冼康華，付傳明，蘇 江，黃寧珍，何金祥

(廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西喀斯特植物保育與恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點實驗室，廣西桂林 541006)

0 引言

重樓(Parispolyphylla)是百合科(Liliaceae)重樓屬(Paris)多年生草本植物的統(tǒng)稱，是一類全草入藥的野生名貴中藥材，藥用歷史悠久，在古代的中藥材典籍中常稱為重臺、重樓一支箭、重樓金線、三層草、蚤休、紫河車、鐵燈臺、七葉一枝花、草甘遂等[1-3]?，F(xiàn)李恒系統(tǒng)中，全世界重樓屬植物約有26種，12變種，2變型，我國有19種[4]，在浙江、江蘇、江西、福建、安徽、湖北、四川、云南、廣西、貴州等地均有分布[5-6]，目前中國藥典收錄使用的重樓正品藥源是云南重樓(滇重樓)[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz]或七葉一枝花(華重樓)[ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara]的干燥根莖。

重樓個體小、生長慢、成藥期長(7-10年)。近年來，隨著中醫(yī)藥臨床用藥和中成藥的開發(fā)，對重樓的需求大量增加，消耗量遠超其野生資源的生長量，在主產(chǎn)地區(qū)還出現(xiàn)濫采亂挖現(xiàn)象，導(dǎo)致其野生資源日漸枯竭，價格不斷上漲[4，7-8]。由于重樓自然資源日趨減少，加之其經(jīng)濟、藥用價值越來越受到人們的重視，許多企業(yè)和科研單位已開展藥用重樓人工生產(chǎn)與科研方面的工作。重樓通常采用根莖繁殖，但種源稀缺且用量大，難以滿足市場需求。種子繁殖是重樓人工繁育的三大途徑之一，也是目前我國重樓產(chǎn)業(yè)中種苗繁育的主要方式。雖然重樓種子產(chǎn)量大，但由于重樓種子具有“二次休眠”特性，種子發(fā)芽周期長，發(fā)芽率低，并且出苗時間不一致，出苗不整齊，嚴(yán)重制約重樓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來關(guān)于如何快速促進重樓種子萌發(fā)的研究已有不少報道。重樓種皮中含有萌發(fā)抑制物，不利于種子萌發(fā)，生產(chǎn)上多采用濕沙或草木灰[5]混合的方法搓去外種皮。張旺凡等[9]以井岡山區(qū)野生七葉一枝花種子為材料，采用細沙層積冷藏變溫處理后再用50-100 mg/L的赤霉素(GA3)處理24 h，以細沙為基質(zhì)，在20℃溫度下催芽60 d后可使發(fā)芽率達到90%以上。熊飛[10]采取相似的方法處理七葉一枝花種子，播種后2個月左右即可陸續(xù)出苗，出苗率達80%以上，高者可達90%。李曉冬[11]研究發(fā)現(xiàn)適宜的層積條件對華重樓種子的萌發(fā)具有決定性的影響，華重樓種胚先用 100 mg/L的赤霉素浸泡 24 h，再在 18-20℃中層積 45 d、4℃中層積 30 d、18-20℃中層積 75 d時的萌發(fā)用時最短，效果最好，為華重樓種子萌發(fā)的最適條件；而最適宜的赤霉素濃度為100 mg/L，高濃度的赤霉素(200 mg/L)反而會抑制華重樓種胚的發(fā)育。劉忠輝等[12]的研究結(jié)果表明，2 500 mg/L GA3處理七葉一枝花48 h，平均發(fā)芽率為50%，萌動時間為53 d。除外加赤霉素、變溫層積之外，李海明等[13]采用 100 μmol/L硝普鈉處理種子，比對照提前20 d 萌發(fā)。姜美杰等[14]則認(rèn)為華重樓生產(chǎn)上宜采用冷凍法去除種子外種皮，使用0.001%濃度的H2O2浸種14 h后于18℃蛭石中層積，效果最好。也有研究表明，在播種前使用多菌靈浸泡1 h，發(fā)芽時間比不浸泡減少3-4個月的時間，發(fā)芽率達到85%[15]。不同的研究人員雖然研究結(jié)果不一致，但都表明激素和濕潤層積對種子休眠解除和萌發(fā)促進具有重要作用，也表明重樓種子萌發(fā)是一個復(fù)雜的過程，影響其萌發(fā)的關(guān)鍵因子有待深入探索。本研究選取不同來源的滇重樓和華重樓種子，利用變溫層積和植物激素進行處理，探索不同因素不同處理方式對不同來源重樓種子萌發(fā)的影響，以期為重樓的產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以不同來源的華重樓3份(分別來自：桂林恭城，四川瀘州，桂林靈川)和滇重樓3份(分別來自：桂林恭城，云南低海拔地區(qū)，四川瀘州)種子為材料(表1)。種子收集時間：10月中旬至11月末，選取的種子果皮變黃開裂，去皮容易，種子飽滿。

表1 供試的重樓種子信息

Table 1 Test seeds' information ofParispolyphylla

收集地點Collection place收集時間Collection time千粒質(zhì)量Thousand seeds weight (g)桂林恭城Gongcheng,Guilin2017 10 1465.96±0.72四川瀘州Luzhou,Sichuan2017 10 1540.69±0.52桂林靈川Lingchuan,Guilin2017 11 2935.32±0.28桂林恭城Gongcheng,Guilin2017 10 1465.78±0.72云南低海拔地區(qū)Low altitude region of Yunnan2017 11 2343.15±0.40四川瀘州Luzhou,Sichuan2017 11 2240.45±0.48

1.2 方法

1.2.1 赤霉素(GA3)對重樓種子萌發(fā)的影響

用草木灰拌沙子小心搓洗掉種子紅色外種皮后，用1 000倍豐田化工生產(chǎn)的枯萎根腐特效靈浸泡1 min，清水洗凈，晾干后用0,50,100,150,200,400,600,800 mg/L的GA3(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)浸泡24 h，之后將種子與沙子按1∶5的體積比例拌勻并置于花盆內(nèi)，放置于通風(fēng)涼爽處催芽，保持沙子的濕度在30%-40%(用手抓一把沙子緊握成團，松開即散為宜)。每個處理200粒種子，3次重復(fù)。處理后每隔30 d觀測一次，連續(xù)觀測15個月，記錄發(fā)芽種子數(shù)，統(tǒng)計發(fā)芽率，發(fā)芽率=發(fā)芽數(shù)/試驗播種量(粒)×100%。

1.2.2 變溫層積對重樓種子萌發(fā)的影響

以來自四川瀘州的華重樓、滇重樓和桂林靈川縣海洋鄉(xiāng)華重樓種子為材料，用草木灰拌沙子小心搓洗掉種子紅色外種皮后，用1 000倍豐田化工生產(chǎn)的枯萎根腐特效靈浸泡1 min，清水洗凈后用去離子水浸泡24 h，按如下3種方式進行濕沙層積：①種子與沙子按1∶1(V∶V)層積后，通過5℃ 2個月、20℃ 1個月、5℃ 2個月處理后，置于室外通風(fēng)處催芽；②種子與沙子按1∶5(V∶V)層積后，通過5℃ 2個月、20℃ 1個月、5℃ 2個月處理后，置于室外通風(fēng)處催芽；③種子與沙子按1∶5(V∶V)層積后，直接置于室外通風(fēng)處催芽，作為對照。上述各處理保持沙子的濕度為30%-40%。每個處理使用種子200粒，3次重復(fù)。每隔30 d觀測一次，連續(xù)觀測15個月，統(tǒng)計發(fā)芽率，發(fā)芽率=發(fā)芽數(shù)/試驗播種量(粒)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗測得所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2003處理，用SPSS Statistics 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素(GA3)對重樓種子萌發(fā)的影響

用不同濃度的GA3對不同來源的華重樓和滇重樓種子進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種不同來源的華重樓和滇重樓種子中，僅四川瀘州華重樓、四川瀘州滇重樓種子和桂林靈川華重樓種子能夠萌發(fā)，發(fā)芽率分別為66.5%-73.0%、72.5%-86.0%和75.5%-83.0%。其中四川瀘州華重樓和四川瀘州滇重樓種子100 d后觀測到萌發(fā)(圖1 a、c)，桂林靈川華重樓11個月才開始有萌動、12個月后大量萌發(fā)，其他種子未見萌發(fā)，具體發(fā)芽率見表2。采用SPSS19.0分析不同來源、GA3濃度對發(fā)芽率的影響，結(jié)果可知，來源的F=29.872，P=0.000<0.01，差異極顯著；赤霉素濃度的F=1.387，P=0.285>0.05，差異不顯著，表明來源不同對種子的萌發(fā)有極顯著的影響，而赤霉素影響不顯著(表3)。進一步對不同來源的種子萌發(fā)率進行多重比較，結(jié)果如表4所示，從中可知來源3(桂林靈川華重樓)與來源1(四川瀘州華重樓)、2(四川瀘州滇重樓)的發(fā)芽率有顯著的差異，來源四川瀘州的發(fā)芽率顯著高于來自桂林靈川的，而來源1(四川瀘州華重樓)與來源2(四川瀘州滇重樓)無顯著差異。說明不同濃度的GA3處理對供試的華重樓和滇重樓種子萌發(fā)時間和萌發(fā)率的影響并不顯著，而種子來源對萌發(fā)時間和萌發(fā)率的影響極顯著。

圖1 不同來源重樓種子萌發(fā)結(jié)果

表2 赤霉素(GA3)對重樓種子萌發(fā)的影響

Table 2 Effects of gibberellin on seed germination ofParispolyphylla

GA3濃度Gibberellin concentration(mg/L)發(fā)芽率Germination rate (%)華重樓Paris polyphylla Smith var.chinensis滇重樓Paris polyphylla Smith var.yunnanensis桂林恭城Gongcheng,Guilin四川瀘州Luzhou,Sichuan桂林靈川Lingchuan,Guilin桂林恭城Gongcheng,Guilin云南低海拔地區(qū)Low altitude area in Yunnan四川瀘州Luzhou,Sichuan0079.5±1.168.5±0.40080.5±0.750080.5±0.467.0±2.90078.0±0.8100072.5±1.967.0±0.80075.5±1.1150080.0±1.673.0±1.40079.0±1.2200076.5±1.168.0±1.60083.5±1.2400073.0±0.869.0±0.80080.0±1.0600086.0±1.466.5±0.40078.5±0.7800075.0±0.866.5±1.20076.0±0.7

表3 來源和赤霉素濃度對發(fā)芽率的方差分析結(jié)果(因變量：發(fā)芽率)

Table 3 ANOVA results of sources and gibberellin concentration (Dependent variable:Germination rate)

變異來源Source of variationⅢ型平方和SSTypeⅢ sum of squares自由度df均方MSMean squareF值F value顯著性Sig.校正模型Corrected model648.094a972.0107.7170.000截距Intercept134 925.0101134 925.01014 458.5560.000來源Source557.5212278.76029.8720.000赤霉素濃度Gibberellin concentration90.573712.9391.3870.285誤差Error130.646149.332總和Total135 703.75024校正總和Corrected total778.74023

注：“a”表示R2=0.832(調(diào)整R2=0.742)

Note:"a"meansR2=0.832 (adjustR2=0.724)

表4 不同來源間發(fā)芽率均數(shù)的兩兩比較(S-N-K法)

Table 4 Pairwise comparison of mean germination rates between different sources (Student-Newman-Keuls)

來源SourceN子集Subset121877.875-2878.875-38-68.188Sig.0.5231.000

2.2 變溫層積對重樓種子萌發(fā)的影響

從表5可知，3種層積方式中重樓種子均有萌發(fā)。其中，四川瀘州華重樓種子萌發(fā)率最高的是處理③(CK)，萌發(fā)率為83%；四川瀘州滇重樓種子萌發(fā)率最高的是處理②，萌發(fā)率為82%；桂林靈川華重樓萌發(fā)率最高為60%，以處理②最佳(圖1b)。四川瀘州華重樓、滇重樓對照處理于層積3個月左右便可觀測到種子的萌發(fā)，而經(jīng)變溫處理的種子在處理完后50 d可陸續(xù)觀測到種子的萌發(fā)；桂林靈川華重樓則在13個月后才有種子的萌發(fā)，且萌發(fā)率相對偏低，此外，觀測時部分種子消失，可能是較長的沙藏時間導(dǎo)致部分種子因某些因素腐爛死亡。采用SPSS19.0分析不同來源、不同層積方式對發(fā)芽率的影響，結(jié)果如表6所示。從表6中可知，來源F=74.776，P=0.001<0.01，差異極顯著；不同層積方式F=0.276，P=0.772>0.05，差異不顯著。表明在種子層積處理時種子的來源對發(fā)芽率影響極顯著，而層積方式影響不顯著。進一步對不同來源的種子萌發(fā)率進行多重比較，發(fā)現(xiàn)來源3(桂林靈川華重樓)與來源1(四川瀘州華重樓)、2(四川瀘州滇重樓)有顯著差異，而來源1(四川瀘州華重樓)與來源2(四川瀘州滇重樓)無顯著差異(表7)。結(jié)果表明變溫層積對華重樓和滇重樓種子萌發(fā)時間和萌發(fā)率的影響并不顯著，而種子來源對萌發(fā)時間和萌發(fā)率的影響極顯著。

表5 變溫層積方式對重樓種子萌發(fā)的影響

Table 5 Effects of stratification methods on seed germination ofParispolyphylla

處理Treat ment發(fā)芽率Germination rate (%)四川瀘州華重樓Paris polyphylla Smith var.chinensis from Luzhou,Sichuan四川瀘州滇重樓Paris polyphylla Smith var.yun nanensis from Luzhou,Sichuan桂林靈川華重樓Paris polyphylla Smith var.chinensis from Lingchuan,Guilin①80.0±0.481.5±0.458.5±1.5②79.5±1.882.0±2.260.0±1.6③(CK)83.0±0.776.5±0.457.5±1.1

表6 來源和層積方式對發(fā)芽率的方差分析結(jié)果(因變量：發(fā)芽率)

Table 6 ANOVA results of source and stratification methods (Dependent variable:Germination rate)

變異來源Source of variationⅢ型平方和SSTypeⅢ sum of squares自由度df均方MSMean squareF值F value顯著性Sig.校正模型Corrected model950.667a4237.66737.5260.002截距Intercept48 180.250148 180.2507 607.4080.000來源Source947.1672473.58374.7760.001層積方式Lamination method3.50021.7500.2760.772誤差Error25.33346.333總和Total49 156.2509校正總和Corrected total976.0008

注：“a”表示R2=0.974(調(diào)整R2=0.948)

Note:"a"meansR2=0.974 (adjustR2=0.948)

表7 不同來源間發(fā)芽率均數(shù)的兩兩比較(S-N-K法)

Table 7 Pairwise comparison of mean germination rates between different sources (Student-Newman-Keuls)

來源SourceN子集Subset121380.000-2380.83333-58.667Sig.0.7061.000

3 討論

重樓種子發(fā)芽周期長，發(fā)芽率低，且種子具有休眠性。影響重樓種子萌發(fā)的因素有溫度、光照、內(nèi)源激素、外源生長調(diào)節(jié)劑、超聲波、紫外線等，外部培養(yǎng)條件改變、內(nèi)源激素變化、內(nèi)源酶變化等都會影響種子發(fā)芽這一復(fù)雜過程。因此，開展對重樓種子萌發(fā)影響的研究有較大的實踐意義。本研究利用植物激素和層積變溫對不同來源的滇重樓和華重樓種子進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外加赤霉素(GA3)、不同的層積和變溫處理均不能顯著改善華重樓和滇重樓種子的萌發(fā)特性，種子的萌發(fā)時間和萌發(fā)率高低與種子來源顯著相關(guān)。有研究表明，在適溫條件下，由于重樓種子內(nèi)部各種激素水平處于平衡狀態(tài)，外源赤霉素對重樓種子的二次發(fā)育沒有明顯促進作用[16-17]，本研究可能正是由于重樓種子內(nèi)部各種激素處于平衡狀態(tài)，導(dǎo)致赤霉素處理不能促進種子的萌發(fā)。重樓種子適宜的形態(tài)后熟條件為18-20℃的濕潤層積，0-10℃的濕潤層積有助于打破種子的生理休眠。因此，通過二次變溫層積應(yīng)可以促進重樓種子的萌發(fā)。在本研究中，變溫處理并未能顯著提高種子的萌發(fā)率，不經(jīng)變溫處理的對照四川重樓種子在層積3個月左右即可觀測到種子萌發(fā)，而變溫層積的種子(變溫處理時間+觀測到萌發(fā)的時間)共需200 d左右種子才開始萌發(fā)，萌發(fā)所需時間比對照處理更長。分析認(rèn)為可能是所選的重樓種子不存在或是存在時間極短的生理休眠，故無需低溫打破種子生理休眠；又由于低溫會使重樓種子內(nèi)赤霉素的含量下降[18]，可能打破了重樓種子內(nèi)部各種激素的平衡狀態(tài)，使得種子需要更長的萌發(fā)時間。

王艷芳等[16]研究不同種子來源對種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)主要由于成熟度的差異，不同來源種子的萌發(fā)及胚根生長情況差異明顯。本研究中選取的種子均為果實成熟后果皮裂開的種子，成熟度差異不大，可以排除種子成熟度的影響。另有研究表明，由于各產(chǎn)地間的溫度、光照、降水量、土壤等環(huán)境條件各不相同，為適應(yīng)不同的環(huán)境條件，植物可能產(chǎn)生一些遺傳變異，并將穩(wěn)定的遺傳變異反映在種子品質(zhì)上[19]，最終造成不同產(chǎn)地來源的種子萌發(fā)不同。朱艷霞等[20]在研究滇重樓種子形態(tài)及發(fā)芽特性的產(chǎn)地差異時發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的滇重樓種子萌發(fā)不同，并將20個產(chǎn)地的滇重樓種子劃分為3類，第1類來源于貴州六盤水和云南文山，特點是籽粒小、發(fā)芽率低；第2類主要來源于廣西百色、云南文山，特點是籽粒大、發(fā)芽率中等水平；第3類產(chǎn)地包括云南西北部和中部，特點是籽粒中等大小、種子發(fā)芽率偏高。本研究選取的6份種子產(chǎn)地分別為廣西、云南、四川等重樓主產(chǎn)區(qū)，其中來源四川瀘州的滇重樓及華重樓，籽粒中等，種子萌發(fā)率最高；桂林靈川華重樓，籽粒小，種子萌發(fā)率中等；而所選的桂林恭城重樓及云南低海拔地區(qū)的滇重樓，籽粒大，種子未能萌發(fā)。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)四川瀘州華重樓、四川瀘州滇重樓的發(fā)芽率及發(fā)芽時間無顯著差異，而桂林靈川華重樓與四川瀘州重樓種子的發(fā)芽率及發(fā)芽時間差異極顯著。在后續(xù)的種質(zhì)資源收集和種子萌發(fā)實驗中，發(fā)現(xiàn)收集到的云南文山高桿滇重樓種子當(dāng)年11月與濕沙混合，在室溫下貯藏，保持濕度，第二年3月觀測，已有大量種子萌發(fā)。上述結(jié)果表明，重樓種子的萌發(fā)時間和萌發(fā)率存在明顯的地域差異，為適應(yīng)不同的環(huán)境條件，不同產(chǎn)地的重樓可能產(chǎn)生某些遺傳變異，造成不同產(chǎn)地來源的種子萌發(fā)不同。本研究中種子的萌發(fā)時間和萌發(fā)率高低與來源顯著相關(guān)。

本研究未能找到外源激素、層積方式、溫度條件等促進重樓種子萌發(fā)的明顯證據(jù)，可能是未找到合適的處理方式或條件，至于這些因素是否能夠真正促進重樓種子萌發(fā)，則需要更多來源的種子以及更加詳細的實驗來進一步驗證。在自然條件下，滇重樓種子需要兩冬一夏才能萌發(fā)，15個月的出苗率僅為46.2%[21]，大量種子在漫長的休眠期間喪失了生命力。本研究中四川瀘州華重樓、滇重樓，以及后續(xù)收集到的云南文山高桿滇重樓，種子只需3-4個月的濕沙貯藏，即可大量萌發(fā)，極大縮短了育苗時間，其萌發(fā)機理暫未清楚，有待進一步深入研究。因此，研究不同產(chǎn)地的種子萌發(fā)特性與質(zhì)量差異具有重要意義，選擇種子萌發(fā)快、萌發(fā)率高及有效成分含量豐富的優(yōu)良種質(zhì)，可以有效縮短重樓育苗時間，有利于促進重樓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究表明外加赤霉素GA3、不同的層積和變溫處理均不能明顯改善重樓種子的萌發(fā)特性，種子的萌發(fā)時間和萌發(fā)率高低與種子來源顯著相關(guān)。今后將對更多來源的重樓種子開展萌發(fā)研究，進一步驗證種子來源與種子萌發(fā)的關(guān)系。同時，應(yīng)該開展重樓種子萌發(fā)機理的相關(guān)研究，探討更科學(xué)有效的方式促進重樓種子的萌發(fā)，提高種子發(fā)芽率，為規(guī)模化種植提供技術(shù)支撐。