馬恩耀 羅文英 周勁松

摘要 [目的]對(duì)制川烏高壓蒸法炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。[方法]選取影響制川烏質(zhì)量的關(guān)鍵工藝步驟進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)單因素考察的結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)，以雙酯型生物堿總量、單酯型生物堿總量為考察指標(biāo)，得到最佳炮制工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。[結(jié)果]制川烏最佳炮制工藝為清水浸泡6 h，高壓蒸制60 min，切片，60 ℃烘干。[結(jié)論]該研究為制川烏炮制工藝的規(guī)范化、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高以及臨床用藥質(zhì)量的保障提供參考。

關(guān)鍵詞 制川烏;高壓蒸法;炮制工藝;優(yōu)化;雙酯型生物堿;單酯型生物堿

中圖分類號(hào) R283 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2020）05-0172-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.048

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]The research aimed to optimize the high pressure steaming processing technology of Aconiti Radix Cocta.[Method]The key process steps that affect the quality of Aconiti Radix Cocta were selected for singlefactor tests， and orthogonal tests were performed based on the results of singlefactor investigations. The total amount of diester alkaloids and the total amount of monoester alkaloids were used as indicators to obtain the best processing technology and carry out confirmatory tests.[Result]The best processing technology of Aconiti Radix Cocta was soaking for 6 h， steaming at highpressure for 6 min， cuting into slices， drying at 60 ℃. [Conclusion]The study provides experimental reference for the standardization of the processing technology， the improvement of the quality standard and the quality assurance of clinical drug use，

Key words Aconiti Radix Cocta;High pressure steaming method;Processing technology;Optimizations;Diester alkaloids;Monoester alkaloids

川烏是一種常用中藥，為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的干燥母根，其商品主要是栽培品，是較為重要的藥用農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物。川烏藥用歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》即有記載;其味辛、苦、性熱，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功能，用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛[1]。川烏臨床應(yīng)用較廣，但因其有大毒，自古以來(lái)便需通過炮制，將其所含毒性強(qiáng)的烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等雙酯類生物堿成分降解為毒性弱的苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿等單酯類生物堿成分，從而使毒性降低至適宜程度方予使用。歷代所用的川烏炮制方法眾多，如煨制、鹽制、黑豆蒸、水浸等，不下30種[2]。歷史上川烏炮制方法雖多，但新中國(guó)成立后，被《中國(guó)藥典》這一法定國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的只有1種（即制川烏），其炮制方法為：取川烏，大小個(gè)分開，用水浸泡至內(nèi)無(wú)干心，取出，加水煮沸4～6 h（或蒸6～8 h）至取大個(gè)及實(shí)心者切開內(nèi)無(wú)白心，口嘗微有麻舌感時(shí)，取出，晾至六成干，切片，干燥[1]。有關(guān)制川烏炮制方法研究的論文已有一些[3-9]，其中亦有采用高壓蒸法，但或因采用的炮制過程與《中國(guó)藥典》存在差異，或因只進(jìn)行了單因素考察，故都存在一些不適合飲片生產(chǎn)企業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)的情況。筆者從法規(guī)依從性出發(fā)，完全遵循《中國(guó)藥典》規(guī)定的炮制方法，并結(jié)合企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)條件，對(duì)制川烏高壓蒸法炮制工藝進(jìn)行研究，明確了關(guān)鍵工藝參數(shù)并達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求，確保了制川烏產(chǎn)品質(zhì)量的均一、穩(wěn)定、可控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。BSA225S-CW分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）;DMF-4B手提式高速中藥粉碎機(jī)（浙江溫嶺市銘大藥材機(jī)械設(shè)備有限公司）;GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;KSW型電阻爐溫度控制器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;RV10控制型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司];KQ-300DA數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;YXQ-LS-18SI壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;UltiMate 3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.1.2 試材。川烏藥材產(chǎn)于四川江油，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)高明副教授鑒定為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的干燥母根;經(jīng)檢驗(yàn)其雙酯型生物堿含量（即烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的總量）為0.064%、水分9.7%、總灰分7.0%、酸不溶性灰分1.2%，均符合《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定。

1.1.3 主要試劑。異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、氨水，AR，均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠;烏頭堿（批號(hào)110720-201111）、次烏頭堿（批號(hào)110798-201308）、新烏頭堿（批號(hào)110799-201608）、苯甲酰烏頭原堿（批號(hào)111794-201102）、苯甲酰次烏頭原堿（批號(hào)111796-201303）、苯甲酰新烏頭原堿（批號(hào)111795-201303），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究所。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備。取苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品、烏頭堿對(duì)照品、次烏頭堿對(duì)照品及新烏頭堿對(duì)照品適量，精密稱定，加異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液制成每1 mL含苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿各50 μg、苯甲酰新烏頭原堿0.3 mg的混合溶液及每1 mL含烏頭堿50 μg、次烏頭堿和新烏頭堿各0.15 mg的混合溶液，即得[10-12]。

1.2.2 供試品溶液的制備。取制川烏粉末（過3號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz;水溫在25 ℃以下）30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤氘惐?三氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得[10-12]。

1.2.3 色譜分析條件。色譜柱：資生堂Superiorex ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃（25∶15）（A）-0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL）（B），梯度洗脫（0～48 min，15%～26% A;48～49 min，26%～35% A;49～58 min，35% A;58～65 min，35%～15% A）;流速0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm;柱溫27 ℃;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按苯甲酰新烏頭原堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 線性關(guān)系的考察。取“1.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，分別按照“1.2.3”方法進(jìn)樣2、4、6、10、15、20 μL，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取按“1.2.2”方法制備的供試品溶液6份，按“1.2.3”色譜分析條件分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定烏頭堿等6個(gè)物質(zhì)的峰面積積分值，計(jì)算RSD。

1.2.4.3 精密度試驗(yàn)。取按“1.2.1”方法制備的對(duì)照品溶液，按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算烏頭堿等6個(gè)物質(zhì)峰面積的RSD值。

1.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取按“1.2.2”方法制備的供試品溶液6份，按“1.2.3”色譜分析條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定烏頭堿等6個(gè)物質(zhì)的峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.4.5 加樣回收試驗(yàn)。取按“1.2.2”方法制備的供試品溶液6份，精密稱量，測(cè)定其樣品所含單酯型生物堿含量，分別加入苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品溶液各1 mL，按“1.2.2”方法制備成供試品溶液，測(cè)定3種單酯型生物堿含量，并計(jì)算回收率和RSD。

1.2.5 樣品的含量測(cè)定。按“1.2.2”方法分別精密稱取制川烏飲片粉末配制成供試品溶液各2份，按“1.2.3”方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算得出雙酯型生物堿、單酯型生物堿含量。

1.2.6 單因素試驗(yàn)。

1.2.6.1 浸泡時(shí)間。取川烏藥材4份（每份約1 000 g），分別置于適宜容器中，用水分別浸泡6、12、18、24 h，取出，置蒸制容器內(nèi)120 ℃高壓蒸制60 min后取出，切片，60 ℃烘干。按“1.2.5”方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.6.2 蒸制時(shí)間。取川烏藥材3份（每份約1 000 g），分別置于適宜容器中，用水分別浸泡6 h后取出，置蒸制容器內(nèi)分別在120 ℃高壓蒸制30、60、90 min后取出，切片，60 ℃烘干。按“1.2.5”方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.6.3 干燥溫度。取川烏藥材4份（每份約1 000 g），分別置于適宜容器中，用水分別浸泡6 h，取出，置蒸制容器內(nèi)120 ℃高壓蒸制60 min后取出，切片，分別在40、50、60、70 ℃下烘干。按“1.2.5”方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.7 正交試驗(yàn)。根據(jù)上述對(duì)工藝的單因素考察，選取影響比較大的3個(gè)因素進(jìn)行正交考察。以浸泡時(shí)間、蒸制時(shí)間和干燥溫度為考察因素，以雙酯型生物堿總量、單酯型生物堿總量為指標(biāo)，按L9（3.4）正交表安排試驗(yàn)，對(duì)制川烏的工藝進(jìn)行正交優(yōu)化。

1.2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)。按上述正交優(yōu)化工藝得到的最佳工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，每次投料凈川烏飲片10 kg，分別取樣測(cè)定并計(jì)算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系的考察。按“1.2.4.1”方法操作，以進(jìn)樣濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性方程分別為苯甲酰烏頭堿Y=0.032 8X+0.000 2（R.2=0.999 1）、苯甲酰次烏頭堿Y=0.016 3X+0.000 1（R.2=0.999 7）、苯甲酰新烏頭堿Y=0.043 8X+0.005 2（R.2=0.999 6），表明3種單酯型生物堿在對(duì)應(yīng)含量范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系;烏頭堿回歸方程為Y=0.026 6X-0.005 4（R.2=0.999 2），次烏頭堿回歸方程為Y=0.037 2X-0.005 9（R.2=0.999 7），新烏頭堿的回歸方程為Y=0.035 8X+0.005 8（R.2=0.999 5）。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.2”方法操作，測(cè)得烏頭堿等6個(gè)物質(zhì)的峰面積的RSD為0.65%～1.34%，表明樣品在8 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.3”方法操作，計(jì)算得峰面積的RSD為0.57%～1.12%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，計(jì)算得RSD為0.83%～1.41%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 加樣回收試驗(yàn)。按照“1.2.4.5”方法操作，計(jì)算出苯甲酰烏頭原堿的加樣回收率為95.6%，RSD為0.88%;苯甲酰次烏頭原堿的加樣回收率為98.3%，RSD為0.72%;苯甲酰新烏頭原堿的加樣回收率為97.1%，RSD為1.07%;烏頭原堿的加樣回收率為100.2%，RSD為0.98%;次烏頭原堿的加樣回收率為94.6%，RSD為1.02%;新烏頭原堿的加樣回收率為98.1%，RSD為0.84%，表明含量測(cè)定的方法穩(wěn)定可靠，可用于制川烏的含量檢測(cè)。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 浸泡時(shí)間。按“1.2.6.1”方法操作，計(jì)算得出不同浸泡時(shí)間條件下制川烏的含量，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

由表1可知，浸泡6 h時(shí)，單酯型生物堿總量最高，且隨著浸泡時(shí)間的增加，單酯型生物堿總量減少。

2.2.2 蒸制時(shí)間。按“1.2.6.2”方法操作，計(jì)算得出不同蒸制時(shí)間條件下制川烏的含量，測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可知，高壓蒸制60 min時(shí)，單酯型生物堿總量最高。

2.2.3 干燥溫度。按“1.2.6.3”方法操作，計(jì)算得出不同干燥溫度條件下制川烏的含量，測(cè)定結(jié)果如表3所示。

由表3可知，60 ℃干燥時(shí)，單酯型生物堿總量最高。

2.3 正交試驗(yàn) 按“1.2.7”方法操作，因素水平見表4，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表5。

從表5可以看出，以雙酯型生物堿總量為指標(biāo)時(shí)，各影響因素均無(wú)顯著性;以單酯型生物堿總量為指標(biāo)時(shí)，蒸制時(shí)間具有顯著性;無(wú)論是以雙酯型生物堿總量還是以單酯型生物堿總量為指標(biāo)，均是蒸制時(shí)間的R值最大，且明顯高于其他2個(gè)影響因素。從極差分析結(jié)果可以看出，以雙酯型生物堿總量為指標(biāo)時(shí)，各影響因素不同水平的順序?yàn)锳1>A2>A3，B2=B3>B1，C2=C3>C1;以單酯型生物堿總量為指標(biāo)時(shí)，各影響因素不同水平的順序?yàn)锳1>A3>A2，B2>B1>B3，C2>C3>C1;二者雖有不同，但A1、B2、C2均為相應(yīng)影響因素各水平中最大者。綜合分析考慮，確定制川烏的最佳炮制工藝為A1B2C2，即浸泡6 h，蒸制60 min，在60 ℃溫度下烘干。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“1.2.8”方法操作，計(jì)算同一炮制方法下3個(gè)批次的制川烏含量，測(cè)定結(jié)果見表6。

3 結(jié)論與討論

結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，該研究選取浸泡時(shí)間、蒸制時(shí)間、干燥溫度這3個(gè)因素進(jìn)行單因素考察，并進(jìn)一步挑選這3個(gè)因素不同水平，對(duì)制川烏炮制工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)。在車間的實(shí)際生產(chǎn)工藝中，水浸天數(shù)在6～24 h，故水浸時(shí)間初步確定在6、12、18 h 3個(gè)水平上。在考慮節(jié)省原料及可行性上，確定高壓蒸制時(shí)間為30、60、90 min。參考藥典及其他文獻(xiàn)，選擇50、60、70 ℃作為干燥溫度的3個(gè)水平。結(jié)果表明，制川烏的最佳炮制工藝為：清水浸泡6 h，高溫蒸制60 min，60 ℃烘干。驗(yàn)證結(jié)果表明，經(jīng)該方法炮制后，雙酯型生物堿的含量未超過限量，單酯型生物堿含量高于生品，其他檢測(cè)項(xiàng)目均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，可見該炮制方法有利于川烏的減毒增效。依據(jù)該研究方法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，制川烏的品質(zhì)得以提升，同時(shí)為大規(guī)模生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]王孝濤.歷代中藥炮制法匯典（古代部分）[M].南昌：江西科學(xué)技術(shù)出版社，1998：20-24.

[3]蘇孝禮，劉成基.烏頭炮制工藝的研究[J].中藥材，1994，17（4）：27-28.

[4]廖冬如，黃冬玲.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選川烏、草烏炮制工藝條件[J].中成藥，1997，19（5）：19-20.

[5]張榮，方慶.川烏加壓炮制對(duì)烏頭類生物堿含量的影響研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21（1）：156，158.

[6]鄧廣海，林華.川烏高壓蒸制工藝優(yōu)選[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（2）：21-24.

[7]涂瑤生，全智慧，孫冬梅，等.川烏炮制工藝優(yōu)化[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（5）：13-16.

[8]秦語(yǔ)欣，譚鵬，國(guó)偉，等.藥典法制川烏的成品質(zhì)量與炮制過程控制的關(guān)系[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（7）：2548-2550.

[9]代堃，孟凡，王月，等.制川烏蒸煮法炮制工藝的優(yōu)化[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，20（6）：48-52.

[10]劉雨詩(shī)，劉紅梅，葉強(qiáng)，等.膽巴炮制對(duì)附子生物堿類成分的影響研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2019，30（4）：472-477.

[11]宋貴禹，王佳茜，黎萬(wàn)壽.不同生長(zhǎng)年限草烏中3種烏頭堿含量的比較[J].中國(guó)藥師，2019，22（5）：951-954.

[12]王瑞娟，劉耀武.藥典法制川烏生物堿類成分的時(shí)量變化關(guān)系研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2019，30（1）：99-102.