陳少鵬 崔亞靜 侯婉晴 莊倩倩 劉穎 呂偉偉

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林省·吉林市，132101) (吉林市林業(yè)科學(xué)研究院)

園林植物是維護(hù)城市生態(tài)平衡的重要一環(huán)，其生態(tài)效益在空氣污染日益嚴(yán)重的今天尤顯重要?？諝庵械奈⑸锸且鹑撕粑兰膊〉闹饕蛑籟1]，很多園林植物能通過(guò)釋放揮發(fā)性有機(jī)物來(lái)抑制周?chē)⑸锏纳L(zhǎng)[2]。通常，植物葉片直接與空氣相接觸，面積巨大，因此植物葉片上常吸附著大量的微生物。有研究表明，土壤和葉片是所有地點(diǎn)近地表大氣中重要的微生物來(lái)源[3]，但是對(duì)于植物葉面微生物的研究還相對(duì)較少[4-5]。一些學(xué)者對(duì)煙草(Nicotianatabacum)[6]、芒果(Mangiferaindica)[7]、紅樹(shù)(Lumnitzeralittorea)[8]等葉面微生物的種類(lèi)、多樣性等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同植物葉片表面有著不同的微生物種群，且對(duì)表面吸附的菌種具有一定的選擇性。現(xiàn)有的研究手段和重點(diǎn)多集中于植物浸提液對(duì)真菌、細(xì)菌的抑制作用[9-10]，或者是植物對(duì)周?chē)諝庵形⑸锏挠绊慬11-12]。但是人工提取植物浸出液的方法具有很大的局限性，而因空氣的流通性則很難確定是否是植物影響空氣中的微生物分布，因此這些方法并不能直接說(shuō)明植物在自然狀態(tài)下的除菌能力。所以，直接對(duì)植物葉片表面吸附的微生物進(jìn)行比對(duì)研究最能夠說(shuō)明植物葉片對(duì)微生物群落的影響。目前，植物葉片或者根系菌群的分離和鑒定主要采用瓊脂平板擴(kuò)散、濾紙貼片等方法[13-14]，而這些方法均有費(fèi)時(shí)、低效和不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)，同時(shí)菌的分離和鑒定也較為困難。近些年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用序列分析、熒光定量PCR(RT-PCR)等技術(shù)對(duì)微生物的種群進(jìn)行分析鑒定越來(lái)越受到重視。一些研究者利用RT-PCR、DNA指紋圖譜和16S rDNA克隆文庫(kù)的方法來(lái)檢測(cè)空氣中細(xì)菌的基因結(jié)構(gòu)和微生物多樣性[15-17]。本研究以從加拿大引種的東部白松(Pinusstrobus)和園林綠化中常用的旱柳(Salixmatsudana)葉片為材料，基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)對(duì)Reads拼接過(guò)濾、分類(lèi)操作單元(OTUs)聚類(lèi)，以真菌的18S rDNA序列和ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū))序列進(jìn)行物種注釋，進(jìn)一步進(jìn)行豐富度、多樣性等分析，以期揭示2種樹(shù)種葉片表面真菌的物種構(gòu)成，并為城市園林的生態(tài)建設(shè)提供理論支持。

1 材料與方法

樣品采集：以吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院園林樹(shù)木資源圃中生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害且位置相鄰的5年生的東部白松和旱柳植株為試驗(yàn)材料，于2018年8月，選擇連續(xù)7 d無(wú)降水的時(shí)間段進(jìn)行取樣，采樣時(shí)間為2018年8月2日上午10：00，取樣點(diǎn)選擇樹(shù)木外部臨近街道的中下部葉片，其中旱柳樹(shù)高4.5 m，株距5.0 m；東部白松樹(shù)高3.0 m，株距4.0 m。每種樹(shù)木取樣5 g，取樣后立即放入經(jīng)高壓滅菌的無(wú)菌自封袋中，做好標(biāo)記后放入保溫箱中(0 ℃)帶回實(shí)驗(yàn)室。每種樹(shù)木葉片以相同方式取樣3次，記做3次重復(fù)。

DNA提?。簩悠穾Щ貙?shí)驗(yàn)室后，用200 mL無(wú)菌水將東部白松和旱柳葉片分別浸泡于無(wú)菌瓶中30 min，之后采用超聲波清洗機(jī)(預(yù)先用體積分?jǐn)?shù)75%酒精擦拭)超聲(室溫24 ℃，超聲頻率25 kHz)15 min，將全部液體轉(zhuǎn)移至4個(gè)50 mL離心管中，室溫在12 000 r·min-1離心5 min，將4管中的沉淀轉(zhuǎn)移合并至1.5 mL離心管中。采用真菌總DNA提取試劑盒(OMEGA,USA)進(jìn)行真菌DNA的提取。真菌總DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，用超微量紫外光分光光度計(jì)(NanoPhotometerTMP-Class,USA)測(cè)定OD值，A260/A280在1.70～1.90，DNA質(zhì)量濃度為100 μg·L-1以上，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求，于冰箱中-80 ℃保存。

建庫(kù)測(cè)序：提取東部白松和旱柳表面真菌總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，在引物末端加上測(cè)序接頭，然后經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，將單一條帶切膠回收后，進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，之后采用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。

OTU分析及物種注釋：使用QIIME[18](1.8.0版)軟件中的UCLUST[19]對(duì)測(cè)序獲得的序列在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)并獲得OTU，再與真菌分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(UNITE，http://unite.ut.ee/index.php)進(jìn)行比對(duì)，最終在門(mén)、綱、目、科、屬、種層面上進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。

數(shù)據(jù)分析：物種注釋、Alpha多樣性、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)等分析采用KRONA、Mothur(v.1.30版，http://www.mothur.org/)等軟件進(jìn)行分析，繪圖采用Excel、R語(yǔ)言。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量

通過(guò)統(tǒng)計(jì)各階段東部白松葉片真菌(編號(hào)：M01)和旱柳葉片真菌(編號(hào)：M02)DNA測(cè)序的序列數(shù)目，用以評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量(表1)。從表1可見(jiàn)，M01和M02經(jīng)Illumina HiSeq 2500測(cè)序后獲得的雙端測(cè)序序列分別有731 681、1 045 005條，通過(guò)雙端拼接、過(guò)濾優(yōu)化后獲得有效數(shù)據(jù)分別為604 110、865 093條，占全部所測(cè)序列的82.56%和82.78%。M01平均序列長(zhǎng)度為230 bp，Q30質(zhì)量為97.68，大于80%；M02平均序列長(zhǎng)度為236 bp，Q30質(zhì)量為97.62，大于80%，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量合格，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 東部白松和旱柳葉片真菌測(cè)序數(shù)據(jù)處理結(jié)果

注：Q30為堿基識(shí)別精度大于99.9%的堿基數(shù)目占總堿基數(shù)目的比例。

2.2 物種注釋及分類(lèi)

2.2.1 物種分類(lèi)統(tǒng)計(jì)

M01包含已經(jīng)注釋的真菌分為3門(mén)、16綱、36目、65科、72屬總計(jì)75種。而M02包含已經(jīng)注釋的真菌分為3門(mén)、16綱、33目、60科、78屬總計(jì)75種。在目和屬分類(lèi)級(jí)別上M02優(yōu)于M01，在科級(jí)別上則弱于M01。在已經(jīng)標(biāo)注的M01和M02樣品中，在種分類(lèi)水平下共同種為65種，占比86.67%；差異種為10種，占比13.33%。

2.2.2 物種相對(duì)豐富度

為了使結(jié)果表現(xiàn)更為清晰，僅顯示豐度水平前10的物種，并將其他物種合并為其他，未分類(lèi)和未分配用以代表在該分類(lèi)級(jí)別上未得到分類(lèi)學(xué)注釋的物種。根據(jù)Zhu et al.的分類(lèi)方法，將相對(duì)豐度高于10.00%定義為優(yōu)勢(shì)菌群，而相對(duì)豐度低于0.01%定義為稀有菌群[20]。由表2可見(jiàn)，在門(mén)分類(lèi)級(jí)別上M01和M02的優(yōu)勢(shì)菌群主要為子囊菌門(mén)(Ascomycota)，相對(duì)豐富度達(dá)85.12%，其次為擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycota)；在綱分類(lèi)水平上M01和M02優(yōu)勢(shì)菌群主要為座囊菌綱(Dothideomycetes)，相對(duì)豐富度達(dá)72.00%以上，而M02外擔(dān)菌綱(Exobasidiomycetes)的相對(duì)豐富度高于M01，M01酵母綱(Saccharomycetes)的相對(duì)豐富度則遠(yuǎn)高于M02；在目分類(lèi)級(jí)別上M01和M02的優(yōu)勢(shì)菌群主要為格孢腔菌目(Pleosporales)、煤炱目(Capnodiales)和座囊菌目(Dothideales)，其中M01的裂殖酵母目(Saccharomycetales)相對(duì)豐富度為9.69%，遠(yuǎn)高于M02，二者相差27598倍；在科分類(lèi)水平上枝孢霉科(Cladosporiaceae)、外擔(dān)菌科(Aureobasidiaceae)、小雙腔菌科(Didymellaceae)為M01和M02的優(yōu)勢(shì)菌群，而假球殼科(Pleosporaceae)為M02優(yōu)勢(shì)菌群，裂殖酵母科(Schizosaccharomycetaceae)則僅在M01中發(fā)現(xiàn)；在屬分類(lèi)水平上枝孢菌屬(Cladosporium)、出芽短梗霉屬(Aureobasidium)、鏈格孢屬(Alternaria)為M01和M02的優(yōu)勢(shì)菌群，念珠菌屬(Candida)僅存在于M01；在種分類(lèi)水平上皺枝孢(Cladosporiumdelicatulum)、出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)為M01和M02的優(yōu)勢(shì)菌群，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)僅存在于M01，M01中異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)和克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)的相對(duì)豐富度遠(yuǎn)高于M02。

表2 東部白松和旱柳葉片真菌自然分類(lèi)系統(tǒng)的相對(duì)豐富度

續(xù)(表2)

2.3 多樣性

在97%相似度水平下，各樣品Alpha多樣性指數(shù)見(jiàn)表3。Alpha多樣性中的Chao1和ACE指數(shù)可衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性[21]。從表3可見(jiàn)，M02的OTU數(shù)量高于M01，Chao1和ACE也高于M01。Simpson指數(shù)M01高于M02，Shannon指數(shù)M02高于M01。M01和M02的文庫(kù)覆蓋率均為1，說(shuō)明M01和M02的物種均被測(cè)出。由圖1A可知，M01、M02分別在Shannon指數(shù)為2.56和2.71時(shí)曲線趨于平坦，說(shuō)明OTU種類(lèi)不會(huì)隨測(cè)序量增加而增長(zhǎng)。M02大于M01，說(shuō)明M02的物種比M01更加豐富。由圖1B可知，M02在物種的組成豐富度上優(yōu)于M01(橫軸)，而M01的曲線與M02相比較更加的平滑，說(shuō)明M01物種組成的均勻度更好。

表3 東部白松和旱柳葉片真菌多樣性指數(shù)

圖1 東部白松和旱柳葉片真菌Shannon指數(shù)和相對(duì)豐富度曲線

3 結(jié)論與討論

對(duì)東部白松和旱柳葉片表面真菌群落多樣性的研究結(jié)果表明，東部白松葉片表面包含的真菌分為3門(mén)、16綱、36目、65科、72屬總計(jì)75種；旱柳真菌分為3門(mén)、16綱、33目、60科、78屬總計(jì)75種。東部白松葉片表面真菌的Simpson指數(shù)大于旱柳，而旱柳葉片表面真菌的Shannon指數(shù)大于東部白松，旱柳的葉片表面真菌物種豐富度更高，但是東部白松葉片表面真菌的均勻度更高。

目前，葉表面微生物多樣性及生態(tài)學(xué)的研究主要集中在具有特定目標(biāo)的微生物上，Beattie et al.對(duì)豆葉片上假單胞菌(Pseudomonassyningae)在不同環(huán)境條件下的存活、生長(zhǎng)和定位進(jìn)行了研究[22]，而Jackson et al.則針對(duì)南方木蘭(Magnoliagrandiflora)葉綠體細(xì)菌進(jìn)行了研究[23]。國(guó)外學(xué)者對(duì)葉面上的附生種群研究較多，Ercolani對(duì)不同樹(shù)齡和不同月份的橄欖(Canariumalbum)葉片上的細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定，認(rèn)為同齡葉片上的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)非常相似，但是不同齡的葉片菌群則差異較大[24]；在對(duì)苦苣(Cichoriumendivia)葉片表面的細(xì)菌種群進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境和環(huán)境條件之間的相互作用以及葉片的生理?xiàng)l件對(duì)附生細(xì)菌種群大小有著顯著的影響[25]。本研究結(jié)果表明，東部白松和旱柳葉片表面真菌種群數(shù)目均為75種，二者在門(mén)、綱、目、科、屬、種分類(lèi)水平上的優(yōu)勢(shì)菌群較為類(lèi)似，均有相同的優(yōu)勢(shì)種群，如枝孢菌屬和鏈格孢屬。一些研究也表明，枝孢菌屬和鏈格孢屬是很多高等植物葉片表面的優(yōu)勢(shì)菌群[26-27]，這得益于它們良好的傳播性[28]。但是東部白松和旱柳在一些真菌種群上則體現(xiàn)出了一定的選擇性。酵母綱、裂殖酵母目、裂殖酵母科僅在東部白松上為優(yōu)勢(shì)種群，而在旱柳上則為劣勢(shì)種群，二者豐富度相差20 000多倍，這說(shuō)明東部白松對(duì)酵母類(lèi)的真菌具有更好的選擇性。Collins et al.在挪威云杉(Piceaabies)葉片上能夠觀察到大量酵母菌，而且在整個(gè)挪威云杉生長(zhǎng)季中酵母菌的數(shù)量變化較小[29]，與本研究結(jié)果類(lèi)似，這有可能說(shuō)明酵母菌類(lèi)更容易吸附在針葉樹(shù)種葉片表面，如：熱帶假絲酵母、異常威克漢姆酵母和克魯維畢赤酵母。旱柳與東部白松葉片真菌種類(lèi)相比較，旱柳在各個(gè)分類(lèi)水平上的相對(duì)豐富度并不突出，但是在物種多樣性上優(yōu)于東部白松。在物種多樣性分析中，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高[21]。旱柳的Shannon指數(shù)值高于東部白松，Simpson指數(shù)值低于東部白松，這說(shuō)明旱柳葉片表面的真菌種群多樣性高于東部白松，物種豐富度曲線也表現(xiàn)出相同的結(jié)果。這種針葉樹(shù)種和闊葉樹(shù)種葉片表面真菌群落多樣性的差距可能是由于二者葉片表面結(jié)構(gòu)的不同所導(dǎo)致的，但是沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)直接指出不同葉片表面結(jié)構(gòu)對(duì)微生物種群有影響。此外，針對(duì)熱帶大西洋植物樹(shù)冠葉片表面微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，不同的微生物群落會(huì)選擇不同的植物[30]；Yang et al.發(fā)現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)在相同植物物種的不同個(gè)體上相似，但在不同植物物種上是獨(dú)特的[31]，這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果類(lèi)似。