薛飛*

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832003；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第五師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆雙河833408 ）

天然彩色棉是1 種在吐絮時(shí)期棉纖維便帶有綠色、棕色等顏色的棉花。 我國(guó)是世界上最大的天然彩色棉生產(chǎn)國(guó)[1-2]，新疆是世界上種植彩色棉面積最大的地區(qū)，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%左右，約占國(guó)內(nèi)彩色棉總產(chǎn)量的95%[3-4]。 近年來(lái)，環(huán)境污染問(wèn)題和可持續(xù)發(fā)展備受關(guān)注，未受漂白劑、染料腐蝕，綠色健康的天然彩色棉，在透氣性、吸汗性、抗靜電等方面的優(yōu)勢(shì)，受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[5-6]。 市場(chǎng)對(duì)天然彩色棉需求量持續(xù)增加，然而一些不法商販為追求高額利潤(rùn)，用白色棉冒充彩色棉，造成天然彩色棉市場(chǎng)魚目混珠，影響消費(fèi)者切身利益，侵犯育種者品種權(quán)[7]。 因此，建立1 套可靠性高、可操作性強(qiáng)的品種鑒定體系，有益于保障彩色棉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

目前，構(gòu)建品種DNA 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)記主要是 SSR（Simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列）和SNP（Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）[8]。 部分主要農(nóng)作物的DNA 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)已逐步建立標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范[9]，如小麥[10]、水稻[11]、玉米[12]、棉花[13]、大豆[14]、煙草[15]。 關(guān)于棉花 DNA 指紋圖譜構(gòu)建也開(kāi)展了大量工作[9,16-17]，許鴻越等[18]依據(jù)農(nóng)藝性狀和SSR 分子標(biāo)記對(duì)137 份陸地棉、13 份海島棉以及27 份亞洲棉等多種纖維色澤的種質(zhì)資源進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)栽培種中天然彩色棉種質(zhì)遺傳多樣性十分豐富。 馬軒等[19]利用SSR 分子標(biāo)記構(gòu)建18個(gè)彩色棉品系DNA 指紋圖譜，結(jié)果顯示，彩色棉具有相對(duì)狹窄的遺傳背景。 尤春源等[1]利用SSR 核心引物對(duì)2012 年前新疆審定的新彩棉品種構(gòu)建DNA 指紋圖譜并進(jìn)行遺傳多樣性分析，區(qū)分全部品種需要18 對(duì)特異引物及組合引物。Wang 等[20]認(rèn)為標(biāo)記NAU3735 和標(biāo)記NAU5434 分別與棕色纖維基因位點(diǎn)Lc1和Lc2共分離，2015 年篩選獲得2個(gè)棕色棉纖維色澤決定QTL （Quantitative trait locus，數(shù)量性狀位點(diǎn)） 位點(diǎn) （命名為qFC15-1 和qFC15-2）[21]。 Wen 等[22]將棕色棉纖維Lc1相關(guān)的qBFA07-1 和qBFA07-2 兩個(gè)基因位點(diǎn)的候選基因分別確定為Gh_A07G2341 和Gh_A07G0100，基于該位點(diǎn)的功能標(biāo)記將有助于棕色棉的分子檢測(cè)和分子育種。 為進(jìn)一步完善新疆彩色棉花品種DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，推動(dòng)彩棉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，本研究利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了27 個(gè)新彩棉系列品種DNA 指紋圖譜，為彩棉分子檢測(cè)和分子育種提供實(shí)用標(biāo)記和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料和SSR核心引物

以新疆審定的27 份彩色棉品種的種子為供試材料，由石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國(guó)彩棉（集團(tuán)）股份有限公司、新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所、石河子大學(xué)棉花所提供，包括新彩棉1 號(hào)至8 號(hào)，10 號(hào)至28號(hào)（表1）。 PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）所用試劑及電泳試劑均購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 棉花基因組DNA提取及檢測(cè)

采用改良SDS 法[23]提取各材料的種子基因組DNA。 使用ND-1000 和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，將 DNA 稀釋至 100～200 mg·L－1。

表1 27 個(gè)新疆彩色棉品種信息

表1（續(xù)）

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR 反應(yīng)體系（20 μL）包括 10 μmol·L－1正、反向引物各 1 μL，10×Taq buffer （含有 Mg2＋）2.0 μL，2.5 mM dNTPs 1.6 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL（5×106U·L－1），模板 DNA 2.0 μL，ddH2O 12.2 μL。 PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃（以引物的Tm 值為依據(jù)變換）退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，循環(huán) 33 次；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳―銀染法進(jìn)行檢測(cè)[9]，上樣量為 3～5 μL，在150 V 恒壓下電泳110～130 min（根據(jù)室內(nèi)溫度和引物擴(kuò)增片段大小的不同更改）。 固定、銀染、顯色后終止反應(yīng)[24]，放在凝膠觀察燈上拍照統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)整理與分析

依照同一引物在27 個(gè)品種基因組DNA 擴(kuò)增帶型依次編號(hào)（1―10），統(tǒng)計(jì)分子標(biāo)記SSR 多態(tài)性帶型和所代表的等位位點(diǎn)個(gè)數(shù)[25]；根據(jù)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳的相對(duì)遷移位置，對(duì)條帶分布情況進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[26]，采用“0、1”計(jì)帶方法[27]記錄，即在凝膠的同一條帶上，有帶記為1、無(wú)帶記為0，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

根據(jù)每對(duì)引物在供試材料中擴(kuò)增帶型及數(shù)量的不同，計(jì)算分子標(biāo)記多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC）值，PIC=1－∑（Pi）2，其中Pi 指某一標(biāo)記第i 個(gè)擴(kuò)增帶型產(chǎn)生的頻率，∑（Pi）2為此標(biāo)記所有多態(tài)性帶型的（Pi）2之和[26,28]。利用NTDYS 2.1 軟件中的Similarity 模塊計(jì)算品種間遺傳相似系數(shù)，采用未加權(quán)平均數(shù)（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）[9]和主坐標(biāo)分析（Principal coordinates analysis，PCoA）[29]分別繪制樹(shù)狀聚類圖和二維散點(diǎn)圖進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性引物篩選及多態(tài)性帶型分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的SSR 核心引物和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的功能標(biāo)記[22]，從棉花生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.cottongen.org/）和棉花功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cottonfgd.org/）中查找引物序列，由華大基因科技股份有限公司合成，根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近選取部分新彩系列棉花品種用于引物初步篩選，最終篩選出條帶簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的52 對(duì)多態(tài)性引物（表2），對(duì)供試材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，構(gòu)建新疆彩色棉品種指紋圖譜。

52 對(duì)多態(tài)性引物在27 份材料中擴(kuò)增得到155個(gè)擴(kuò)增帶型，平均每對(duì)引物2.98 個(gè)，變化范圍為2～7 個(gè)。 其中，大于平均值的多態(tài)性引物有27 個(gè)。其中，SSR225 擴(kuò)增出 7 種帶型，帶型數(shù)最多 （圖1），表示該位點(diǎn)變異頻率最高，遺傳多樣性豐富。DPL0111 有 6 種 帶 型 ，NAU2277、W01、okra-195、DPL0757 和 HAU2786 有 5 種擴(kuò)增帶型。 核心引物PIC 值介于 0.137 1～0.776 4 之間（表2），平均值為0.454 3，其中PIC 大于平均數(shù)的引物有26 個(gè)，平均值達(dá)0.557 6，引物編號(hào)依次為1―26，表明這些引物鑒別能力較強(qiáng)。擴(kuò)增帶型數(shù)和多態(tài)性信息含量皆大于平均數(shù)的核心引物有18 對(duì)，如引物SSR225的PIC 值和多態(tài)性帶型個(gè)數(shù)分別為0.776 4 和7（表1 和圖1A），進(jìn)一步證實(shí)這些分子標(biāo)記具備較高的鑒別能力，適合用于新彩棉系列品種鑒定、指紋圖譜的構(gòu)建、純度真實(shí)性檢測(cè)及遺傳多樣性分析等相關(guān)研究。

表2 52 對(duì)核心引物信息

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

2.2 新彩系列棉花品種指紋圖譜分析

圖1 引物SSR225、W01 在27 個(gè)彩棉品種中的電泳擴(kuò)增圖

采用52 對(duì)多態(tài)性引物對(duì)27 個(gè)新彩棉系列品種進(jìn)行DNA 指紋圖譜分析。根據(jù)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶顯示，其中12 個(gè)新彩棉品種存在特征引物（表3）。 具有特征引物的品種，因其具有明顯區(qū)別于其他品種特有指紋信息的引物[9]，僅用特征引物即可將該品種與其他26 個(gè)新彩棉系列品種區(qū)分開(kāi)。 結(jié)果顯示，新彩棉1 號(hào)、新彩棉5 號(hào)、新彩棉10號(hào)、新彩棉13 號(hào)和新彩棉17 號(hào)分別具有1 對(duì)特征引物，新彩棉7 號(hào)、新彩棉16 號(hào)、新彩棉27 號(hào)和新彩棉28 號(hào)分別具有2 對(duì)特征引物，新彩棉8 號(hào)具有3 對(duì)引物，新彩棉4 號(hào)具有5 對(duì)特征引物，新彩棉22 號(hào)具有9 對(duì)特征引物。 圖1A 為分子標(biāo)記SSR225 在27 個(gè)材料中的電泳擴(kuò)增圖，其多態(tài)性信息含量PIC 值為0.78，有7 種多態(tài)性帶型，可以一次性鑒別出新彩棉8 號(hào)和新彩棉22 號(hào)。 圖1B 所示是核心引物W01 電泳擴(kuò)增圖，多態(tài)性帶型有5種，可鑒定出新彩棉8 號(hào)和新彩棉27 號(hào)。

其他15 份新彩棉材料無(wú)特征引物，需要使用多對(duì)引物進(jìn)行鑒別，表4 給出了這15 個(gè)品種鑒定所需的最少引物組合。以鑒定新彩棉2 號(hào)為例，第一步利用分子標(biāo)記NAU1167，根據(jù)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)帶型結(jié)果，將新彩棉1 號(hào)、新彩棉2 號(hào)、新彩棉6 號(hào)、新彩棉 15 號(hào)、新彩棉 19 號(hào)、新彩棉 20 號(hào)、新彩棉21 號(hào)和新彩棉23 號(hào)（這8 個(gè)材料帶型一樣）從27 份材料中區(qū)分出來(lái)。 第二步使用多態(tài)性標(biāo)記JESPR0251 將新彩棉1 號(hào)、新彩棉2 號(hào)和新彩棉6號(hào)鑒別出來(lái)。 第三步選用SSR 標(biāo)記DPL0111 可明顯將新彩棉2 號(hào)與新彩棉1 號(hào)、新彩棉6 號(hào)區(qū)分開(kāi)，可將新彩棉2 號(hào)從27 份材料中鑒別出來(lái)。根據(jù)表3和表4，將結(jié)果匯總為表5，最少選用9 對(duì)多態(tài)性引物即可完全區(qū)分27 份新彩棉系列品種。

2.3 27份彩棉品種的遺傳多樣性分析

2.3.1聚類分析。 利用NTSYS 2.1 軟件進(jìn)行遺傳相似性分析，結(jié)果表明，27 個(gè)新彩棉品種間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.573 3～0.955 9，平均值為0.764 6，遺傳相似系數(shù)范圍較大，表明新疆彩色棉品種遺傳多樣性相對(duì)豐富。 聚類分析（圖2）顯示，遺傳相似系數(shù)約為0.611 5 時(shí)，可將27 個(gè)彩棉系列品種分為 3 類，Ⅰ類包含新彩棉 1、2、6、11、13、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 和 28 號(hào)，Ⅱ類包含新彩棉 10、12、16 號(hào)，Ⅲ類包含新彩棉 3、4、5、7、8 和 27 號(hào)。 新彩棉 1 號(hào)和 6 號(hào)間的遺傳相似系數(shù)最大，說(shuō)明兩者遺傳差異最小；新彩棉7 號(hào)和新彩棉20 號(hào)間的遺傳相似系數(shù)最小，說(shuō)明兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3.2主坐標(biāo)分析。 應(yīng)用NTSYS 2.1 軟件對(duì)原始矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行PCoA 分析 （主坐標(biāo)分析），利用Eigen 程序繪制主坐標(biāo)分析圖（圖3），供試材料聚為3 大類群，二維主坐標(biāo)分析結(jié)果與樹(shù)狀聚類結(jié)果有一定差異性和一致性。 樹(shù)狀圖中Ⅰ類涵蓋群A以及群B 的3 個(gè)品種，樹(shù)狀圖Ⅱ和Ⅲ類聚為群C（缺少新彩棉4 號(hào)和10 號(hào)）。總體來(lái)說(shuō)，兩種聚類結(jié)果相似，試驗(yàn)材料具有一定的遺傳多樣性。

表3 12 個(gè)新疆彩色棉品種的特征引物

表4 鑒定另外15 個(gè)新疆彩色棉品種的最優(yōu)引物組合

表5 27 個(gè)新疆彩色棉品種的9 對(duì)核心引物十進(jìn)制數(shù)字指紋代碼

2.4 新彩棉系列品種二維碼的構(gòu)建

利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行棉花品種鑒定，可以彌補(bǔ)常規(guī)品種檢測(cè)手段的不足，作為田間鑒定的補(bǔ)充。 本研究為每個(gè)品種構(gòu)建專屬二維碼，掃描二維碼可以了解該品種的相關(guān)信息，二維碼生成網(wǎng)址為：http://www.liantu.com/，其中 4 個(gè)品種的二維碼見(jiàn)圖4。

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高，綠色、天然、環(huán)保、健康已然成為了消費(fèi)者對(duì)紡織品的新追求，彩色棉與紡織品綠色、健康的發(fā)展方向完全一致。 目前，關(guān)于新彩棉系列品種研究主要涉及影響纖維質(zhì)量和色澤沉著相關(guān)基因的功能分析、色澤形成機(jī)理及與其他棉種在各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)比等方面[30-31]，基于分子標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定相關(guān)研究較少。鑒于棉花種子市場(chǎng)多、亂、雜問(wèn)題嚴(yán)重，應(yīng)加強(qiáng)關(guān)于天然彩色棉種質(zhì)鑒別方面的研究。本研究利用分子標(biāo)記對(duì)新彩棉品種進(jìn)行鑒定，有助于新彩系列品種的分子檢測(cè)、新品種培育及棉花產(chǎn)業(yè)綠色健康可持續(xù)發(fā)展。

圖2 基于遺傳相似系數(shù)構(gòu)建的27 份新彩棉系列品種的樹(shù)狀聚類圖

圖3 27 個(gè)新彩棉系列品種的二維主坐標(biāo)分析圖

圖4 部分新彩棉品種二維碼

本研究使用52 對(duì)核心引物在27 份供試材料中共擴(kuò)增出155 個(gè)多態(tài)性帶型，多態(tài)性信息含量大于平均值的26 對(duì)引物中，只有4 對(duì)與已有研究報(bào)道相同[1]，鑒定篩選出的核心引物多態(tài)性高，鑒別能力強(qiáng)，可用于彩棉系列品種純度和真實(shí)性檢測(cè)、遺傳多樣性分析及分子育種工作。本研究并未選取均勻分布于棉花26 對(duì)染色體的多態(tài)性引物，而是更多選取與控制農(nóng)藝性狀位點(diǎn)連鎖的標(biāo)記，不僅可用于遺傳多樣性分析，還可用于目標(biāo)性狀的分子檢測(cè)。 棕色棉基因Lc1的緊密連鎖標(biāo)記SSR225[22]可將其中的6 個(gè)綠色棉與20 個(gè)棕色棉區(qū)分開(kāi)，將新彩棉4 號(hào)（綠色）與其他17 個(gè)棕色棉區(qū)分，但新彩棉 4 號(hào)（綠色）和新彩棉 13 號(hào)、20 號(hào)、24 號(hào)（棕色）不能區(qū)分；SSR241 和utr_0143down 均可作為新彩棉4 號(hào)的特征引物將其與其他棕色棉品種區(qū)分。Gh_A07G0100 為qBFA07-2 基因座的候選基因，可將新彩棉22 號(hào)與其他26 個(gè)品種區(qū)別，但不能區(qū)分棕色棉與綠色棉，因?yàn)閝BFA07-2 基因座作用于棕色纖維顏色深淺，并未控制棕色纖維顏色沉積。

樹(shù)狀圖聚類分析顯示，除新彩棉5 號(hào)和10 號(hào)外棕色棉均聚在Ⅰ類，綠色棉和新彩棉5 號(hào)、10 號(hào)（棕色）分布在Ⅱ和Ⅲ類；二維主坐標(biāo)分析顯示，群A 包含的12 個(gè)品種均為棕色棉，群B 聚集4 個(gè)棕色棉和1 個(gè)綠色棉（新彩棉4 號(hào)），群C 包含除新彩棉4 號(hào)外的所有綠色棉和1 個(gè)棕色棉（新彩棉5號(hào)）。主坐標(biāo)分析與樹(shù)狀圖聚類相似，結(jié)果與纖維顏色較為一致。 總體來(lái)看，棕色棉品種相似系數(shù)比綠色棉相似系數(shù)高，表明綠色棉具有更高的遺傳多樣性。本研究中新彩棉1 號(hào)和6 號(hào)聚為一類后與新彩棉2 號(hào)聚在一起；尤春源等[1]研究中，新彩棉1 號(hào)和2 號(hào)先聚為一類，再與新彩棉6 號(hào)聚在一起；系譜關(guān)系顯示新彩棉1 號(hào)與2 號(hào)同為棕色彩棉BC-B系選所得，新彩棉6 號(hào)為新路早6 號(hào)與棕2 雜交而來(lái)，可能是因?yàn)檠芯窟x取SSR 位點(diǎn)及類型有所不同，但3 個(gè)品種間的遺傳相似系數(shù)是最高的，揭示了他們之間較近的親緣關(guān)系。新彩棉3 號(hào)和4 號(hào)聚為一類，系譜信息顯示均為綠色彩棉BC-G01 系選，但其相似系數(shù)較低，與尤春源等[1]研究結(jié)果一致，表明綠色棉同品系間的遺傳基礎(chǔ)較為廣泛。 新彩棉16 號(hào)是由系9 作為母本雜交育成，新彩棉20號(hào)和24 號(hào)以系9 為父本雜交育成，聚類分析顯示相對(duì)于新彩棉16 號(hào)，新彩棉20 號(hào)和24 號(hào)相似系數(shù)較高。聚類分析從一定程度上揭示了試驗(yàn)材料間的親緣關(guān)系，但與品種選育系譜信息并不完全契合。利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)現(xiàn)有種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，合理利用現(xiàn)有種質(zhì)資源，并基于彩色棉纖維性狀控制位點(diǎn)連鎖標(biāo)記或功能標(biāo)記開(kāi)展彩色棉分子標(biāo)記輔助育種，提高育種效率，保證品種的真實(shí)性和純度，對(duì)天然彩色棉產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)綠色健康、可持續(xù)發(fā)展意義深遠(yuǎn)。

4 結(jié)論

基于52 對(duì)分子標(biāo)記對(duì)27 份育成新彩棉品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，利用9 對(duì)SSR 引物構(gòu)建了這27 個(gè)品種的DNA 指紋圖譜和專屬二維碼，結(jié)果表明新疆彩色棉品種遺傳相似系數(shù)為0.568 2～0.955 9，平均值為0.761 9，品種間遺傳背景差異較大，綠色棉的遺傳多樣性比棕色棉更加豐富。