吳烈善，盧小勇，俞丹丹，牛潤，周陽波，黃詩蔚，拜俊岑

( 1.廣西大學(xué) 資源環(huán)境與材料學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西華誼能源化工有限公司，廣西 欽州 535000)

0 引言

我國土壤環(huán)境現(xiàn)狀總體上不容樂觀，農(nóng)用耕地土壤環(huán)境較為突出。我國土壤總的點位超標(biāo)率16.1 %，其中輕微污染占比11.2 %[1]，表明我國土壤環(huán)境中鎘的輕度污染更為嚴(yán)重。在重金屬輕微污染的農(nóng)田上，如何確保灌區(qū)農(nóng)產(chǎn)品的健康與安全已成為當(dāng)今環(huán)境科學(xué)的熱點問題。

當(dāng)前，耕地重金屬的輕微污染治理主要分為兩個方面。一方面是通過物理，化學(xué)，生物學(xué)或常規(guī)處理方法減少土壤中重金屬的總量或有效含量來改善土壤環(huán)境，從而減少重金屬的毒性及其在農(nóng)作物中的積累。另一方面是種植不對重金屬吸收或者少量吸收的植物[2]。植物阻隔修復(fù)主要有兩種手段：①利用轉(zhuǎn)基因的手段或者傳統(tǒng)育種方法培育重金屬低吸收品種；②對生長在重金屬污染環(huán)境的植物施加具有阻隔鈍化功能的物質(zhì)，減少植物對重金屬的吸收。

生物刺激素可以提高植物抗逆性[3-4]。通過水培實驗，探討大豆幼苗在鎘脅迫下噴施生物刺激素對鎘積累分布、抗氧化指標(biāo)以及亞細(xì)胞分布的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆；霍格蘭營養(yǎng)液；生物刺激素，配制0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 g/L濃度溶液，用酸將其pH調(diào)至5～7。

1.2 水培試驗

選取顆粒大小且飽滿的當(dāng)年大豆，采用5 %雙氧水消毒，消毒時間控制在30 min，消毒后用大量的去離子水沖洗。將消毒后的種子在25 ℃的水中浸泡12 h進(jìn)行浸種，浸種后的大豆轉(zhuǎn)移至育苗盤中用濕潤毛巾覆蓋進(jìn)行萌發(fā)，萌發(fā)時間一般為12 h，萌發(fā)條件設(shè)置為嚴(yán)格避光，溫度為25 ℃，相對濕度保持70 %。發(fā)芽后(以露白為準(zhǔn))，繼續(xù)培養(yǎng)持續(xù)2 d，直到胚根長到2～4 cm。選擇生長基本相同的幼苗，然后將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)盤進(jìn)行水培，長出真葉后，使用10 mg/L Cd2+的1/2 改良Hoagland’s培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，空白組用不含Cd2+的1/2 改良Hoagland’s培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為光照時間設(shè)16 h，溫度設(shè)26 ℃，避光時間8 h，溫度設(shè)24 ℃，晝夜?jié)穸染鶠?0 %。用噴霧器將配置好不同濃度的生物刺激素噴向幼苗，葉片滴液為限，對照組噴施去離子水，每個梯度設(shè)3組平行。每3 d更換1次營養(yǎng)液以確保營養(yǎng)液中pH值、鎘離子濃度、溶解氧等指標(biāo)的穩(wěn)定，每次更換營養(yǎng)液后噴施一次相應(yīng)濃度的生物刺激素，繼續(xù)幼苗培養(yǎng)15～20 d，采集新鮮的植株，用自來水沖洗幼苗根部，濾紙吸干水分后浸泡在20 mmol/L EDTA·2Na中，浸泡時間為30 min，去除附著在幼苗根部的Cd離子，浸泡后用去離子水充分沖洗，用濾紙吸干植株表面水分，然后用塑料刀剪切按照根、莖、葉三部分進(jìn)行分解，根莖葉的樣品置于超低溫冷凍冰箱中于-30 ℃保存。

1.3 指標(biāo)測定

幼苗各器官生物量；丙二醛含量；SOD、CAT、POD；幼苗各器官鎘含量；亞細(xì)胞組分鎘含量。

1.4 測定方法

生物量的測定，取10株大豆幼苗的根部、莖部、葉部及莢殼于105 ℃下殺青30 min，然后于70 ℃烘至恒重，對其稱重；SOD活性的測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[5]；CAT的活性采用紫外吸收法測定[6]；鎘參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測定》；亞細(xì)胞組分的分離參照文獻(xiàn)[7-10]，分別取0.2 g的大豆幼苗根、莖、葉、莢殼樣品，配置50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)、250 mmol/L蔗糖以及10 mmol/L二硫蘇糖醇配置的緩沖液，使用10 mL緩沖溶液將植物樣品研磨成勻漿以進(jìn)行分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物刺激素對鎘脅迫下大豆幼苗生物量的影響

在10 mg/L的Cd2 +脅迫下，以噴施生物刺激素濃度為橫坐標(biāo)，大豆幼苗各部位生物量干重為縱坐標(biāo)，實驗結(jié)果如圖1所示。噴施低濃度0.1、0.2 g/L的生物刺激素2組實驗組，植株根部生物量與對照組無顯著性差異(p>0.05)，噴施0.5 g/L的生物刺激素實驗組根部生物量較對照組稍有增加，噴施1.0 g/L和2.0 g/L的生物刺激素的兩組試驗組，試驗組的植株根部生物量較對照組顯著性增加(p<0.05)。隨著噴施生物刺激素濃度的不斷提高，大豆幼苗莖部生物量呈現(xiàn)先增高后回落的趨勢，莖部生物量較對照組增加1.27 % ～ 24.10 %，噴施低濃度0.1、0.2 g/L的生物刺激素兩組實驗組，植株莖部生物量與對照組無顯著性差異(p>0.05)，噴施濃度為0.5 g/L的生物刺激素，莖部生物量略有增加，噴施1.0 g/L和2.0 g/L的生物刺激素，莖部生物量出現(xiàn)顯著性增加(p<0.05)。葉部干重較對照組增加2.13 %～39.00 %，噴施濃度為0.1、0.2、0.5 g/L生物刺激素，實驗組葉片生物量與對照組無明顯區(qū)別(p>0.05)，噴施1.0 g/L和2.0 g/L的生物刺激素的試驗組植株葉部生物量較對照組顯著性增加(p<0.05)。噴灑各種梯度的生物刺激素后，試驗組和對照組植物的莢殼生物量無明顯差異(p>0.05)。

(a) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(b) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(c) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(d) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

2.2 生物刺激素對鎘脅迫下大豆幼苗葉片抗氧化作用代謝酶活性及膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量的影響

SOD、CAT和POD對緩解植物的膜脂過氧化有重要作用[11]。當(dāng)鎘脅迫超過植物細(xì)胞的耐受極限時，細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生速率大于分解速率，自由基的積累導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化作用加劇，該反應(yīng)的產(chǎn)物MDA含量升高。反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量，能夠反映膜脂過氧化反應(yīng)程度[12]。

10 mg/L Cd2+脅迫下，以噴施生物刺激素濃度為橫坐標(biāo)，大豆幼苗新鮮葉片細(xì)胞中SOD、CAT、POD的活性和葉片細(xì)胞中MDA的含量為縱坐標(biāo)，實驗結(jié)果如圖2所示。實驗表明大豆幼苗葉片中的SOD活性隨著噴施生物刺激素濃度升高表現(xiàn)出先升高后降低，新鮮葉片細(xì)胞SOD活性較對照組提高了8.26 %～54.38 %。噴施0.1、0.2 g/L生物刺激素的實驗組葉片細(xì)胞中SOD的活性與對照組無明顯差異(p>0.05)，噴施0.5、1、2 g/L的生物刺激素其活性明顯高于對照組(p<0.05)。隨著噴施生物刺激素的濃度增加，大豆幼苗葉片中CAT活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，葉片細(xì)胞中CAT活性較對照組提高了4.22 %～47.07 %，噴施0.1、0.2 g/L的生物刺激素，與對照組相比葉片細(xì)胞CAT活性無明顯差異(p>0.05)，噴施0.5、1.0、2.0 g/L生物刺激素時，葉片細(xì)胞CAT活性較對照組出現(xiàn)顯著性提高(p<0.05)。圖示顯示隨著噴施生物刺激素的濃度升高，葉片細(xì)胞中POD的活性先升高后降低，實驗組葉片細(xì)胞中的POD的活性較對照組增加了3.64 %～34.94 %。噴灑0.1、0.2 g/L的生物刺激素的實驗組葉片細(xì)胞POD的活性與對照組無明顯差異(p>0.05)，噴施0.5、1.0、2.0 g/L生物刺激素，較對照組葉片POD活性出現(xiàn)顯著性提高(p<0.05)。隨著噴施生物刺激素的濃度升高，葉片細(xì)胞中MDA的含量先降低后升高，實驗組葉片細(xì)胞中MDA含量較對照組降低了8.94 %～28.6 %，其中噴施1.0 g/L的生物刺激素的大豆幼苗葉片中的MDA含量降幅最大。噴施0.1、0.2 g/L的生物刺激素的實驗組葉片細(xì)胞的MDA與對照組含量無明顯差異(p>0.05)，噴施0.5、1.0、2.0 g/L生物刺激素，較對照組相比葉片細(xì)胞MDA含量出現(xiàn)顯著性減少(p<0.05)。

(a) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(b) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(c) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(d) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

2.3 生物刺激素對鎘脅迫下大豆幼苗各器官鎘的累積和分布的影響

根部、莖部對鎘進(jìn)入葉部和果實有重要影響[13]。在鎘脅迫下，以噴施的生物刺激素濃度為橫坐標(biāo)，大豆幼苗各部位的鎘離子積累為縱坐標(biāo)，實驗結(jié)果如圖3所示。隨著噴施生物刺激素濃度的升高，大豆幼苗根部鎘累積先升高后降低，實驗組根部鎘累積較對照組增加了4.65 %～22.61 %，噴施1.0 g/L的生物刺激素根部鎘含量增加最多。噴施0.1、0.2 g/L的生物刺激素，與對照組相比根部鎘含量無明顯差異，噴施0.5、1.0、2.0 g/L的生物刺激素，根部鎘含量明顯高于較對照組(p<0.05)。隨著噴施生物刺激素濃度的升高，大豆幼苗根部鎘累積先升高后降低，實驗組莖部鎘累積較對照組降低了7.32 %～34.05 %，噴施1 g/L的生物刺激素莖部鎘含量減少最多。噴施0.1、0.2 g/L的生物刺激素，與對照組相比莖部鎘累積無明顯差異，噴施0.5、1.0、2.0 g/L的生物刺激素，實驗組莖部鎘累積較對照組呈顯著性減少(p<0.05)。隨著噴施生物刺激素濃度的升高，實驗組葉部鎘累積先降低后升高，實驗組鎘累積較對照組降低了3 %～37.85 %，噴施1.0 g/L的生物刺激素葉部鎘含量減少最多。噴施0.1、0.2 g/L的生物刺激素，幼苗葉部鎘累積較對照組無明顯差異(p>0.05)，噴施0.5、1.0、2.0 g/L的生物刺激素，實驗組葉部鎘累積較對照組呈現(xiàn)顯著性降低(p<0.05)。噴施生物刺激素的多少對莢殼部位鎘含量無顯著性差異(p>0.05)。生物刺激素改變大豆幼苗中鎘累積及其分布的原因可能是刺激細(xì)胞產(chǎn)生植物螯合素[14]，植物螯合素可以對進(jìn)入植物體內(nèi)的Cd進(jìn)行螯合滯留在根部，有效地阻隔Cd向莖部、葉部的轉(zhuǎn)移，從而降低了根上部位的鎘含量。

(a) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(b) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(c) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(d) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

在鎘脅迫下，將鎘固定在細(xì)胞壁或胞間以減緩對細(xì)胞的毒害作用[15]。由圖4可知，噴施0.1、0.2 g/L的生物刺激素根部細(xì)胞壁、細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)組分中鎘含量與對照組無顯著性差異(p>0.05)，噴施0.5、1.0、2.0 g/L的生物刺激素時根部細(xì)胞壁和細(xì)胞器組分中鎘含量較對照組顯著性提高(p<0.05)，實驗組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)組分中鎘累積較對照組出現(xiàn)了顯著性降低(p<0.05)。噴施0.1、0.2 g/L的生物刺激素莖部細(xì)胞壁、細(xì)胞器及細(xì)胞質(zhì)中鎘含量與對照組無顯著性差異(p>0.05)，噴施0.5、1.0、2.0 g/L的生物刺激素時莖部細(xì)胞壁中鎘含量較對照組顯著性提高(p<0.05)；幼苗莖部細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)組分中鎘含量較對照組出現(xiàn)顯著性降低(p<0.05)。噴施0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 g/L的生物刺激素葉部細(xì)胞壁、細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)組分中鎘含量較對照組顯著性降低(p<0.05)。噴施生物刺激素可以提高細(xì)胞壁對重金屬鎘的固定作用，抑制鎘離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，阻隔了鎘離子由根部向地上部分的轉(zhuǎn)移。

(a) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(b) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

(c) 生物刺激素濃度/(g·L-1)

3 結(jié)論

① 10 mg/L Cd2+脅迫下，向大豆幼苗噴灑生物刺激素可以增加幼苗根、莖、葉的生物量，噴施2.0 g/L的生物刺激素后，實驗組幼苗根系干重較對照組提高27.42 %，噴施1.0 g/L的生物刺激素幼苗莖、葉干重較對照組分別提高了24.1 %、39.0 %。

② 10 mg/L Cd2+脅迫下，噴施1.0 g/L的生物刺激素，葉片細(xì)胞CAT、SOD和POD的活性提升了47.07 %、54.38 %、34.94 %，MDA含量降低28.6 %。

③ 生物刺激素能夠抑制大豆幼苗根部鎘離子向根上部分的轉(zhuǎn)移，1.0 g/L生物刺激素對鎘脅迫下大豆幼苗莖部、葉部鎘含量較對照組分別降低34.0 %、37.87 %，并且可以提高細(xì)胞壁對鎘的固定作用，抑制鎘離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，阻隔了鎘離子由根部向地上部分的轉(zhuǎn)移。