吳靜娜 楊秀娟 韋璐陽(yáng) 蔣越華 農(nóng)耀京

摘 要：以化學(xué)共沉淀法制備的MWCNTs-Fe3O4為磁性吸附劑，結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定植物油中的黃曲霉毒素。樣品加入正己烷后，用pH=3.0、體積分?jǐn)?shù)為12.5 %的乙腈—水溶液提取，最后加入MWCNTs-Fe3O4進(jìn)行磁性固相萃取。優(yōu)化了萃取劑、吸附劑用量、吸附時(shí)間、洗脫劑、洗脫時(shí)間等磁性固相萃取條件。結(jié)果表明，黃曲霉毒素AFB1其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9987，方法檢出限為0.01 μg/kg，定量限為0.04 μg/kg。在樣品中分別添加水平為5，10 和 20 μg/kg 的AFB1，回收率為81.5 %～104.5 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5 %～4.3 %。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于植物油中黃曲霉毒素AFB1的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：磁性固相萃取 黃曲霉毒素 多壁碳納米管 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：O657? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：Aflatoxins in vegetable oil were determined by HPLC tandem mass spectrometry with MWCNTs-Fe3O4 which prepared by chemical co-precipitation as magnetic adsorbent. After adding n-hexane，the samples were extracted by acetonitrile-water solution with a pH of 3.0 and a volume fraction of 12.5%，and purified by MWCNTs-Fe3O4. The magnetic solid phase extraction conditions such as extraction agent，adsorbent dosage，adsorption time，eluent and eluent time were optimized. The results showed that aflatoxin AFB1 had a good linearity with the correlation coefficient of 0.9987. The LOD was 0.01μg/kg and the LOQ was 0.04μg/kg. The average recoveries at spiked levels of 5，10，20 μg/kg ranged from 81.5% to104.5% with relative standard deviations between 1.5% and 4.3%. The method is simple，rapid and accurate for the determination of AFB1 in vegetable oil.

Key words：Magnetic solid phase extraction;aflatoxin;multi-walled carbon nanotubes; HPLC-MS/MS

真菌毒素的污染已經(jīng)成為食品安全關(guān)注的熱點(diǎn)。玉米、花生、大米及植物油脂等糧油農(nóng)產(chǎn)品及其制品在生產(chǎn)、流通、儲(chǔ)存過(guò)程中由于易污染產(chǎn)生黃曲霉毒素及其代謝物。目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素中，毒性最強(qiáng)的是黃曲霉毒素B1（AFB1），被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為 I 類致癌物[1-2]。隨著食品安全管控越來(lái)越嚴(yán)格，世界各國(guó)對(duì)AFTs制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中日本要求最為嚴(yán)格：所有食品中均不能檢出黃曲霉毒素;歐盟對(duì)不同類食物中AFB1的限量值為2.0～8.0 μg/kg;我國(guó)的限量標(biāo)準(zhǔn)[4]要求谷物及其制品、糧油中AFB1的限量值為5.0～20.0 μg/kg。

黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[5]主要為高效液相色譜法[6]、同位素稀釋液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[9]。這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，質(zhì)譜法盡管靈敏度高，但是往往需要經(jīng)過(guò)繁瑣的前處理減少機(jī)制干擾;酶聯(lián)免疫分析耗時(shí)短，但抗體價(jià)格高、種類少，假陽(yáng)性檢出率高等。植物油中的黃曲霉毒素由于濃度低且基質(zhì)里含有的油脂、脂肪酸和色素等，會(huì)對(duì)測(cè)定造成嚴(yán)重干擾，降低分析的靈敏度[10]。因此，亟需建立一種同時(shí)檢測(cè)和分離富集黃曲霉毒素的樣品前處理方法。

磁性固相萃?。∕SPE）技術(shù)[11]是一種快速高效的前處理方法。本研究在羧基化多壁碳納米管的基礎(chǔ)上合成MWCNTs-Fe3O4磁性納米顆粒，利用多壁碳納米管的π-π相互作用、氫鍵相互作用等作用力使黃曲霉毒素AFB1從基質(zhì)中分離和富集。該法具有快速、簡(jiǎn)便、回收率高等特點(diǎn)，能夠滿足植物油中AFB1的檢測(cè)分析，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

超高壓高效液相色譜儀（日本島津公司）;AB SCIEX-API3200 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）;Thermo Helios G4CX電子顯微鏡（美國(guó)Thermo Scientific 公司）;聚焦離子束納米制備和加工系統(tǒng)（德國(guó)CarlZeiss公司）;振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）;真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;加熱磁力攪拌器（德國(guó)IKA公司）;多壁碳納米管（—COOH，20～30 nm，>98%，中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司）;甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二氯甲烷（色譜純，美國(guó) Thermo Fisher公司）;FeCl3·6H2O，F(xiàn)eCl2·4H2O、NaOH（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;黃曲霉毒素AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（青島普瑞邦生物工程有限公司）。

1.2 WCNTs-Fe3O4的制備

采用共沉淀法制備WCNTs-Fe3O：稱取5.2 g FeCl3·6H2O和2.0 g FeCl2·4H2O溶于25 mL除氧水中，加入1.0 mL 12 mol/L HCl加熱溶解，配置成Fe3+溶液備用。于250 mL 1.5 mol/L NaOH溶液加入2.0 g羧基化多壁碳納米管（WCNTs-COOH），轉(zhuǎn)入三頸燒瓶中，于85 ℃ 水?。∟2保護(hù)）加熱超聲攪拌30 min后，將Fe3+溶液逐滴加入生成MWCNTs-Fe3O4，用強(qiáng)磁鐵吸附生成的WCNTs-Fe3O4納米顆粒，棄去反應(yīng)液，然后用去離子水清洗直至pH=7.0。最后將此磁性吸附材料于50 ℃真空干燥24 h，備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作配制：分別配制上機(jī)濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅡ十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（2.0 mm×75 mm×2.2 μm）;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣體積：5.0 μL;流速：0.30 mL/min;流動(dòng)相采用不同比例的乙腈和0.1 %甲酸水溶液。梯度洗脫條件：0.01 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸）為2∶98;5.00～5.50 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸）為75∶25;8.00 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸）為2∶98。

1.5 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：電噴霧電壓：5500.0 V，離子源溫度：550 ℃，氣簾氣壓力55 psi，霧化氣壓力55 psi，加熱氣壓力55 psi。電噴霧離子源（ESI），采用正離子MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描， AFB1母離子及子離子見(jiàn)表1。

1.6 樣品前處理

稱取植物油5.0 g，加入2.0 mL正已烷，混勻3 min后，再加入10.0 mL pH為3.0體積分?jǐn)?shù)為12.5%乙腈水溶液，渦旋混勻，加入15.0 mg MWCNTs-Fe3O4，低速振蕩吸附5 min，用強(qiáng)磁鐵吸附磁性吸附劑，棄去上清液。加入1.0 mL乙腈振蕩洗脫5 min。洗脫液氮吹近干，用甲醇定容至1.0 mL，HPLC-MS/MS上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附劑MWCNTs-Fe3O4掃描電鏡測(cè)試

將1.2所制備的MWCNTs-Fe3O4納米顆粒經(jīng)電鏡掃描測(cè)定如圖1所示，由圖可知，該磁性納米顆形狀為球形，平均粒徑為38 nm。

2.2 磁性固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑的選擇

黃曲霉毒素AFB1屬于中等極性化合物，易溶于甲醇、乙腈和三氯甲烷等有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了12.5%甲醇—水、甲醇、12.5%乙腈—水、乙腈作為萃取劑時(shí)的萃取效果，萃取效率對(duì)回收率的影響見(jiàn)圖2。由圖可知，12.5%的乙腈-水提取效果最好，可能原因是適量的水能增大萃取劑在樣品中的滲透能力，甲醇和乙腈濃度過(guò)高時(shí)，萃取劑與吸附劑間的競(jìng)爭(zhēng)加強(qiáng)，造成回收率降低。因此本實(shí)驗(yàn)選擇12.5%的乙腈—水體系作為萃取劑。

2.2.2 萃取劑pH的影響

AFB1在酸性條件下能穩(wěn)定存在，因此需要對(duì)萃取劑的酸度選擇進(jìn)行優(yōu)化，以保證萃取效率。本實(shí)驗(yàn)將12.5%乙腈—水萃取劑的pH分別調(diào)至1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，pH對(duì)回收率的影響見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，pH在3.0到5.0時(shí)，AFB1的回收率均能達(dá)到80%以上， pH 為3.0時(shí)回收率最高。pH值繼續(xù)增大，回收率開(kāi)始降低，原因可能由于堿性增強(qiáng)使部分AFB1分解造成的。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇萃取劑的pH為3.0。

2.2.3 吸附時(shí)間的影響

在pH=3.0的12.5% 乙腈—水作為萃取劑的條件下，考察了吸附時(shí)間分別為1，3，5，10，15 min時(shí)對(duì)AFB1回收率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，1 min至5min 時(shí)，AFB1的回收率隨著時(shí)間增加而增大，回收率達(dá)到85%～95%間，基本達(dá)到吸附平衡。5min之后，AFB1的回收率基本不再變化。因此，吸附時(shí)間選擇為5 min。

2.2.4MWCNTs-Fe3O4吸附劑用量的影響

吸附劑的用量也對(duì)萃取效率產(chǎn)生顯著影響。本實(shí)驗(yàn)分別考察了吸附劑用量為1.0，5.0，15.0，20.0， 30.0 mg時(shí)的萃取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，隨著吸附用量的增加，AFB1的回收率逐漸增大，直至達(dá)到吸附平衡，此時(shí)吸附劑用量為15.0 mg。隨著吸附劑用量繼續(xù)增加，AFB1的回收率有下降的趨勢(shì)，其原因可能是由于吸附劑用量大，容易造成洗脫階段洗脫不完全。因此，吸附劑用量選擇15.0 mg。

2.2.5 洗脫劑的選擇

洗脫劑的極性直接影響洗脫效率。本實(shí)驗(yàn)選擇了5種極性不同的洗脫劑考察洗脫效果，分別為：乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮。洗脫效果見(jiàn)圖6。洗脫效果為乙腈>甲醇>乙酸乙酯>二氯甲烷>丙酮。主要原因是黃曲霉毒素AFB1為中等極性化合物，洗脫劑極性越大，洗脫能力越強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為洗脫劑。

2.2.6 洗脫時(shí)間的影響

適合的洗脫時(shí)間不僅能提高回收率，也可以縮短前處理時(shí)間。洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成回收率下降。實(shí)驗(yàn)分別考察了洗脫時(shí)間為1，3，5，10，15 min時(shí)對(duì)AFB1回收率的影響。由圖7可知，5 min時(shí)，洗脫效果最好，AFB1的回收率最大。繼續(xù)增加洗脫時(shí)間會(huì)導(dǎo)致部分已經(jīng)洗脫的AFB1重新被吸附，造成回收率降低。因此，洗脫時(shí)間選擇5 min。

3 方法評(píng)價(jià)

3.1 線性范圍

配制濃度分為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖8。以質(zhì)譜峰面積為縱坐標(biāo)，AFB1濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸，回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2，由表中數(shù)據(jù)可知，AFB1 在0.5～50.0μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9987。以3倍信噪比（S/N= 3）對(duì)應(yīng)的濃度為方法檢出限（ LOD） ，10 倍信噪比（S/N=10）對(duì)應(yīng)的濃度為定量限（ LOQ） ，檢出限為0.01 μg/kg，定量限為0.04 μg/kg。

3.2 方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度

選用食用調(diào)和油、花生油和玉米油的空白樣品作為基質(zhì)，分別添加3個(gè)不同水平的AFB1，按照1.6方法進(jìn)行樣品前處理，利用HPLC-MS/MS平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），具體結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 方法驗(yàn)證

隨機(jī)購(gòu)買市場(chǎng)銷售的食用油樣品10份（種類包含食用調(diào)和油、玉米油和花生油）進(jìn)行檢測(cè)，檢出1份花生油樣品含AFB1，含量為5.88 μg/kg，低于我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中規(guī)定的花生油中AFB1的限量值20 μg/kg。其余9份樣品中AFB1未檢出。

4 結(jié)論

本文采用共沉淀法制備了磁性固相萃取吸附劑MWCNTs-Fe3O4，建立了磁性固相萃取結(jié)合HPLC-MS/MS檢測(cè)食用植物油中黃曲霉毒素AFB1的檢測(cè)方法。該前處理方法操作簡(jiǎn)便，減少了有毒有害有機(jī)試劑的使用，同時(shí)由于磁性固相萃取的分離和富集作用，降低了油脂樣品中脂溶性物質(zhì)、基質(zhì)、雜質(zhì)等干擾因素，使方法的靈敏度和精密度得到提高，能夠滿足植物油中黃曲霉毒素AFB1的檢測(cè)要求。

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