郁萬文，韓 晉，曹福亮, 2*，汪貴斌

(1.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014)

近年來，銀杏葉的開發(fā)應(yīng)用價值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過銀杏果，因此世界范圍內(nèi)掀起了葉用銀杏種植及銀杏葉開發(fā)應(yīng)用研究的熱潮[1]。目前從銀杏葉提取物中分離的黃酮類化合物主要為黃酮醇及其苷類、雙黃酮、兒茶素三類，其中黃酮醇及其苷類中的槲皮素、山柰素、異鼠李素是銀杏葉制劑質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一，占黃酮類化合物的95%以上，能擴張血管、清除自由基、抗動脈硬化等，是治療心腦血管疾病的主要有效成分[2]。高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)銀杏葉原料的生產(chǎn)受到銀杏葉生長、采收和加工過程中諸多因素的影響，包括品種、性別、樹齡、產(chǎn)地、采收時期等[2-10]。中國擁有大量的銀杏資源，積極開展葉用銀杏種質(zhì)資源研究，選育并推廣有效成分含量高且穩(wěn)定的種質(zhì)，是葉用銀杏種植中亟待解決的問題[2-3]。選育葉用銀杏良種時，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為應(yīng)首先考慮葉中黃酮和萜內(nèi)酯含量，其次才是產(chǎn)量[3,11]。銀杏葉中黃酮含量在很大程度上受基因控制[2,12]，即種質(zhì)是影響銀杏葉中有效成分量的重要因素之一，甚至是決定黃酮含量的關(guān)鍵因素。另外，葉中黃酮和萜內(nèi)酯含量和產(chǎn)量又受到生育期、采收時間的顯著影響，如4月是葉中總黃酮含量最高的月份[13]，但葉產(chǎn)量小；秋季葉尚綠時( 8～10月) 總黃酮含量較低，但葉產(chǎn)量大[14]。對于何時采收合適，說法不一，從 4 月到 11 月，都有可作適采期的結(jié)論[2]。本研究以篩選春茶用和黃酮提取用的葉用種質(zhì)為目的，開展了生育前期和生育后期葉中高黃酮含量雌株種質(zhì)的定向和聯(lián)合篩選，以期為春茶用和黃酮提取用葉用銀杏的定向培育提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

參照陳學(xué)森等、江德安等的研究結(jié)果[14-15]，對南京林業(yè)大學(xué)于2002、2005年引種的2批銀杏中雌株進行了連續(xù)兩年的物候觀察和標(biāo)準(zhǔn)枝上葉形態(tài)及產(chǎn)量統(tǒng)計，初選出了46株葉大而厚，葉量大的雌株。參照林琰等的研究結(jié)果[16]及趙學(xué)農(nóng)等制茶采摘時間[17]，分別于2018年9月上旬、2019年4月上旬采集供試的28個單株的向陽樹冠外圍葉片，裝于信封中，于105℃烘箱內(nèi)殺青15 min，60℃烘至恒重，粉碎過篩后備用。

1.2 方法

1.2.1 銀杏葉提取液制備

參考《中國藥典》中銀杏葉黃酮提取方法，略有改動[18]。稱取粉碎后的葉粉1.000 g，包于直徑12.5 cm的脫脂濾紙中，并用脫脂棉線捆綁成柱狀的濾紙包。先用100 mL的石油醚于80℃水浴條件下在索氏提取器中對裝有銀杏葉粉的濾紙包除雜2.5 h，取出后于60℃烘箱中烘至恒重。再將除雜后的濾紙包用100 mL的分析純甲醇于80℃水浴條件下索氏提取4.5 h。減壓濃縮后，殘渣用色譜甲醇和25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL，加熱回流30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶用色譜甲醇定容至刻度，搖勻即得供試樣品制備液。每個樣品重復(fù)3次。過0.22 μm有機微孔濾膜，濾液供HPLC測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6 mm×150 cm，5 μm)；流動相：0.1%磷酸溶液(54∶46)；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。

總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰酚含量+異鼠李素含量)×2.51

以黃酮苷元(槲皮素、山奈酚、異鼠李素)對照品濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到如下線性回歸方程(表1)。

黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高效液相色譜圖如圖1所示。

表1 銀杏黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用DPS7.04和Excel 2016統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和方差分析，運用Turky法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 生育初期銀杏雌株葉中黃酮含量差異分析

生育初期銀杏雌株葉中黃酮含量見表2。由該表可知，生育初期的銀杏雌株葉中黃酮3個主要組分含量兩兩差異極顯著，且山奈酚>槲皮素>異鼠李素。方差分析表明，各銀杏雌株間的葉中總黃酮及3個主要組分含量均差異極顯著(P<0.01)，且存在較大變異，變異系數(shù)范圍為21.06%～33.35%，表現(xiàn)為CV異鼠李素>CV槲皮素>CV山奈酚>CV總黃酮。供試雌株生育前期葉中槲皮素含量變幅為0.933～3.120 mg/g，含量高于均值2.013 mg/g的單株有22個，分別為42、30、46、48、47、44、45、19、43、51、50、32、33、49、29、13、35、16、36、11、9、15；山奈酚含量變幅為1.767～5.747 mg/g，含量高于均值3.534 mg/g的單株有21個，分別為48、41、15、17、50、49、21、45、38、43、39、30、29、18、9、47、37、46、35、51、27；異鼠李素含量變幅為0.855～2.717 mg/g，含量高于均值1.669 mg/g的單株有25 個，分別為43、46、29、50、44、49、42、30、37、26、47、48、33、32、36、51、21、45、27、15、35、17、56、9、20；總黃酮含量變幅為10.173～26.653 mg/g，含量高于均值18.111 mg/g的單株有20個，分別為48、50、46、30、43、49、15、29、42、47、45、44、21、51、17、37、9、35、18、32。參照李衛(wèi)星等的方法[19]，設(shè)定某單株槲皮素、山奈酚、異鼠李素、總黃酮含量均高于所有供試單株的均值作為葉用株系入選標(biāo)準(zhǔn)，共有12單株入選，分別是9、15、29、30、43、45、46、47、48、49、50、51。

表2 生育初期銀杏雌株葉中黃酮及其組分含量

續(xù)表2 生育初期銀杏雌株葉中黃酮及其組分含量

注：表中同列不同小寫英文字母表示在5%水平上差異顯著；同行不同大寫英文字母表示在1%水平上差異顯著。

2.2 生育后期銀杏雌株葉中黃酮含量差異分析

生育后期銀杏雌株葉中黃酮含量見表3。由該表可知，生育后期的銀杏雌株葉中槲皮素與山奈酚含量差異不顯著(P>0.05)，但兩者均極顯著高于異鼠李素(P<0.01)。方差分析表明，單株間的葉中總黃酮及3個主要組分含量均存在極顯著性差異(P<0.01)，且存在較大變異，變異系數(shù)范圍為29.11%～50.13%，表現(xiàn)為CV槲皮素>CV異鼠李素>CV總黃酮>CV山奈酚。供試雌株生育后期葉中槲皮素含量變幅為0.344～2.066 mg/g，含量高于均值0.873 mg/g的單株有17個，分別為42、46、47、44、45、19、50、29、43、48、33、34、56、30、32、49、13；山奈酚含量的變幅為0.389～1.515 mg/g，含量高于均值0.848 mg/g的單株有23個，分別為48、41、46、45、42、43、47、56、50、17、15、39、44、29、33、38、51、9、25、21、49、13、55；異鼠李素含量的變幅為0.187～1.086 mg/g，含量高于均值0.485 mg/g的單株有18個，分別為46、44、50、42、43、47、29、34、45、16、51、56、33、48、20、49、30、13；總黃酮含量的變幅為2.412～10.876 mg/g，含量高于均值5.537 mg/g的單株有18個，分別為46、42、47、44、45、50、43、48、29、19、56、33、34、51、16、49、30、13。進一步設(shè)定某單株槲皮素、山奈酚、異鼠李素、總黃酮含量均高于所有供試單株的均值作為葉用株系入選標(biāo)準(zhǔn)，共有11個單株入選，分別是29、33、42、43、44、45、46、47、48、50、56。

表3 生育后期銀杏雌株葉中黃酮及其組分含量

續(xù)表3 生育后期銀杏雌株葉中黃酮及其組分含量

注：表中同列不同小寫英文字母表示在5%水平上差異顯著；同行不同大寫英文字母表示在1%水平上差異顯著。

2.3 生育前期和生育后期銀杏葉中黃酮及其組分含量相關(guān)性

生育初期和生育后期銀杏雌株葉中黃酮含量及其組分含量相關(guān)性見表4。由該表可知，生育前期和生育后期的葉中總黃酮含量分別與各自時期的槲皮素、山奈酚、異鼠李素3個組分含量均達(dá)到極顯著高度正相關(guān)(P<0.01)；生育前期的葉中異鼠李素含量與槲皮素呈極顯著高度正相關(guān)，與山奈酚呈極顯著中度正相關(guān)，山奈酚與槲皮素相關(guān)性不顯著；生育后期的葉中異鼠李素含量與槲皮素呈極顯著高度正相關(guān)，山奈酚與異鼠李素、槲皮素呈極顯著中度正相關(guān)。值得注意的是，生育前期和生育后期間葉中總黃酮及其組分的含量均呈極顯著的高度正相關(guān)(R槲皮素=0.85**，R山奈酚=0.73**，R異鼠李素=0.76**，R總黃酮=0.72**)，這為開展兩個生育期高黃酮種質(zhì)資源的聯(lián)合篩選提供了數(shù)據(jù)支撐。

表4 兩個生育期銀杏雄株葉中總黃酮及其組分含量相關(guān)性

注：*p<0.05，**p<0.01

2.3 銀杏雌株種質(zhì)定向篩選

2.3.1 以銀杏茶為目標(biāo)的葉用銀杏雌株種質(zhì)篩選

以46個銀杏雌株生育前期葉中總黃酮及槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量利用DPS軟件采用歐式距離和類平均法(UPGMA)進行聚類。根據(jù)距離系數(shù)的大小，結(jié)合圖2中明顯的聚類特征，如圖2和表5所示，將所有單株分成了3類。第Ⅰ類，包含8個單株，表現(xiàn)為總黃酮及槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量為3類中最低；第Ⅱ類，包含26個單株，其葉中總黃酮及山奈酚、異鼠李素含量處于中等水平，介于第Ⅰ類和第Ⅲ類之間；第Ⅲ類包含12個單株，其葉中總黃酮及槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量均較高。所以，上述第Ⅲ類(15、29、30、42、43、44、45、46、47、48、49、50)可作為用于開發(fā)銀杏春茶的葉用種質(zhì)進行區(qū)試或推廣。

表5 基于生育前期葉中總黃酮及其組分含量的雌株分類

圖2 基于生育前期葉中總黃酮及組分含量的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of total flavonoids and their components in leaves at early growth stage

2.3.2 以銀杏黃酮提取為目標(biāo)的葉用銀杏種質(zhì)篩選

以46個銀杏雌株生育后期葉中總黃酮及槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量利用DPS軟件采用歐式距離和類平均法(UPGMA)進行聚類。根據(jù)距離系數(shù)的大小，結(jié)合圖3中明顯的聚類特征，如圖3和表6所示，將所有單株分成了4類。第Ⅰ類，包含16個單株，表現(xiàn)為總黃酮及槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量均值為4類中最低；第Ⅱ類，包含22個單株，其葉中總黃酮及槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量均值僅高于第Ⅰ類；第Ⅲ類包括6個，其葉中總黃酮及槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量僅低于第Ⅳ類；第Ⅳ類包含2個單株，表現(xiàn)為總黃酮及槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量均值為4類最高。綜上所述，用于黃酮提取的葉用銀杏種質(zhì)進行區(qū)試或推廣時應(yīng)首選第Ⅳ類(42、46)，第Ⅲ類(43、44、45、47、48、50)次之。

表6 基于生育后期葉中總黃酮及其組分含量的雌株分類

2.3.3 兼用型葉用銀杏種質(zhì)篩選

以46個銀杏雌株生育前期和生育后期葉中的總黃酮含量利用DPS軟件采用歐式距離和類平均法(UPGMA)進行聚類。根據(jù)距離系數(shù)的大小，結(jié)合圖4的聚類特征，如圖4和表7所示，同時為篩選出兩個生育期葉中總黃酮含量均高的單株，將所有單株細(xì)分成了6類。第Ⅰ類，僅含1個單株，表現(xiàn)為兩個生育期葉中總黃酮含量為6類中最低；第Ⅱ類，包含11個單株，其兩個生育期葉中總黃酮含量均值僅高于第Ⅰ類；第Ⅲ類包含22個單株，其兩個生育期葉中總黃酮含量僅高于第Ⅰ、Ⅱ類；第Ⅳ類包含3個單株，生育前期葉中總黃酮含量較高，而生育后期的總黃酮含量中等；第Ⅴ類包含8個單株，第Ⅵ類包含1個單株，這兩類在生育前期和后期的總黃酮含量均較高。所以，上述第Ⅴ類(29、42、43、44、45、46、47、50)和第Ⅵ類(48)，可作為銀杏春茶及黃酮提取的兼用型葉用銀杏種質(zhì)進行區(qū)試或推廣。

圖3 基于生育后期葉中總黃酮及組分含量的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of total flavonoids and components in leaves at late growth stage

3 結(jié)論與討論

近年研究表明，有關(guān)高黃酮含量的春茶用和黃酮提取用銀杏專用和兼用種質(zhì)選育研究滯后，為提高銀杏春茶中黃酮含量及黃酮提取效率，增加銀杏資源附加值，開展高黃酮含量的專用和兼用種質(zhì)選育，對銀杏春茶和黃酮提取的研制生產(chǎn)和市場開發(fā)意義重大。

本研究表明，生育初期的銀杏雌株葉中黃酮組分含量差異極顯著，且山奈酚>槲皮素>異鼠李素；生育后期的葉中槲皮素與山奈酚含量差異不顯著，但兩者均顯著高于異鼠李素。上述結(jié)果說明，不同生育期葉中黃酮組分的含量和比例發(fā)生變化，且生育初期的黃酮及其組分含量顯著高于生育后期，相差1.31～3.17倍。各銀杏雌株間的葉中總黃酮及各組分含量均存在顯著差異和較大的變異系數(shù)，與戴余軍等[7]、王弘等[20]、劉叔倩等[8]的研究結(jié)果一致，這為開展葉用銀杏種質(zhì)的篩選提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。參照李衛(wèi)星等的方法[19]，設(shè)定某單株槲皮素、山奈酚、異鼠李素、總黃酮含量均高于所有供試單株的均值作為葉用單株入選標(biāo)準(zhǔn)，基于生育前期的黃酮及組分含量入選的單株有12個，分別是9、15、29、30、43、45、46、47、48、49、50、51；基于生育后期的黃酮及組分含量共有11個單株入選，分別是29、33、42、43、44、45、46、47、48、50、56。

圖4 基于生育前期和生育后期葉中總黃酮含量的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of total flavonoids in leaves of early and late growth stages

表7 基于生育前期和后期的葉中總黃酮含量的單株分類

銀杏葉提取物中的黃酮類化合物主要為黃酮醇及其苷類、雙黃酮、兒茶素三類，其中黃酮醇及其苷類中的槲皮素、山奈酚、異鼠李素是銀杏葉制劑質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一，占黃酮類化合物的95%以上[2]。研究表明，生育前期和生育后期的葉中總黃酮含量分別與各自生育時期的槲皮素、山奈酚、異鼠李素3個組分含量均呈極顯著高度正相關(guān)，是合乎常理的，因為總黃酮含量是各種組分含量的總和，每種組分的增減必然引起總黃酮含量的增減。通過3個主要組分相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，生育前期和生育后期的葉中異鼠李素含量與槲皮素呈極顯著高度正相關(guān)，這種相關(guān)關(guān)系是我們所期望的，可能與合成路徑中的黃酮組分受相同關(guān)鍵酶或合成前提物的調(diào)控有關(guān)；而生育前期葉中山奈酚與槲皮素相關(guān)性不顯著，但生育后期葉中山奈酚與槲皮素呈極顯著中度正相關(guān)，造成上述相關(guān)關(guān)系的原因可能有兩種，其一可能與來自不同合成支路的黃酮組分受各自關(guān)鍵酶的調(diào)控有關(guān)，其二可能是不同發(fā)育時期葉中黃酮代謝對特定發(fā)育時期的生理響應(yīng)。值得注意的是，生育前期和生育后期間葉中總黃酮及其組分的含量均呈極顯著的高度正相關(guān)，這為開展兩個生育期高黃酮種質(zhì)資源的聯(lián)合篩選提供了數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)于銀杏葉用品種的選擇還沒有規(guī)范系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)在大部分的葉用選擇標(biāo)準(zhǔn)，一般是以葉形態(tài)指標(biāo)、產(chǎn)葉量、有效成分黃酮和萜內(nèi)酯含量等來篩選優(yōu)質(zhì)葉用種質(zhì)。在確定葉用銀杏品種定向選擇目標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)時，首先需考慮葉中藥用有效成分含量，其次才是產(chǎn)量性狀[14]，春茶用、黃酮提取用及兼用型銀杏種質(zhì)的篩選也是如此。筆者基于46 個銀杏單株生育前期葉中的總黃酮及槲皮素、山奈酚、異鼠李素3個組分含量的聚類分析，篩選出了12個葉中黃酮及組分含量均較高的單株，即15、29、30、42、43、44、45、46、47、49、50、48，可作為制備銀杏春茶用種質(zhì)進行區(qū)試或推廣；基于生育后期葉中總黃酮及3個主要組分含量的聚類分析，篩選出了8個葉中黃酮及組分含量均較高的單株，分別是42、46、43、44、45、47、48、50，可作為黃酮提取用銀杏種質(zhì)進行區(qū)試或推廣；基于生育前期和生育后期葉中總黃酮含量的聚類分析，篩選出了9個在生育前期和生育后期葉中黃酮均較高的單株，分別是29、42、43、44、45、46、47、50、48，可作為銀杏春茶及黃酮提取的兼用型葉用銀杏種質(zhì)進行區(qū)試或推廣。