司曉光，張曉青，杜 瑾，張愛君，曹軍瑞

(自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

微生物絮凝劑是一類由微生物代謝產(chǎn)生的特殊高分子化合物[1-2]，包括多糖類、蛋白類、脂類以及糖脂類等，是一種新型的絮凝劑。因其來源于微生物自身的生理代謝，微生物絮凝劑大多易于降解、安全無毒、無二次污染，能滿足綠色生產(chǎn)要求。目前，微生物絮凝劑已經(jīng)成為絮凝劑研究的一個新熱點，并已在很多領(lǐng)域開始了應(yīng)用，如水處理、食品、化工等領(lǐng)域[3-4]。

目前，我國已從多種環(huán)境中分離出具有絮凝活性的微生物菌種。雖然微生物絮凝劑的相關(guān)研究已經(jīng)進行了多年，但仍未取得突破性的研究成果，也未進行工業(yè)化生產(chǎn)，原因主要包括以下3個方面：(1)微生物絮凝劑本身的穩(wěn)定性差，貯存及運輸條件要求較高，影響其絮凝能力；(2)微生物絮凝劑的研究主要集中在菌種篩選和絮凝性能開發(fā)上，缺少與實際應(yīng)用的結(jié)合；(3)與傳統(tǒng)絮凝劑相比，微生物絮凝劑的成本過高，市場前景堪憂[5-8]。

微生物絮凝劑的開發(fā)對于緩解絮凝劑應(yīng)用中存在的問題起到了一定的作用，但還需從降低生產(chǎn)成本、提高穩(wěn)定性等方面進行相關(guān)研究，如開發(fā)廉價培養(yǎng)基配方、優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)、開發(fā)微生物絮凝劑粉劑等[9-11]。作者以產(chǎn)微生物絮凝劑的芽孢桿菌DHS-63為出發(fā)菌株，對其進行常壓室溫等離子體(ARTP)誘變選育，并進行發(fā)酵罐放大試驗，擬為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 實驗

1.1 菌種、培養(yǎng)基與儀器

芽孢桿菌(Bacillussp.)DHS-63，篩選自塘沽入?？诘奈勰啵４嬗谧匀毁Y源部天津海水淡化與綜合利用研究所海水凈化與水再利用技術(shù)研究室。

斜面培養(yǎng)基：酵母粉 5 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，2%瓊脂粉，pH值7.0，121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g·L-1，尿素5.0 g·L-1，酵母提取物1.0 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 3.0 g·L-1，KH2PO40.8 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g·L-1，pH值7.0，115 ℃滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆油1.0%，豆粕水解液5.0 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 2.5 g·L-1，KH2PO40.6 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g·L-1，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基：大豆油1.5%，豆粕水解液6.0 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 2.5 g·L-1，KH2PO40.6 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g·L-1，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

ARTP-Ⅱ型誘變系統(tǒng)，北京思清源生物科技有限公司；10 L發(fā)酵罐：上海保興BIOTECH-10BGZ在位滅菌發(fā)酵罐；70 L發(fā)酵罐：NBS BioFlo 610發(fā)酵罐。

1.2 菌種選育方法

1.2.1 菌懸液制備

從斜面培養(yǎng)基挑取1環(huán)活化好的菌種接種到裝有150 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)20 h，獲得種子液；取種子液，以1%的接種量按照上述方法進行培養(yǎng)，6 h后獲得處于對數(shù)生長期的種子液；取對數(shù)生長期的種子液1 mL，8 000 r·min-1下離心6 min，棄上清得到菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次，重新懸浮于無菌生理鹽水中，獲得菌懸液。

1.2.2 ARTP誘變

在無菌條件下，取10 μL菌懸液均勻涂布于不銹鋼載片上，晾干，置于ARTP誘變系統(tǒng)中照射；照射結(jié)束后，將載片置于含有生理鹽水的離心管中，振蕩洗滌，涂布到固體種子培養(yǎng)基平板。ARTP誘變條件見表1。

表1ARTP誘變條件

Tab.1 ARTP mutation conditions

1.3 菌種篩選方法

篩選方法分為初篩和復(fù)篩，詳見文獻[12]。

1.4 10 L分批發(fā)酵

10 L發(fā)酵罐中的裝液量為6 L，轉(zhuǎn)速設(shè)為300 r·min-1，通氣比最大為1.5 vvm，溫度設(shè)為30 ℃，接種量為5%，pH值控制在7.0，發(fā)酵周期為48 h，每隔4 h取樣，測定發(fā)酵液的絮凝活性和菌體量(OD)，并記錄溶氧、pH值等參數(shù)。

1.5 70 L分批發(fā)酵

70 L發(fā)酵罐中的裝液量為50 L，轉(zhuǎn)速設(shè)為150～300 r·min-1，通氣比范圍為10～30 SLPM，溫度設(shè)為30 ℃，接種量為5%，pH值控制在7.0，發(fā)酵周期為48 h，每隔4 h取樣，測定發(fā)酵液的絮凝活性和菌體量(OD)，并記錄溶氧、pH值等參數(shù)。

1.6 分析方法

絮凝活性及絮凝劑產(chǎn)量測定方法詳見文獻[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARTP誘變結(jié)果(圖1)

圖1 芽孢桿菌DHS-63的致死率曲線Fig.1 Lethal rate curve of Bacillus sp.DHS-63

ARTP誘變系統(tǒng)以氦氣(He)為載氣，產(chǎn)生的活性離子能穿透細胞結(jié)構(gòu)，破壞細胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)等分子造成微生物死亡，而微生物會啟動自身的修復(fù)機制抵抗這種破壞存活下來，在此過程中發(fā)生基因突變。研究發(fā)現(xiàn)，ARTP誘變系統(tǒng)與微生物致死率之間存在著量效關(guān)系，隨著誘變時間的延長，致死率逐漸升高。由圖1可以看出，隨著誘變時間的延長，菌株DHS-63致死率升高。查閱微生物育種的相關(guān)文獻，當致死率為90%以上時，有效突變率最高。因此，選擇150 s作為最佳誘變時間，此時的致死率為91.3%。

2.2 突變株篩選及穩(wěn)定性分析

經(jīng)初篩和復(fù)篩，選取絮凝活性提高最大的10株突變株，其絮凝結(jié)果見表2。

表2突變株絮凝結(jié)果

Tab.2 Flocculation results of mutant strain

由表2可以看出，10株突變株的剩余濁度均顯著低于出發(fā)菌株DHS-63的，絮凝活性顯著提高，表明ARTP誘變系統(tǒng)是一種切實可行的誘變育種方法。

經(jīng)誘變選育出的突變株在傳代過程中會出現(xiàn)遺傳性狀的“衰退”，進而影響突變株的遺傳穩(wěn)定性。對上述10株突變株的遺傳穩(wěn)定性進行分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 突變株的遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of mutant strain

由圖2可以看出，突變株在傳代過程中剩余濁度呈現(xiàn)不同的變化，其中突變株A65、A102、A185、A189、A243和A336的剩余濁度逐漸增加，表明菌株的絮凝活性逐漸降低。經(jīng)過傳代培養(yǎng)選育出的菌株A265則表現(xiàn)出穩(wěn)定的絮凝活性，且較出發(fā)菌株的絮凝活性顯著提高。其中，傳代5代，出發(fā)菌株DHS-63、菌株A265的剩余濁度分別為44 NTU、23 NTU。提取絮凝劑發(fā)現(xiàn)，DHS-63的絮凝劑產(chǎn)量為0.957 g·L-1，而A265的絮凝劑產(chǎn)量為1.08 g·L-1，提高了12.9%。

2.3 10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

菌株A265在10 L發(fā)酵罐中發(fā)酵過程曲線如圖3所示。

由圖3可以看出，0～8 h，菌體含量較少，菌株處于適應(yīng)期；8～28 h，菌株進入對數(shù)生長期，菌體含量迅速增加；28 h后處于穩(wěn)定期。發(fā)酵過程中發(fā)酵液的剩余濁度逐漸降低，48 h時達到最低值，為22 NTU，分離提取獲得絮凝劑10 g，即發(fā)酵液中絮凝劑產(chǎn)量為1.64 g·L-1。

圖3 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程曲線Fig.3 Fermentation process curve of mutant strain A265 in 10 L fermentor

2.4 70 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

菌株A265在70 L發(fā)酵罐中發(fā)酵過程曲線如圖4所示。

圖4 70 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程曲線Fig.4 Fermentation process curve of mutant strain A265 in 70 L fermentor

由圖4可以看出，種子液接入發(fā)酵罐后迅速進入快速生長期，12 h后進入穩(wěn)定期，而絮凝活性則在12 h后進入快速升高期。44 h時，發(fā)酵液的剩余濁度出現(xiàn)最低值，為24 NTU，分離提取獲得絮凝劑80.6 g，即發(fā)酵液中絮凝劑產(chǎn)量為1.55 g·L-1，發(fā)酵時間縮短了4 h。

2.5 討論

微生物的生長繁殖以及分泌特定的活性產(chǎn)物都需要一定的條件和適宜的發(fā)酵參數(shù)，發(fā)酵溫度、溶氧、培養(yǎng)基pH值等都會影響微生物的生長狀況和代謝產(chǎn)物的生成。

本研究采用ARTP誘變系統(tǒng)對實驗室獲得的一株產(chǎn)絮凝劑菌株DHS-63進行誘變，獲得了突變株A265，該突變株的絮凝活性得到了進一步提高，而且遺傳性狀穩(wěn)定，是適合工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良菌株。通過10 L和70 L發(fā)酵罐試驗發(fā)現(xiàn)，菌株A265在發(fā)酵過程中，菌株生長到穩(wěn)定期后絮凝活性迅速升高，因此可以認為菌株A265產(chǎn)生的絮凝劑為次級代謝產(chǎn)物。另外，與10 L發(fā)酵罐中發(fā)酵時間為48 h相比，70 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵時間僅為44 h，發(fā)酵時間縮短了4 h。發(fā)酵時間的縮短有利于降低發(fā)酵成本，并減少發(fā)酵過程的染菌幾率，對于大規(guī)模生產(chǎn)具有重要的經(jīng)濟效益。

3 結(jié)論

利用常壓室溫等離子體誘變絮凝劑產(chǎn)生菌芽孢桿菌DHS-63，通過篩選和穩(wěn)定性分析獲得了高產(chǎn)菌株A265。與出發(fā)菌株相比，菌株A265的絮凝活性提高了12.9%，且遺傳性狀穩(wěn)定，適合放大生產(chǎn)。經(jīng)10 L和70 L發(fā)酵罐放大試驗發(fā)現(xiàn)，菌株A265產(chǎn)生的絮凝劑主要在菌體達到穩(wěn)定期開始，初步認定絮凝劑為次級代謝產(chǎn)物；由10 L擴大到70 L發(fā)酵過程中，絮凝劑產(chǎn)量由1.64 g·L-1下降到1.55 g·L-1，發(fā)酵時間縮短了4 h，發(fā)酵體積的增加有利于縮短發(fā)酵周期。此研究為大規(guī)模生產(chǎn)微生物絮凝劑提供了參考。