陳曉琦，張鵬鴿，陳新蕊，冀愛英，呂 轉(zhuǎn)，趙云霞，陳欣菊，邵明義＊＊

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科 鄭州 450000；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院鄭州 450000；3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院行政科 鄭州 450000）

原發(fā)性肝癌（Primary hepatocellular carcinoma，PHC，簡(jiǎn)稱肝癌）是指原發(fā)在肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其中肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的類型。肝癌因其生長(zhǎng)快、易復(fù)發(fā)、生存期短等特性一直位居我國(guó)腫瘤致死原因的前3 位，所以對(duì)于肝癌的治療應(yīng)不斷探索并創(chuàng)新，以求取得突破性進(jìn)展。TACE 是目前肝癌最常用的非手術(shù)方式之一，適于肝功能較好、瘤體血供豐富或因其他原因不愿接受手術(shù)切除術(shù)的患者。研究表明，經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（Transcatheter arterial chemoembolization，TACE）在延緩腫瘤進(jìn)展、延長(zhǎng)生存時(shí)間方面有顯著作用。這種治療手段與肝癌的新生血管生成密切相關(guān)，我們以此來探討肝癌的微血管生成機(jī)制和藥物的臨床療效。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是人體內(nèi)微血管生成的核心因子，正常成人體內(nèi)含量較低，但當(dāng)人體由于實(shí)體瘤或其他原因造成局部缺氧微環(huán)境時(shí)，兩者表達(dá)水平升高，這是因?yàn)镠IF-1α 在低氧條件下仍具有轉(zhuǎn)錄活性，而且能調(diào)控VEGF的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。以往大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，實(shí)體腫瘤早期，瘤內(nèi)細(xì)胞的缺氧環(huán)境可導(dǎo)致HIF-1α 在腫瘤組織和外周血中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，VEGF 作為HIF-1α 的下游靶蛋白也隨之表達(dá)增加，VEGF 能促進(jìn)瘤體的微血管生成、改善瘤體邊緣的細(xì)胞能量代謝，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究團(tuán)隊(duì)自2010 年開始采用TACE、射頻消融術(shù)（Radio Frequency Ablation，RFA）、碘粒子植入等多種微創(chuàng)技術(shù)聯(lián)合治療肝癌的同時(shí)，更著重于觀察中醫(yī)藥對(duì)肝癌患者的影響。本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為正氣和邪氣不斷斗爭(zhēng)導(dǎo)致邪盛正虛，引起了肝癌的發(fā)生，其中的邪氣包括氣滯、血瘀、濕熱、痰濁等，且各種邪氣之間彼此影響、互相加重，所以臨床中患者證型并不單一存在，而研究發(fā)現(xiàn)［1］，化療栓塞治療后中醫(yī)證型多集中于脾虛濕盛、血瘀、濕熱。在此理論基礎(chǔ)上，以“扶正祛邪”為總的治療原則，針對(duì)微創(chuàng)術(shù)后最常見的中醫(yī)證型創(chuàng)制扶正消瘤方，功可疏肝健脾，清熱化痰，軟堅(jiān)散結(jié)，祛瘀止痛，適用于本研究中的所有患者。本研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)多年的臨床觀察及研究［2-4］發(fā)現(xiàn)扶正消瘤方在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改善臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、控制病情發(fā)展等方面有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。雖然中醫(yī)藥對(duì)肝癌癥狀的改善方面有明顯優(yōu)勢(shì)，但中醫(yī)藥與血管生成分子水平的關(guān)系研究仍比較缺乏。

基于前人對(duì)血管生成的研究成果，本研究通過測(cè)定原發(fā)性肝癌患者在不同因素干預(yù)情況下、不同時(shí)間點(diǎn)的血清中VEGF、HIF-1α 水平、治療前后生活質(zhì)量評(píng)分的變化情況以及血清中VEGF、HIF-1α 水平與生活質(zhì)量的相關(guān)性，進(jìn)一步明確肝癌血管生成的機(jī)制，探討中醫(yī)藥對(duì)肝癌抗血管生成、改善患者生活質(zhì)量等方面的作用，為中醫(yī)藥治療肝癌提供新思路與理論依據(jù)。

1 病例來源與標(biāo)準(zhǔn)

1.1 病例來源

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科2018 年1月至2018 年12 月入院，確診為原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌）的患者66例。采用隨機(jī)對(duì)照研究方法，將66 例研究對(duì)象分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組33例。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

①符合原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②肝功能Child-Pugh 分級(jí) A 級(jí)或 B 級(jí)，肝癌分期為Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa期；③年齡在18 歲-75 歲（含18，75 歲）之間，性別不限；④預(yù)計(jì)生存期在6個(gè)月以上；⑤符合TACE、RFA等治療適應(yīng)癥；⑥自愿參加本研究，依從性好，簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①有嚴(yán)重黃疸、腹水、全身廣泛轉(zhuǎn)移等微創(chuàng)治療絕對(duì)禁忌癥者；②較大腫瘤突出于肝臟表面，靠近膽囊、肝門部及胃腸道的腫瘤；③合并心、腦、肺、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾??；④妊娠期或哺乳期婦女；⑤嘔吐頻繁或厭服中藥者；⑥過敏體質(zhì)，對(duì)多種藥物有過敏史者；⑦近1 月內(nèi)接受過手術(shù)、微創(chuàng)等治療，或服用其他中藥抗癌制劑或免疫調(diào)節(jié)劑的患者；⑧3 個(gè)月內(nèi)參加過或正在參加其他臨床試驗(yàn)者。

1.4 剔除、脫落標(biāo)準(zhǔn)

①受試者依從性差，未能規(guī)律配合用藥，或中途停止治療而無(wú)法判斷療效者；②患者治療過程中病情惡化，不能繼續(xù)治療或死亡者；③發(fā)生嚴(yán)重的不良事件，不宜繼續(xù)臨床試驗(yàn)者；④觀察過程中自然脫落、失訪者；⑤臨床資料或?qū)嶒?yàn)室數(shù)據(jù)不全，導(dǎo)致無(wú)法判定療效者；⑥受試過程中或隨訪觀察期間，服用了影響試驗(yàn)結(jié)果的藥物；⑦患者治療過程中要求中止進(jìn)行本臨床試驗(yàn)研究或改用其他治療方法的。

2 方法

2.1 治療分組

對(duì)照組：TACE 序貫RFA + 西醫(yī)基礎(chǔ)治療（抗病毒、保肝降酶、對(duì)癥支持等）；

試驗(yàn)組：扶正消瘤顆粒（組成：黃芪30 g、菝葜30 g、黨參15 g、白術(shù)15 g、白芍15 g、丹參30 g、鱉甲20 g、牡蠣30 g、人參30 g、陳皮12 g、柴胡10 g、甘草6 g（江陰天江藥業(yè)有限公司制備顆粒劑）；用法：沖服，每日1劑，早晚溫服，每次200 mL）+TACE 序貫RFA + 西醫(yī)基礎(chǔ)治療；

治療過程：3 個(gè)月為1 個(gè)療程。分別于TACE 前1天、TACE 后 1 天、TACE 后 1 周（即 RFA 后）、TACE 后 1月、TACE 后3 月（下文中各時(shí)間點(diǎn)可簡(jiǎn)稱為術(shù)前1 天、術(shù)后 1 天、術(shù)后 1 周、術(shù)后 1 月、術(shù)后 3 月。）采集患者外周血3-5 mL，常溫下靜置1 h，然后置于離心機(jī)，以3000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層血清置于-80℃冰箱中保存待檢。避免反復(fù)凍融。抽取血樣標(biāo)本過程均取得患者的知情同意。

2.2 試劑盒

測(cè)定血清VEGF 和HIF-1α 的試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

2.3 測(cè)定過程（VEGF和HIF-1α相同）

取出待測(cè)血清室溫下解凍；在酶標(biāo)板上設(shè)置8 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔，每孔中按使用說明配制可用濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；設(shè)置樣本孔和空白對(duì)照孔；密封后置入37℃恒溫箱溫育30 min；然后洗滌、加酶、顯色，終止后用酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（即OD 值），再計(jì)算樣本相應(yīng)濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0 軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。比較VEGF 和HIF-1α 不同時(shí)期濃度變化、VEGF 和 HIF-1α 表達(dá)與臨床分期的相關(guān)性用單因素方差分析，比較兩因子表達(dá)趨勢(shì)與中藥干預(yù)的相關(guān)性用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，VEGF 和HIF-1α 表達(dá)水平的相關(guān)性用Pearson相關(guān)性分析?；€資料中計(jì)量資料用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 基線資料比較

納入對(duì)象一共66 例，其中男性54 例，女性12 例；年齡最大 74 歲，最小37 歲，平均年齡 57.35 ± 9.98 歲；在合并乙型肝炎、Child-Pugh 分級(jí)、AFP 值、臨床分期方面試驗(yàn)組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組有可比性（表1）。

4.2 VEGF和HIF-1α的相關(guān)性

本研究把所有納入對(duì)象（不論術(shù)前還是術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)）的血清VEGF、HIF-1α 水平進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，VEGF 和HIF-1α 水平呈線性正相關(guān)（r=0.829，P＜ 0.001）（圖1）。

表1 基線資料情況比較

圖1 本研究中VEGF和HIF-1α的相關(guān)性

4.3 不同時(shí)期VEGF、HIF-1α水平變化

分析各個(gè)時(shí)間點(diǎn) VEGF、HIF-1α 水平變化時(shí)，考慮到對(duì)照組未使用扶正消瘤顆粒，微創(chuàng)治療中的影響因素只有時(shí)間點(diǎn)不同，所以分析對(duì)照組可以明確TACE 序貫 RFA 治療對(duì) VEGF、HIF-1α 水平的影響。對(duì)照組患者血清中VEGF 水平隨時(shí)間遞推，TACE 后1天較術(shù)前1 天明顯升高，后逐漸下降（P＜ 0.05），TACE后1、3 月間無(wú)明顯差異，均降至術(shù)前水平（P＞ 0.05）。HIF-1α 水平隨時(shí)間遞推，TACE 后1天明顯升高，后逐漸下降（P＜ 0.05），但TACE 后3 月仍高于術(shù)前（P＜0.05）（表2）。

4.4 扶正消瘤顆粒對(duì)VEGF、HIF-1α的影響

試驗(yàn)組不同時(shí)期VEGF、HIF-1α 兩因子水平變化：VEGF 水平隨時(shí)間遞推，TACE 后1天較術(shù)前1天明顯升高，后逐漸下降（P＜ 0.05），TACE后1月、3月間無(wú)明顯差異，均降至術(shù)前水平（P＞ 0.05）。HIF-1α 水平隨時(shí)間遞推，TACE 后1 天較術(shù)前1 天明顯升高，后逐漸下降（P＜ 0.05），TACE 后3 月降至術(shù)前水平（P＞0.05）（表3）。

表2 本研究中對(duì)照組不同時(shí)期VEGF、HIF-1α濃度變化

表3 本研究中試驗(yàn)組不同時(shí)期VEGF、HIF-1α濃度變化

表4 本研究中試驗(yàn)組和對(duì)照組不同時(shí)期VEGF、HIF-1α濃度變化比較

試驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較，用重復(fù)測(cè)量資料方差分析。①VEGF：試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，術(shù)前1 天、TACE 后1 天兩組間無(wú)明顯差異（P＞ 0.05），TACE 后1周、1月、3月兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。②HIF-1α：試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，術(shù)前1天、TACE后1天兩組間無(wú)明顯差異（P＞ 0.05），TACE 后1 周、1 月、3 月兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）（表4）。

4.5 扶正消瘤顆粒對(duì)生活質(zhì)量評(píng)分的影響

參照2001 年由萬(wàn)崇華等編制的肝癌患者生命質(zhì)量測(cè)定量表QOL-LC（V2.0）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)入選的患者進(jìn)行生活質(zhì)量評(píng)分，測(cè)定治療前后兩組患者軀體功能、心理功能、癥狀/副作用、社會(huì)功能領(lǐng)域及生活質(zhì)量總評(píng)分變化：試驗(yàn)組治療后患者生活質(zhì)量四個(gè)領(lǐng)域評(píng)分及總評(píng)分較治療前均升高（P＜0.05）。對(duì)照組治療后生活質(zhì)量總評(píng)分及軀體功能、癥狀/副作用、心理功能領(lǐng)域評(píng)分較治療前均升高（P＜0.05），而社會(huì)功能領(lǐng)域評(píng)分治療前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表5）。

4.6 血清中VEGF、HIF-1α 水平與生活質(zhì)量相關(guān)性分析

治療前兩組患者血清總VEGF、HIF-1α 水平均服從正態(tài)分布，提示VEGF 與生活質(zhì)量總評(píng)分間未存在顯著的相關(guān)關(guān)系，HIF-1α 與生活質(zhì)量總評(píng)分間存在正向相關(guān)關(guān)系（表6、圖2、圖3）。

表5 治療前后兩組生活質(zhì)量比較（）

表5 治療前后兩組生活質(zhì)量比較（）

注：①與對(duì)照組治療前相比P 值；②與治療前組內(nèi)相比P 值；③與治療前組內(nèi)相比P值。

領(lǐng)域軀體功能P 0.000 0.017 0.001 0.041 0.000 0.005 0.006 0.093 0.000 0.000心理功能癥狀/副作用社會(huì)功能生活質(zhì)量總評(píng)分組別試驗(yàn)組對(duì)照組試驗(yàn)組對(duì)照組試驗(yàn)組對(duì)照組試驗(yàn)組對(duì)照組試驗(yàn)組對(duì)照組治療前31.4±4.4①30.8±3.5 29.9±4.8①30.3±5.1 28.8±4.6①31.0±3.5 27.4±5.3①29.1±4.1 125.0±17.4①124.9±16.9治療后35.3±4.9②31.7±4.1②31.5±5.2②31.5±3.8②32.7±5.1②31.1±4.3②28.9±4.8②29.1±3.2③136.9±18.1②128.0±15.8②

表6 血清VEGF、HIF-1α水平與生活質(zhì)量總評(píng)分相關(guān)性

圖2 血清VEGF水平與生活質(zhì)量總評(píng)分關(guān)系

圖3 血清HIF-1α水平與生活質(zhì)量總評(píng)分關(guān)系

5 討論

肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均占全球的50.0%以上［5］。臨床中肝癌治療包括手術(shù)切除、肝移植、介入、靶向治療、免疫治療、放化療、中醫(yī)藥治療等。

VEGF 能特異性調(diào)控肝癌組織的血管新生。在VEGF/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR）通路中，腫瘤細(xì)胞以旁分泌的形式使VEGF與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的VEGFR 特異性結(jié)合形成二聚體后，增加血管通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，使大量新生微血管生成并引起腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［6］。HIF-1α 參與腫瘤糖酵解、血管生成、增殖與凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、微環(huán)境pH 調(diào)節(jié)等過程［7-9］。通過對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)，李偉等［10］明確了缺氧條件可誘導(dǎo)肝癌組織HIF-1α的高表達(dá)。

TACE后腫瘤組織局部缺血、缺氧，VEGF、HIF-1α的表達(dá)增多，TACE 術(shù)后造成瘤體局部急性缺氧，HIF-1α 高表達(dá)且性質(zhì)穩(wěn)定，可直接上調(diào)VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)新生血管生成，觸發(fā)不完全腫瘤壞死，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［11］。相關(guān)研究顯示，TACE 術(shù)后 VEGF、HIF-1α 的表達(dá)高峰出現(xiàn)在術(shù)后1-7 天，此后逐漸下降，且治療后疾病穩(wěn)定時(shí)VEGF、HIF-1α 水平與患者的臨床療效、復(fù)發(fā)情況存在相關(guān)性［12-16］。RFA 對(duì)血清VEGF 和HIF-1α 水平的影響并不明確，但在提高免疫力、減少并發(fā)癥方面有明顯作用［17］。本研究采用TACE 聯(lián)合RFA 的手段來徹底破壞影像學(xué)可見的腫瘤組織，以期達(dá)到臨床緩解率最大化的目的，進(jìn)而觀察血清VEGF和HIF-1α水平的動(dòng)態(tài)變化。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝癌的發(fā)病無(wú)外乎正虛邪盛，所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”，治療上總體以扶助正氣、祛除毒邪、消除癌癥為治療目的，祛邪兼顧扶正，正氣不虛，則祛邪效果更強(qiáng)。扶正消瘤顆粒的方藥組成：黃芪、菝葜、黨參、白術(shù)、白芍、丹參、鱉甲、牡蠣、貓人參、陳皮、柴胡、甘草，主要功效為益氣疏肝健脾，清熱化痰，軟堅(jiān)散結(jié)，祛瘀止痛。在改善臨床癥狀、減少術(shù)后并發(fā)癥、延長(zhǎng)生存期等方面效果顯著。

本研究中患者采用了TACE 序貫RFA 治療，中醫(yī)認(rèn)為，此期患者正虛邪實(shí)，扶正消瘤顆粒在扶正的同時(shí)兼顧祛邪。研究整個(gè)治療過程中TACE 能加重腫瘤組織缺氧，血管新生增多，RFA 后缺氧情況稍改善，后缺氧情況逐漸緩解，新生血管數(shù)量也隨之減少。但這并不能說明RFA 能改善缺氧環(huán)境，可能與TACE 后阻斷了腫瘤組織的獲能途徑，腫瘤細(xì)胞大量死亡而數(shù)量減少，耗能逐漸減少相關(guān)。通過扶正消瘤顆粒用藥后觀察，試驗(yàn)組兩因子水平明顯比對(duì)照組下降速度快，說明長(zhǎng)期服用中藥扶正消瘤顆?？梢愿纳聘伟┙M織缺氧情況，抑制腫瘤血管新生，降低轉(zhuǎn)移的可能性。本研究還發(fā)現(xiàn)，除社會(huì)功能外，治療組在改善肝癌患者生活質(zhì)量方面均優(yōu)于試驗(yàn)組，提示在一定程度上扶正消瘤顆?？蓽p輕患者乏力、疼痛、腹脹、腹瀉等不良癥狀，提高肝癌TACE聯(lián)合RFA術(shù)后患者的生活質(zhì)量。相關(guān)性分析表明血清中VEGF水平與肝癌患者生活質(zhì)量無(wú)明顯相關(guān)，不排除因樣本量較小，導(dǎo)致數(shù)據(jù)的偏差，本團(tuán)隊(duì)將在下一步的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。HIF-1α 水平與肝癌患者生活質(zhì)量呈正相關(guān)，這可能與HIF-1α 的雙向調(diào)節(jié)作用相關(guān)[18]，血清中的高HIF-1α水平可應(yīng)激性的啟動(dòng)機(jī)體保護(hù)機(jī)制，增強(qiáng)肝癌患者免疫力，降低不良反應(yīng)，提高生活質(zhì)量。

本研究證實(shí)在肝癌的血管生成關(guān)系中，HIF-1α能調(diào)控VEGF的表達(dá)，兩者呈正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)扶正消瘤顆粒可以明顯改善TACE聯(lián)合RFA治療中肝癌組織的缺氧情況，降低HIF-1α水平，下調(diào)VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成。對(duì)以后中醫(yī)藥輔助治療肝癌提供了有力的證據(jù)。