杜榮起，任君，喬啟，張晴，劉燕霏，楊建德

（天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

大腸桿菌（E.coli）在自然界中廣泛存在，在1885年被德國細(xì)菌學(xué)家Escherich分離出來[1]。大腸桿菌不僅是寄生在人體、動物體胃腸道的優(yōu)勢菌群，同時能引起動物和人類的感染，其腸外感染與毒力因子有關(guān)。溶血素是腸外感染較重要的致病因子，按照抗原的成分不同可分α溶血、β溶血、γ溶血3種，這3種溶血素可作為疾病嚴(yán)重程度評價的準(zhǔn)則[2]，溶血素可作用于紅細(xì)胞、血小板，破壞溶酶體，導(dǎo)致組織缺血性壞死[3]。在獸醫(yī)臨床中，溶血性大腸桿菌可引起豬、犬、牛、鹿、水貂、雞、鴨的敗血癥、膿血癥和腹瀉[4]。在醫(yī)學(xué)臨床中，溶血性大腸桿菌可引起敗血癥、腹膜炎、沙眼和尿道感染[5]。隨著人們生活水平的提高，飼養(yǎng)寵物成為人們享受生活的一種方式。而伴侶動物可攜帶多種人獸共患病，對人類的健康構(gòu)成潛在的威脅。本文對兩株不同溶血性大腸桿菌進(jìn)行分離與鑒定，以期為治療此類相關(guān)感染提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源

某動物醫(yī)院，病例1為2018年10月18日收治的4歲齡母犬，病例2為2018年11月6日收治的9歲齡母犬，均患有子宮蓄膿。

1.2 試劑

1.2.1 培養(yǎng)基：麥康凱培養(yǎng)基、血液平板培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.2 腸桿菌科生化鑒定管：葡萄糖、麥芽糖、尿素等，購自杭州生物研究所。

1.2.3 藥敏試劑片：氨曲南、頭孢噻肟、哌拉西林等，購自杭州微生物試劑公司。

1.2.4 分離菌株16S rRNA 基因序列PCR擴增，上游引物 5＇-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3＇、下游引物5＇-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，dNTP和Taq酶均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2 方法

2.1 病原菌的采集與培養(yǎng)

分別從手術(shù)切除的犬子宮中無菌抽取適量膿汁，接種于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱和血平板培養(yǎng)基上，并進(jìn)行劃線培養(yǎng)，37 ℃培育18 h，挑出單個優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

2.2 涂片染色鏡檢

分別挑取分離純化的單個菌落，涂片、革蘭氏染色觀察。

2.3 生化試驗

分別挑取純化的單個菌落，無菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，接種于腸桿菌科生化鑒定管，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，對比分析記錄結(jié)果。

2.4 藥敏試驗

分別挑取純化的單個菌落無菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后得到培養(yǎng)菌液（3×109CFU/mL）。取100 μmL菌液接種于普通營養(yǎng)瓊脂表面，用“T”型涂布棒均勻涂布，將藥敏片均勻等距貼在涂布后的培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察結(jié)果。

2.5 分離菌株16S rRNA基因序列的PCR擴增

按7F1540R（細(xì)菌）試劑盒操作提取2例細(xì)菌的DNA。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，預(yù)計擴增片段為1 500 bp。在94 ℃條件下預(yù)變性4 min，經(jīng)30次循環(huán)，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，保持72 ℃延伸10 min，最后以4 ℃到PCR擴增結(jié)束。

2.6 分離菌株16S rRNA基因序列同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測定的基因序列在NCBI上使用BLAST進(jìn)行比對，選取與分離菌株相近的序列，在 DNAstar軟件上進(jìn)行同源性對比、分析并構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果

3.1 分離純化培養(yǎng)后菌落形態(tài)特征

病料1分離菌（1 018）在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色菌落，見圖1；在血液平板培養(yǎng)基上呈灰白色，菌落周圍形成透明的β溶血環(huán)見圖2。病料2分離菌（1 106）在麥康凱培養(yǎng)基上呈磚紅色菌落，見圖3；在血液平板培養(yǎng)基上呈灰黑色，菌落周圍形成1～2 mm草綠色溶血環(huán)，見圖4。

圖1 1 018 麥康凱培養(yǎng)基菌落形態(tài)

圖3 1 106 麥康凱培養(yǎng)基菌落形態(tài)

圖4 1 106 血平板菌落形態(tài)

3.2 涂片染色鏡檢

1 018、1 106病原菌在油鏡下可看到較密集的短桿狀革蘭氏染色陰性桿菌（圖5）。

圖5 革蘭氏染色結(jié)果

3.3 生化試驗結(jié)果

對1 018、1 106兩株病原菌進(jìn)行生化試驗，二者均能分解葡萄糖、甘露醇，不能分解麥芽糖、蛋白胨水，不能利用尿素、枸櫞酸鹽、葡萄糖磷酸鹽，不產(chǎn)生硫化氫；1 018半固體瓊脂反應(yīng)陰性，不具有運動性，能分解蔗糖、乳糖。1 106半固體瓊脂反應(yīng)陽性，具有運動性，能分解蔗糖、乳糖，結(jié)果見表1。

表1 兩株分離菌生化試驗結(jié)果

3.4 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗，按照CLSL藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)分為耐藥（R）、中度敏感（I）、高度敏感（S），結(jié)果見表2。

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果

3.5 分離菌16S rRNA基因序列PCR擴增

得到的2株菌經(jīng)PCR擴增測序，16S rRNA 基因序列電泳后的基因擴增片段長度為1 475和1 481 bp，1 018基因登錄號為MK729002，1 106基因登錄號為MK729003。

3.6 分離菌株16S rRNA基因序列同源性比對

經(jīng)基因測序獲得的基因序列在 NCBI上進(jìn)行BLAST比對，選取5株相近參考序列，將分離菌16S rRNA 基因序列經(jīng)DNAstar軟件中的Megalign與該5株16S rRNA 基因序列進(jìn)行同源性比對。結(jié)果，1 018、1 106的16S rRNA 基因序列與溶血性大腸桿菌的 16S rRNA 基因序列的同源性均在97%以上，見圖6。

圖6 分離菌16S rRNA 基因序列與參考序列同源性比對結(jié)果

3.7 分離菌株16S rRNA基因序列與參考序列構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果

采用DNAStar中的Megalign將分離菌16S rRNA基因序列與參考序列進(jìn)行比較分析，經(jīng)Neighbor-Joining法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。經(jīng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，1 018與CP016358的同源性高達(dá)100%；1 016與NR-114042的同源性高達(dá)99.7%（圖7）。

圖7 分離菌16S rRNA 基因與參考序列構(gòu)建進(jìn)化樹分析

4 討論

此次從犬子宮蓄膿中分離出的2株細(xì)菌，在培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)與染色鏡檢的結(jié)果與何煥學(xué)等提到的溶血性大腸桿菌培養(yǎng)特征與革蘭氏染色鏡檢結(jié)果一致[4]。生化試驗結(jié)果與楊萬秋報道的兔溶血性大腸桿菌分離鑒定中的生化試驗結(jié)果基本符合[6]。分離菌株 16S rRNA的基因序列和 NCBI中參考大腸桿菌16S rRNA 基因同源性達(dá)99.7%以上，綜合分析2株病原菌的生理生化特 征[7-8]，確定為α、β溶血性大腸桿菌。根據(jù)藥敏結(jié)果分析表明，β溶血性大腸桿菌對卡那霉素、鏈霉素、頭孢噻吩、氧氟沙星、麥迪霉素、頭孢呋辛、妥布霉素耐藥，α溶血性大腸桿菌對麥迪霉素耐藥，可見這兩株細(xì)菌在耐藥性方面存在一些差異，分析原因可能與動物使用過抗生素類藥物有關(guān)。β溶血性菌株的耐藥性明顯高于α溶血性菌株，這可能與病原菌的致病力強弱有關(guān)，形成β溶血的病原菌毒力明顯高于α溶血的病原菌，趙新書等的研究結(jié)果表明，病原菌產(chǎn)生耐藥性和多重耐藥最重要的是與長期過度使用抗生素類藥物有著密不可分的關(guān)系[9]。

犬子宮蓄膿是犬子宮有大量膿汁聚集，伴有增生與病菌感染的產(chǎn)科疾病[10]，是獸醫(yī)臨床上常見的疾病。該病的引發(fā)原因與動物的產(chǎn)后感染、內(nèi)分泌代謝紊亂以及病原菌感染有關(guān)，主要的致病菌為大腸桿菌[11]，此兩例犬子宮蓄膿是犬在發(fā)情期時在激素和孕酮的作用下，產(chǎn)生大量溶血性大腸桿菌造成的，同時大腸桿菌也是敗血癥、腹膜炎、心包炎以及豬水腫病的罪魁禍?zhǔn)譡12-13]。化膿性疾病病灶區(qū)作為人獸共患病的傳染源所產(chǎn)生的疾病也對人類的健康構(gòu)成了潛在的威脅。此次研究進(jìn)一步明確溶血性大腸桿菌的生物學(xué)特性，為今后溶血性大腸桿菌疾病的發(fā)生和預(yù)防提供一定的理論基礎(chǔ)，為防治化膿性疾病所引起的人畜共患病提供參考依據(jù)。