杜鵬程，劉海洋，張軍高，李 進，周小云，劉夢麗，雷 斌，郭慶元

(1.新疆農業(yè)大學農學院/棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830052；2.新疆農業(yè)科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；3.新疆農業(yè)科學院核技術生物技術研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】我國是棉花(GossypiumhirsutumL.)生產大國和消費大國，新疆是我國最大的優(yōu)質棉生產基地。2018年新疆棉花種植面積占全國的74.3%，產量占全國的83.8%，單產、總產穩(wěn)居全國首位[1]。新疆土壤、氣候條件與內地差異大，棉花苗期病害發(fā)生及危害特點與內地其他棉區(qū)不同[2]。由于常年連作、早春“倒春寒”頻繁發(fā)生等因素導致新疆棉花病害發(fā)生日益嚴重[3-4]，致使田間出苗、保苗差，缺苗斷壟普遍發(fā)生，嚴重影響產量和品質，篩選對棉花苗期根腐類病害具有較強拮抗作用的生防細菌，對防治棉花苗期根腐類病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】以往主要通過化學農藥處理種子的措施防治棉花苗期病害，但隨著化學農藥的長期使用，存在有害生物抗藥性強，農藥防效低、用量大、利用率低、污染環(huán)境重等弊端。生物農藥具有選擇性強、有害生物不易產生抗藥性、環(huán)保等優(yōu)點，從棉花、小麥根際土壤、植株中分離出枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等生防菌株對棉花枯萎病、黃萎病病原菌具有良好的拮抗作用[5-9]?！颈狙芯壳腥朦c】對于棉花苗期立枯病和紅腐病的相關研究較少。棉花苗期根腐類病害研究及生物防治研究基礎還比較薄弱、可借鑒少，周揚等[10]研究發(fā)現新疆棉花苗期根腐類病害主要為立枯病和紅腐病，其致病菌為立枯絲核菌(R.solani)、擬輪枝鐮孢霉(F.verticilliodes)等。研究篩選與鑒定棉花苗期根腐類病害生防細菌?！緮M解決的關鍵問題】從土壤、植株中分離、篩選出對棉花根腐類病害抑菌活性強的生防菌株。通過對新疆棉田土壤中分離出的有益生防菌株進行篩選、鑒定、抑菌能力測定，以及田間對棉花苗期根腐類病害生防效果驗證，并通過培養(yǎng)，研究發(fā)酵液浸種對棉花苗期根腐類病害的防治效果。

1 材料與方法

1.1 材 料

生防菌菌株：A57、A178、M729、LB1、TWt1、TWt34、UB17-2、HBt8、HBt14、HBt26、HWt26、HWt34、LA1、LA2、LD19-1，由新疆農業(yè)科學院植物保護研究所病理實驗室提供。

靶標菌：立枯絲核菌(R.solani) 、擬輪枝鐮孢霉(F.verticilliodes)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)，由新疆農業(yè)大學農學院病理實驗室提供。大麗輪枝菌(V.dahlia)由新疆農業(yè)科學院植物保護研究所病理實驗室提供。

培養(yǎng)基：Luria-Bertani培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL)

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司提供。

棉花品種：新陸中46號，新疆承天種業(yè)科技股份有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 生防細菌抑菌能力測定

將保存在試管中的菌株轉接到平板培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3～5 d。采用平板對峙法，先用打孔器(6 mm)將靶標菌做成適量菌餅，采用五點法接種，將菌餅轉接新的PDA培養(yǎng)基中央，在距培養(yǎng)皿邊緣2 cm處用牙簽進行生防細菌菌株接種。每個處理重復3次，生長3～5 d觀察生長情況，測量并計算每株生防菌菌株的抑菌帶寬度，并篩選出抑菌率高的生防菌株。7～15 d觀察抑菌帶變化情況。

1.2.2 生防細菌的分子生物學鑒定1.2.2.1 目標基因片段PCR擴增

16S rDNA 序列擴增：采用細菌16S rDNA 序列通用引物F16S-27:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和R16S-1492:TACGGYTACCTTGTTACGACTT進行擴增。反應體系為2×TaqMaster Mix 25 μL，27F (10 μmol/L)和 1 492R (10 μmol/L)各 1 μL，DNA 模板 1 μL，補dd H2O 到 50 μL。PCR 擴增條件為預變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s 35 cycles，延伸72℃ 1.5 min；延伸72℃ 10 min。

gyrA 序列擴增：采用細菌gyrA基因通用引物42F: CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT和1 066R: CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT進行擴增。反應體系為2×TaqMaster Mix 25 μL，42F (10 μmol/L)和 1 066R (10 μmol/L)各 1 μL，DNA 模板 1 μL，補dd H2O 到 50 μL。PCR 擴增條件為預變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s 35 cycles，延伸72℃ 1.5 min；延伸72℃ 10 min。

1.2.2.2 回收PCR產物

(1)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片斷；

(2)加入回收試劑溶液A 300 μL/0.1g，60℃水浴至膠完全溶化；

(3)加入50 μL回收試劑溶液B，混勻 ；

(4)將溶液置于離心柱中，靜置5 min，12 000 r/min，1 min，棄液體；

(5)加入500 μL 80%乙醇，12 000 r/min，離心1 min，棄液體，重復1次；

(6)12 000 r/min，離心5 min，甩干余液，棄液體，晾干5～8 min；

(7)將離心柱置于新的離心管中，加入30 μL滅菌雙蒸水，靜置10 min；

(8)13 000 r/min，離心3 min，管底即為純化產物，取3 μL電泳檢測。

1.2.3 生防細菌田間防治效果

在新疆哈密西戈壁試驗田進行，選擇棉花苗期根腐類病害發(fā)病重的地塊，該地塊棉花立枯病和棉花紅腐病為混合侵染發(fā)生。分別設不浸種空白對照、HWt34浸種、TWt34浸種、TWt1浸種、LA1浸種，共5個處理，每個處理3次重復。每個小區(qū)面積20 m2，共18個小區(qū)。在棉花苗期分別調查出苗率、發(fā)病率、病情指數和防治效果。

棉花棉期根腐類病害分級標準[11]

0級：莖基部和根部無病斑；

1級：莖基部出現少量褐色病斑，根部病斑占整個根部面積的 10%以下，或下部葉片變黃，變黃葉片占整株葉片的10%；

3級：莖基部棕褐色病斑凹陷，根部病斑占整個根部面積的11%～25%，變黃萎蔫葉片占整株葉片的25%；

5級：莖基部病斑棕褐色擴展，莖基部變細，根部病斑占整個根部面積的26%～50%，變黃萎蔫葉片占整株葉片的50%；

7級：莖基部黑褐色病斑繞莖1周， 縊縮變細，根部病斑占整個根部面積的51%～75%，變黃萎蔫葉片占整株葉片的75%；

9級：整株萎蔫造成死亡。發(fā)病率 (%) =發(fā)病株數/調查總株數×100%。

病情指數=∑ (各級病株數×相對級數值) / (調查總株數×6) ×100。

防治效果 (%) = (空白對照病情指數-藥劑處理病情指數) /空白對照病情指數×100%。

1.3 數據處理

所得 PCR 產物由北京鼎國昌盛生物技術有限公司進行序列測定，測得的序列經在NCBI 進行 BLAST 在線同源比對，選用同源性較高的標準菌株作為參照對象，利用 Bioedit和MEGA 7.0 軟件進行序列編輯和多序列比對，采用鄰接法(Neighbor-joining method)構建系統發(fā)育樹。數據分析統計，試驗數據通過Microsoft Office Execl 2010整理，利用SPSS 21.0軟件，用Duncan′s新復極差法進行方差分析，比較各處理之間的差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 生防細菌抑菌能力

研究表明，生防菌株TWt34和HWt34抑菌能力較強，對立枯絲核菌的抑菌帶寬度分別為8.14 和8.29 mm，對擬輪枝鐮孢霉分別為6.20 和6.60 mm，對尖孢鐮刀菌分別為7.63和7.70 mm，對大麗輪枝菌的抑菌寬度最大分別為12.60和13.15 mm。與其它生防菌有明顯的差異。圖1

1.立枯絲核菌; 2.擬輪枝鐮孢霉; 3.尖孢鐮刀菌; 4.大麗輪枝菌的拮抗作用
1Rhizoctoniasolani2Fusariumverticilliodes3Fusariumoxysporum4Verticilliumdahliae
圖1 生防菌TWt34、TWt1、LA1拮抗作用
Fig. 1 Antagonistic Effects of Bacteria TWt34, TWt1, LA1

2.2 生防菌株的分子生物學鑒定

HWt34和TWt34 2株生防菌株通過 16S r DNA 擴增進行DNA測序，序列長度分別為1 443和1 433 bp?；蛐蛄性?NCBI 中進行 BLAST 序列同源性比較，構建系統發(fā)育樹。結果顯示， HWt34與B.mojavensis(AB021191.1)、B.mojavensis(JX126863.1) 處于同一支，TWt34菌株與Bacilluspseudomycoides(ACMX01000133.1) 處于同一支。 通過gyrA 基因擴增進行 DNA測序，序列長度分別為 1 012 和1 006 bp。基因序列在 NCBI 中進行 BLAST 序列同源性比較，HWt34、TWt34與B.mojavensis的gyrA 基因序列最為相似，同源性達 99%。系統發(fā)育樹結果表明,HWt34、TWt34處于同一分支且與B.mojavensis處于同一個分支。生防菌株HWt34和TWt34可以確定為B.mojavensis。表1，圖2～4

表1 生防細菌平板對峙抑菌帶寬度Table 1 Bandwidth of antagonistic bacteriostasis of Biocontrol Bacterial plate

注：表中數據為平均數 ± 標準差，不同小寫字母表示差異顯著P<0.05
Note: Data in the table are mean±SD, different lowercase letters marked in the columns indicate significant difference in the tableP<0.05

圖2 菌株 TWt34和HWt34 16S rDNA 和gyrA 基因的擴增結果
Fig.2 Amplification of strains TWt34 and HWt34 16S rDNA andgyrA genes

圖3 基于 16S rDNA 序列 BLAST 結果構建的菌株 TWt34和HWt34 的系統發(fā)育樹
Fig.3 Phylogenetic trees of strains TWt34 and HWt34 were constructed based on BLAST results of 16SrDNA sequence

圖4 基于gyrA 序列 BLAST 結果構建的菌株 TWt34和HWt34 的系統發(fā)育樹
Fig.4 The phylogenetic tree of strains TWt34 and HWt34 based on the results ofgyrA gene sequence

2.3 生防菌株田間防治效果

研究表明，生防菌株HWt34浸種處理出苗率最高為81.81%，TWt34浸種處理出苗率次之為83.63%，兩者之間沒有顯著性差異。生防菌株TWt1浸種處理出苗率為70.74% ，生防菌株HWt34、TWt34處理相比差異性顯著，但高于生防菌株LA1處理和空白處理；空白處理發(fā)病率明顯高于其它處理，其中生防菌株HWt34和TWt34浸種處理發(fā)病率較低且無明顯差異；生防菌株HWt34和TWt34浸種處理的病情指數低于其它處理，而兩者之間并無明顯差異，但與TWt1浸種和LA1浸種處理有差異；生防菌株HWt34和TWt34浸種處理防治效果分別為78.43%、76.47%，防治效果高于生防菌株TWt1和LA1浸種處理，且差異性顯著。表2

表2 生防菌株TWt34和HWt34浸種田間防治效果 Table 2 Field control effect of soil-resistant strains TWt 34 and HWt 34

注：表中數據為平均數 ± 標準差，不同小寫字母表示差異顯著P<0.05
Note: Data in the table are mean±SD, different lowercase letters marked in the columns indicate significant difference in the tableP<0.05

3 討 論

生物農藥具有選擇性強、有害生物不易產生抗藥性等優(yōu)點，能夠克服化學農藥抗藥性強、污染重等[12]。許多研究通過在植物體內、深海微生物、根際土壤中分離得到多種具有防病或誘導抗病的生防細菌[13-14]，包括Bacillus屬[15]、Pseudomonas屬[16]、Agrobacterium屬[17]和Paenibacilluspolymyxa[18-19]等，其中Bacillus屬研究最為廣泛，而枯草芽孢桿菌(B.subtilis)是Bacillus屬的常見代表，劉海洋等[20-22]研究發(fā)現，Bacillus屬其他細菌種類如解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)等棉花枯萎病和黃萎病具有良好拮抗作用，但是對于棉花苗期立枯病和紅腐病的相關研究較少。新疆屬于典型的大陸型氣候，土壤、氣候條件獨特決定了微生物種類的特殊性，因此，迫切需要結合新疆實際，加強防治立枯病和紅腐病等棉花苗期根腐類病害的生防菌研究。

李振東等[23-24]在高寒植物珠芽蓼和矮生嵩草中成功分離出的內生菌莫海威芽孢桿菌，并通過試驗證明其對玉米小斑病菌、立枯絲核菌等具有拮抗作用并對植物的生長具有促生作用，現已成為具有巨大潛力的新型生物農藥來源[25]。

研究通過鑒定棉田根際土壤篩選出的生防細菌，并且利用2種分子學鑒定方式得到1株莫海威芽孢桿菌，試驗證明莫海威芽孢桿菌對棉花立枯絲核菌(R.solani) 、擬輪枝鐮孢霉(F.verticilliodes)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)及大麗輪枝菌(V.dahlia)都有拮抗作用，這與前人研究結果一致，但其作用機理、應用技術尚待進一步深入研究。

B.mojavensisTWt34對棉花苗期根腐類病害具有很好的防治效果，該生防細菌選自新疆棉花根際土壤，能夠較好的適應新疆生態(tài)環(huán)境，應用前景廣闊。

4 結 論

生防細菌HWt34和TWt34經16S rDNA和gyrA鑒定為莫海威芽孢桿菌B.mojavensis，對棉花苗期主要根腐類病害立枯病、棉花紅腐病具有較強拮抗作用。B.mojavensisHWt34浸種處理效果最好，B.mojavensisTWt34浸種處理次之，防病效果分別為78.43%和76.74%，棉田出苗率分別為84.81%和83.63%，均優(yōu)于對照。