孫文遠(yuǎn)， 孫文光， 李志敏

(1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南師范大學(xué) 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500)

棱子芹屬(Pleurospermum)隸屬于傘形科(Apiaceae)，為傘形科在歐亞溫帶分布中的大屬[1]，其中大部分種類都分布在喜馬拉雅地區(qū)，特別是橫斷山區(qū)；中國西南橫斷山區(qū)是傘形科植物的一個(gè)現(xiàn)代分布中心，而棱子芹屬是傘形科分布在橫斷山高山冰緣帶的第一大屬[2-3].該屬在全球共50種，中國有39種，其中22種為我國特有物種[4].美麗棱子芹(P.amabile)和麗江棱子芹(P.foetens)都分布于中國西南橫斷山區(qū)的高山地帶中，多生長于海拔3 600-5 100 m的流石灘和高山灌叢中，均為橫斷山高山冰緣帶特有的傘形科植物[5].

目前關(guān)于棱子芹屬植物核型方面的研究，僅20種有染色體資料報(bào)道；而本屬在中國橫斷山區(qū)分布有25種，其中高山冰緣帶分布有12種，12個(gè)物種中有染色體報(bào)道的種數(shù)為4種[3,6-7].可見棱子芹屬在細(xì)胞學(xué)方面的報(bào)道尚存在一些空白，且該屬是傘形科中唯一一個(gè)在橫斷山高山冰緣帶分布有10種以上的屬，對于研究傘形科在這一地區(qū)的起源與演化具有特殊意義.因此本文選取兩種棱子芹屬在該地區(qū)的特有物種進(jìn)行了研究，除了對棱子芹屬提供染色體資料外，還為植物系統(tǒng)與進(jìn)化等方面提供研究資料.

1 材料與方法

1.1 材料

供試的材料均采自云南滇西北高山冰緣帶，采集地詳細(xì)信息及憑證標(biāo)本號見表1，對應(yīng)的憑證標(biāo)本存于中國科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館(KUN).

表1 棱子芹屬供試材料的采集地信息及憑證標(biāo)本號

1.2 方法

挑選成熟飽滿的種子，在4 ℃冰箱中低溫層積3個(gè)月以上，以打破種子休眠.層積后將種子放在墊有2～3層普通定量濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，在15～20 ℃恒溫箱中萌發(fā).待幼嫩根尖長至1 cm左右長時(shí)，取生長旺盛的根尖用0.003 mol/L的8-羥基喹啉在室溫下避光預(yù)處理4 h；然后在4 ℃低溫下用卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定12～24 h；在60 ℃恒溫水浴條件下用1 mol/L HCl解離6～8 min；再用卡寶品紅染色22 h以上；以上步驟間均用蒸餾水浸泡材料數(shù)分鐘并清洗5次以上；染色完成后用常規(guī)細(xì)胞壓片法鏡檢觀察.挑選處于細(xì)胞分裂中期、形態(tài)清晰且染色體分離程度良好的細(xì)胞進(jìn)行顯微拍照，并制成永久封片以便保存.

根據(jù)李懋學(xué)等人的標(biāo)準(zhǔn)，對每個(gè)物種統(tǒng)計(jì)60個(gè)以上細(xì)胞的染色體數(shù)目，以85%及以上的恒定數(shù)目作為該研究材料的染色體數(shù)目[8].每個(gè)物種選取6個(gè)以上細(xì)胞形態(tài)清晰、染色體分散良好且數(shù)目穩(wěn)定的中期細(xì)胞圖片，進(jìn)行染色體核型的綜合分析.之后以國際通用的統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行核型分析[9]：按照李懋學(xué)等提出的核型標(biāo)準(zhǔn)對核型參數(shù)進(jìn)行分析[8]；以Levan等的方法劃分染色體類型[10]；核型不對稱性按照Stebbins的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分[11]；核型不對稱系數(shù)根據(jù)Arano核型不對稱指數(shù)“As.K%”及Paszko不對稱指數(shù)“AI”的算法分別計(jì)算[12-13].細(xì)胞間期核和有絲分裂前期染色體的形態(tài)劃分按Tanaka的標(biāo)準(zhǔn)[14].

2 結(jié)果

美麗棱子芹和麗江棱子芹的體細(xì)胞分裂間期核、前期核、中期染色體形態(tài)特征、核型圖及核型模式圖見圖1，兩個(gè)物種的染色體參數(shù)及所得的核型參數(shù)詳見表2和表3.

A-E：美麗棱子芹；F-J：麗江棱子芹；E,J:上端為短臂,下端為長臂；標(biāo)尺=5 μm

圖1美麗棱子芹和麗江棱子芹的間期核、前期核、中期染色體、核型圖及核型模式圖

Fig.1 The resting nucleus,prophase,metaphase chromosomes and haploid idiograms of somatic mitotic in the 2 species ofPleurospermum

表2 美麗棱子芹和麗江棱子芹的染色體參數(shù)

表3 美麗棱子芹和麗江棱子芹的染色體核型參數(shù)

CVCI:著絲粒指數(shù)變異系數(shù)；CVCL:染色體長度變異系數(shù)；AI:不對稱指數(shù)；THL:單倍體染色體組長度總和；MCA:平均著絲粒不對稱程度；AsK%:Arano核型不對稱指數(shù)

研究結(jié)果顯示美麗棱子芹的體細(xì)胞分裂間期核著色較深，染色質(zhì)幾乎均勻地分布在細(xì)胞核內(nèi)，沒有明顯聚合的染色質(zhì)小體，根據(jù)Tanaka的劃分標(biāo)準(zhǔn)為彌散型，見圖1-A；圖1-B中，前期染色體的異染色質(zhì)片段位于常染色質(zhì)片段的相鄰位置，按Tanaka的標(biāo)準(zhǔn)屬于中間型前期核.麗江棱子芹的體細(xì)胞有絲分裂間期核著色較淺,并有一些深染的染色質(zhì)小體，由染色中心向外逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閺浬睿鶕?jù)Tanaka的劃分標(biāo)準(zhǔn)為簡單型，見圖1-F；圖1-G中，前期核的異染色質(zhì)節(jié)段和常染色質(zhì)節(jié)段呈相間排列，按Tanaka的標(biāo)準(zhǔn)也屬于中間型前期核.

兩種棱子芹體細(xì)胞有絲分裂中期的染色體長度在3.72～7.05 μm之間變化，依據(jù)Lima-de-Faria的標(biāo)準(zhǔn)[15]基本都是中等大小的染色體，見圖1-C和圖1-H.其Stebbins核型不對稱性屬于2A型.美麗棱子芹的體細(xì)胞核型公式為2n=2x=22=14m+8sm，染色體長度變異為4.08～7.05 μm,臂比范圍為1.11～2.31，最長與最短的染色體長度比為1.73，Arano核型不對稱指數(shù)As.K%=59.55.麗江棱子芹的體細(xì)胞核型公式為2n=2x=18=8m+10sm，染色體長度范圍為3.72～5.56 μm，臂比變化為1.31～2.03，染色體長度比(最長染色體長度/最短染色體長度)為1.49，Arano核型不對稱指數(shù)As.K%=63.96.

綜合兩個(gè)物種的核型參數(shù)，發(fā)現(xiàn)美麗棱子芹和麗江棱子芹均為二倍體，染色體數(shù)目2n=18/22，染色體基數(shù)x=9/11，所有染色體都屬于m或sm型.美麗棱子芹的不對稱系數(shù)(AI)為2.45，高于麗江棱子芹的不對稱系數(shù)(AI)值1.11.

3 討 論

美麗棱子芹和麗江棱子芹的染色體基數(shù)、核型不對稱性類型以及核型公式均為首次報(bào)道.兩個(gè)物種的Stebbins核型不對稱性都屬于2A型，在染色體進(jìn)化上是較為原始的類型.但兩者的染色體數(shù)目存在差異，結(jié)合已有的報(bào)道，可以初步確定棱子芹屬內(nèi)種間染色體基數(shù)存在差異，具有x=9和x=11兩種基數(shù).棱子芹屬目前已有的染色體數(shù)據(jù)支持潘澤惠等人提出的觀點(diǎn)，即染色體數(shù)目可能對傘形科某些屬的屬內(nèi)種間分類有一定意義[16-17].

表4 橫斷山區(qū)棱子芹屬已有報(bào)道的染色體核型和數(shù)據(jù)來源

*橫斷山高山冰緣帶有分布的物種

前人對傘形科的分子系統(tǒng)學(xué)研究均顯示棱子芹屬不是一個(gè)單系類群[18]，結(jié)合形態(tài)學(xué)研究[2]及染色體核型數(shù)據(jù)(表4)，對橫斷山區(qū)棱子芹屬植物進(jìn)行染色體基數(shù)分析，可以看出其中染色體基數(shù)x=9的寶興棱子芹、翼葉棱子芹、松潘棱子芹、長果棱子芹及本研究中的麗江棱子芹在形態(tài)上都具有莖粗壯、傘幅較大、果實(shí)大、果棱明顯且翅狀和總苞片數(shù)量多且羽裂等特征；而染色體基數(shù)x=11的異傘棱子芹、西藏棱子芹及本研究中的美麗棱子芹在形態(tài)上具有莖細(xì)弱、傘幅較小、果實(shí)小、果棱平直無褶皺或鋸齒及總苞片數(shù)量少等特征；另外4種染色體基數(shù)x=11的歸葉棱子芹、芳香棱子芹、線裂棱子芹和心葉棱子芹則是介于上述兩組形態(tài)特征之間或是具有交叉的形態(tài)特征.果實(shí)微形態(tài)及分子系統(tǒng)學(xué)研究顯示[18-20]，寶興棱子芹、翼葉棱子芹、松潘棱子芹及麗江棱子芹等10個(gè)種屬于真正的棱子芹屬，而其余的西藏棱子芹、美麗棱子芹、歸葉棱子芹、芳香棱子芹、線裂棱子芹和心葉棱子芹等則應(yīng)劃歸其他屬或是系統(tǒng)位置暫不明確.因此核型數(shù)據(jù)對于處理棱子芹屬下種間分類是具有一定意義的，甚至在處理屬間分類上也能提供一定的細(xì)胞學(xué)參考依據(jù).

對橫斷山區(qū)已有染色體數(shù)目報(bào)道的棱子芹屬植物進(jìn)行染色體倍性統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，該屬在橫斷山區(qū)有分布的種僅存在二倍體和四倍體兩種倍性，但2n=22,x=11的物種為高基數(shù)二倍體，四倍體只出現(xiàn)在異傘棱子芹及西藏棱子芹-麗江玉龍雪山居群中，橫斷山高山冰緣帶分布的12個(gè)物種中已有染色體數(shù)據(jù)的6個(gè)種除西藏棱子芹-麗江玉龍雪山居群都是二倍體.從目前的數(shù)據(jù)來看，這一地區(qū)棱子芹屬在染色體水平上的演化可能是以二倍體為主的，與這一地區(qū)被子植物多倍體比例偏低的研究結(jié)論[21]是吻合的.本研究旨在為棱子芹屬提供更多的染色體數(shù)據(jù)和核型特征，也為理解和揭示棱子芹屬在橫斷山區(qū)的細(xì)胞水平上的分化和適應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù).