韓芳平，謝才友，蘭 卓，任瑤瑤，譚 睿

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031）

菊科（Compositae）是比較年輕且進(jìn)化程度較高的一個(gè)大科，在數(shù)量和分布范圍上均居世界之冠，是被子植物中最大的科[1]，約 1000 多屬，25000-30000 種，我國(guó)約200多屬，2000余種[2]。菊科植物味甘苦、性寒,具有疏風(fēng)、清熱、解毒的功效,可用來(lái)治療感冒引起的頭痛發(fā)熱，心胸?zé)?。其提取物如倍半萜?nèi)酯具有抗腫瘤、抗瘧和防治心血管疾病等方面的作用，其他提取物也多具消炎、抗凝、鈣拮抗等生物活性[3]。

以往對(duì)于植物的鑒定與分類，多基于專業(yè)人員在形態(tài)學(xué)方面的觀察，需要鑒定人員大量實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，且制約著植物鑒別的精度與效率。2003 年加拿大生物學(xué)家Hebert 等[4]提出了DNA 條形碼技術(shù)，利用來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)基因組區(qū)域的短序列來(lái)識(shí)別物種，為生物分類提供了新的技術(shù)手段，成為了分類學(xué)的里程碑[5-6]。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS2）是核基因[7]，包含由 5.8SrDNA 分隔的 ITS1 和 ITS2，其中ITS2 序列片段較短，容易與單對(duì)引物結(jié)合，易于測(cè)序與擴(kuò)增，且種間變異度高，在物種和亞種水平上的識(shí)別信息最為豐富[8]。此外，ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的分子形態(tài)特征甚至允許ITS2 區(qū)域在測(cè)序錯(cuò)誤及假基因出現(xiàn)的情況下保持高準(zhǔn)確度[9]，因此可靠性高，并作為物種新的可識(shí)別特征，為分類和精確識(shí)別奠定基礎(chǔ)[10，11]。Gao等[12]的研究表明，在rbcL、matK、ITS1、ITS2、psbA-trnH這五種DNA 區(qū)域中，ITS2 在菊科植物的廣泛性、序列變異和鑒定能力方面最有效，因此本實(shí)驗(yàn)采用ITS2 作為條形碼進(jìn)行鑒別。

藥用植物有些經(jīng)過加工炮制后外形特征丟失，與其近緣種外形及其相似，鑒定困難[13]。市場(chǎng)上流通的菊科藥材也存在混偽、摻假現(xiàn)象。而菊科藥用植物在《中國(guó)植物志》中有7 卷11 冊(cè)之多，種類繁多更加不易區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)擬使用ITS2 對(duì)于川藏地區(qū)的常見菊科藥用植物進(jìn)行鑒別。

本實(shí)驗(yàn)基于ITS2 作為條形碼的手段，通過對(duì)西藏自治區(qū)、四川峨眉、樂山、康定等地區(qū)采集的菊科植物樣本及Genbank 下載的序列進(jìn)行遺傳距離、NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析以及ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較，對(duì)菊科藥用植物進(jìn)行較為準(zhǔn)確的分類，避免了菊科植物的混淆，同時(shí)也為菊科植物在資源和種源的利用和保護(hù)方面提供了理論依據(jù)。

1 材料

從四川省峨眉山、樂山、康定及西藏自治區(qū)采集了46份菊科植物標(biāo)本，經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科副教授鑒定，牛蒡子（Arctium. lappa）3份，天名精（Carpesium abrotanoides）2 份，貴州天名精（Carpesium abrotanoides）2 份 ，艾 納 香（Blumea balsamifera）1 份，緣毛紫菀（Aster souliei）1 份，鬼針草（Biden.s pilosa）1份等，標(biāo)本詳情請(qǐng)見表1。

2 方法

2.1 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

取藥材干重組織約30 mg,加入液氮充分碾磨，使用植物 DNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA，提取步驟按照試劑盒說明。

以樣品DNA作為模板，對(duì)ITS2進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

正向引物ITS2F5'ATGCGATACTTGGTGTGAAT3';

反向引物ITS3R，5'GACGCTTCTCCAGACTACA AT3'。

PCR 反應(yīng)條件:①94℃變性 5 min；②94℃變性30 s；③56℃退火30 s；④72℃延伸7 min；⑤重復(fù)上述步驟40 次；⑥72℃延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序[14]。

2.2 數(shù)據(jù)處理

基于隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMMer）注釋ITS2 序列，從而獲得標(biāo)準(zhǔn)的ITS2 間隔區(qū)序列。所有ITS2序列用MEGA7.0進(jìn)行種內(nèi)、種間K2P（Kimura 2-parameter）遺傳距離的計(jì)算，并基于K2P 距離使用相鄰結(jié)合法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[15]。利用靴帶（Booststrap）法1000 重復(fù)檢驗(yàn)各分支的支持率。在Koetschan[16]等建立的ITS2 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)預(yù)測(cè)各樣本ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 序列長(zhǎng)度及種內(nèi)、種間K2P遺傳距離分析

用MEGA7.0 對(duì)所有樣品序列及下載的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明ITS2 序列長(zhǎng)度在209-233 bp 之間，全序列排序比較長(zhǎng)度為242 個(gè)位點(diǎn),GC 含量在48.9%-64.1%范圍內(nèi)（表1）。

物種間、種內(nèi)的遺傳距離越小，同時(shí)物種間遺傳距離越大，則其用DNA 條形碼進(jìn)行分類和鑒定的效果越理想[17，18]。應(yīng)用 MEGA7.0基于 K2P 模型計(jì)算所有樣品種內(nèi)和種間遺傳距離，種內(nèi)遺傳距離為0-0.009，種間遺傳距離為0.031-0.727，其中種內(nèi)最大遺傳距離為0.009，種間最小遺傳距離為0.031，種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離。

熱圖結(jié)果顯示（圖1），菊科樣品種內(nèi)，屬內(nèi)K2P 遺傳距離小，在熱圖中顏色淺；各屬之間遺傳距離大，在圖中為顏色較深的區(qū)域；其中紫菀屬與其他屬遺傳變異值較大，在熱圖中所對(duì)應(yīng)的區(qū)域顏色最深。

統(tǒng)計(jì)并分析樣本種間和種內(nèi)遺傳距離的分布情況發(fā)現(xiàn)，不同樣本間存在較大的barcoding gap，表明ITS2 序列對(duì)供試樣本在種水平具有較強(qiáng)的鑒定能力。從圖2中還可觀察到種間變異距離值主要集中在0.1-0.6 之間，其中0.1-0.2 區(qū)間主要由艾納香屬和天名精屬遺傳距離組成，0.2-0.3 這一區(qū)間主要是石胡蔞屬、牛蒡子屬與蒿屬之間的遺傳距離組成，0.3-0.4區(qū)間主要由天名精屬、鬼針草屬、艾納香屬和蝟菊屬的遺傳距離組成，而0.4-0.6之一區(qū)間主要是紫菀屬與其他各屬的遺傳距離，這一結(jié)論也與熱圖所得結(jié)果一致。

3.2 NJ樹分析

用MEGA7.0 對(duì)ITS2 基因進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，利用靴帶（bootstrap）檢驗(yàn)法1000 次檢驗(yàn)各分支支持率，結(jié)果見圖3。由NJ 樹可看出個(gè)樣本聚為兩大支，蒲公英屬蒲公英與其他各屬種分開為2支，單成1 支，另1 支包含17 屬23 種。各屬內(nèi)各種聚為小支，聚類效果整齊準(zhǔn)確，單系性好；并且可分別觀察到鬼針草屬與蒼耳屬，蝟菊屬與牛蒡子，千里光屬與蟹甲草屬，火絨草屬與鼠麴草屬親緣關(guān)系較近。分支之間靴帶檢驗(yàn)法支持率在50%以上，可見ITS2條形碼在對(duì)樣本18屬24種可在種的水平上很好地區(qū)分。

表1 菊科植物樣本信息

圖1 菊科植物樣本種間和種內(nèi)距離

表2 GenBank下載菊科植物ITS2序列

圖2 菊科植物樣本ITS2 序列種內(nèi)和種間變異分布

3.3 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的菊科植物樣本的NJ樹

根據(jù)ITS2 數(shù)據(jù)庫(kù)及其網(wǎng)站預(yù)測(cè)供試菊科藥用植物ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）。所有二級(jí)結(jié)構(gòu)均為1 個(gè)中心環(huán)（主環(huán)）及4 個(gè)螺旋區(qū)（helix）組成，每個(gè)螺旋區(qū)又具有數(shù)量不一、大小有別的莖環(huán)（loop）結(jié)構(gòu)。由二級(jí)結(jié)構(gòu)可以看出，黃花蒿、鬼針草、天名精、鼠麴草、羽裂絹毛苣、緣毛紫菀與蒲公英二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，但其在中心環(huán)的大小、形狀以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)量、大小及位置均有差異，可以彼此區(qū)分。其中緣毛紫菀比其他幾個(gè)相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)在Ⅰ、Ⅲ區(qū)莖環(huán)數(shù)多且形狀更大，區(qū)別明顯。艾納香、貴州天名精、牛蒡子、石胡蔞、火煤草和蒼耳二級(jí)結(jié)構(gòu)的中心環(huán)相似，其中Ⅱ區(qū)結(jié)構(gòu)也相對(duì)保守，但Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ區(qū)莖環(huán)數(shù)目、大小存在明顯差異。

在進(jìn)行對(duì)樣本ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性和種屬關(guān)系無(wú)關(guān)，即使一個(gè)屬的物種，如天名精與貴州天名精，其二級(jí)結(jié)構(gòu)依舊差異顯著。一些樣本的種間二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，但在中心環(huán)及4個(gè)螺旋區(qū)仍存明顯差異，可以將各供試樣本直觀鑒別出來(lái)。

4 討論

菊科植物在我國(guó)品種繁多，資源豐富，含黃酮、萜類、生物堿等化學(xué)成分，具有清熱解毒、散瘀止痛、祛風(fēng)除濕等功效，在預(yù)防心血管疾病及抗腫瘤方面也有巨大的潛在價(jià)值[3,19]。屠呦呦等對(duì)菊科中藥青蒿的化學(xué)成分進(jìn)行了深入研究，分離了倍半萜內(nèi)脂、黃酮醇、香豆素、青蒿酸，以及具有治療支氣管炎的有效藥物青蒿揮發(fā)油，其中最重要的是具有抗瘧功能的有效成分青蒿素[20]。艾蒿可止血安胎，是婦科常用中藥[21]。紫菀可潤(rùn)肺下氣，化痰止咳，而鬼針草、千里光等具有清熱解毒，活血祛風(fēng)的功效[22]。目前很多菊科植物資源仍處于零星采集的狀態(tài)，未得到合理、充分的開發(fā)與利用[23]，因此對(duì)菊科植物建立快速準(zhǔn)確的鑒定方法是十分必要的。

圖4 菊科ITS2 序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)

ITS2作為一種通用的DNA 條形碼，已被用于藥用植物及其近緣種的鑒定[24，25]。此鑒定方法具有快捷、準(zhǔn)確、對(duì)形態(tài)學(xué)分類技術(shù)要求不高的特點(diǎn)[26]。本研究對(duì)44 份樣本進(jìn)行DNA 提取、PCR、測(cè)序，并成功獲得ITS2序列，結(jié)合GenBank 上下載的17條菊科藥用植物ITS2 序列，基于ITS2 對(duì)菊科藥用植物樣本分析。使用MEGA7.0 軟件對(duì)種內(nèi)、種間K2P 種內(nèi)遺傳距離進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算結(jié)果為種內(nèi)遺傳距離0-0.009，種間遺傳距離為0.031-0.727，種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離，說明可以使用ITS2對(duì)供試樣本進(jìn)行分析鑒別。

基于K2P 遺傳距離構(gòu)建NJ 樹可觀察到18 個(gè)屬聚成兩大支，各屬又各自成束，單系性良好，可以明顯區(qū)分各屬樣本，同時(shí)能夠觀察到不同屬親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度。利用ITS2 數(shù)據(jù)庫(kù)分析各樣本ITS2 序列二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果表明ITS2 序列可以對(duì)菊科藥用植物進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，盡管一些樣本間二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，但仍具各自特征，可以直觀、準(zhǔn)確地進(jìn)行區(qū)分。并且在某些樣本質(zhì)量少、DNA 提取效果不佳的情況下也可獲得雙向序列并成功分析，并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本研究結(jié)合了DNA 條形碼技術(shù)對(duì)川藏地區(qū)部分菊科藥用植物進(jìn)行了鑒定，結(jié)果證明ITS2 可以穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒定菊科植物，也為菊科植物的安全藥用提供了基礎(chǔ)。但是ITS2 對(duì)植物的分類鑒別需要在大量樣本序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行，因此在樣本采集方面有一定難度和數(shù)量、質(zhì)量上的要求，本研究?jī)H采集了川藏地區(qū)部分菊科植物進(jìn)行鑒定，對(duì)于數(shù)量眾多的菊科藥用植物的研究有待更多樣本的采集和深入研究，將更有利于菊科藥用植物的開發(fā)與利用。