張 磊 ，樸勝華 ＊＊，郭 姣

（1. 廣東藥科大學(xué)廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心 廣州 510006；2. 廣東藥科大學(xué)廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510006）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是臨床常見的重大慢性疾病之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究表明主要與氧化應(yīng)激、慢性炎癥及胰島素抵抗等有關(guān)[1-3]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF，https://diabetesatlas.org/en/）于 2017 年發(fā)布數(shù)據(jù)顯示，全球約有4.25 億糖尿病成人患者，截至2017 年底，中國國內(nèi)共有約1.144 億糖尿病患者（20-79 歲），而患病人群以T2DM 為主，占比約93.7%[4]。中醫(yī)藥因其多成分多靶點(diǎn)作用，在治療這種病機(jī)復(fù)雜的T2DM 等代謝性疾病上具有一定的優(yōu)勢。團(tuán)隊(duì)帶頭人郭姣教授首次整體認(rèn)識(shí)該類疾病，提出癉濁（糖脂代謝?。┬吕碚揫5]，依據(jù)其“肝失疏泄，五臟六腑皆受其制，濕痰瘀濁內(nèi)阻”的核心病機(jī)，創(chuàng)建“調(diào)肝啟樞化濁”法取得顯著效果，貞術(shù)調(diào)脂方為該法的代表方藥，佛手作為君藥在其中發(fā)揮了重要作用[6-8]。

佛手，別名廣佛手、佛手果、佛手柑，為蕓香科植物佛手的果實(shí)，味辛、苦、酸，溫，歸肝、脾、胃、肺經(jīng)，一味藥兼有疏肝理氣，燥濕化痰的功效。其主要化學(xué)成分包含多種生理活性物質(zhì)，如揮發(fā)油類、黃酮類、香豆素類、多糖、氨基酸和無機(jī)鹽等[9]，多項(xiàng)研究顯示了較好的降低血糖[10]、調(diào)節(jié)血脂[11]、改善胰島素抵抗[12]等調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂的作用。Meta 分析臨床運(yùn)用佛手治療T2DM 療效顯著[13]，臨床試驗(yàn)[14-16]表明佛手提取物有降血脂和降血糖作用、可調(diào)節(jié)胰島素敏感性、改善脂質(zhì)和葡萄糖代謝，但對其干預(yù)T2DM 的靶點(diǎn)機(jī)制缺乏整體系統(tǒng)研究。

近年來，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的中醫(yī)藥治療T2DM 相關(guān)研究層出不窮，李梢[17，18]最早提出生物網(wǎng)絡(luò)與中藥方劑研究，為中醫(yī)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法論及中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究奠定基礎(chǔ)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性和多向性，通過分子網(wǎng)絡(luò)信息挖掘、數(shù)據(jù)篩選和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等方式，系統(tǒng)闡述藥物的藥理作用及機(jī)制。本文與中醫(yī)藥治療T2DM 研究[19，20]運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘方法類似、治療靶點(diǎn)也多有一致性[21]，說明運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中醫(yī)藥療效方法可靠、結(jié)果準(zhǔn)確，可為進(jìn)一步研究提供思路。基于此，本研究擬應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測佛手干預(yù)T2DM 的潛在作用靶點(diǎn)及藥物作用機(jī)制，為開發(fā)針對性藥物及臨床應(yīng)用提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 疾病靶點(diǎn)預(yù)測

通過藥物作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD，https://db.idrblab.org/ttd/）、Drugbank 數(shù)據(jù) 庫（https://www.drugbank.ca/）、OMIM（http://www.omim.org/）和 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）檢索 T2DM 英文名，得到T2DM 相關(guān)基因，并將靶點(diǎn)基因?qū)險(xiǎn)niport 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)及無法標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)基因后整合匯總，作為疾病的候選靶點(diǎn)基因。

1.2 藥效成分虛擬篩選

基于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)吸收、分布、代謝、排泄（absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME），在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以“佛手”為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.14為條件進(jìn)行檢索，將得到的化學(xué)成分，作為佛手的候選藥效成分。

1.3 藥效成分靶點(diǎn)預(yù)測

將篩選出的候選藥效成分導(dǎo)入PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov/）查 詢 各 成 分 的SMILE結(jié)構(gòu)，或通過ALOGPS 2.1（http://www.vcclab.org/lab/alogps/）計(jì)算其SMILE結(jié)構(gòu)，將SMILE結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測候選藥效成分的作用靶點(diǎn)，并將得到的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niport數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

基于疾病靶點(diǎn)預(yù)測、佛手藥效成分篩選和成分靶點(diǎn)預(yù)測，得到疾病靶點(diǎn)關(guān)系及藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系，導(dǎo)入該數(shù)據(jù)并通過Cytoscape 3.7.1 軟件功能設(shè)置，構(gòu)建出3 個(gè)網(wǎng)絡(luò)，分別是：疾病-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，疾病-藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。再利用軟件中的“NetworkAnalyzer”功能對自由度（degree）等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將預(yù)測出佛手干預(yù)T2DM 的靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），得到佛手干預(yù)T2DM的靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。

1.5 藥效成分-靶點(diǎn)分子對接

從 RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)pdb 格式文件，運(yùn)用Auto Dock 軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子（如水分子），保存為pdbqt 格式文件。從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載化合物 2D 結(jié)構(gòu)的 mol2 格式文件，利用PyRx 軟件上傳化合物文件使其能量最小化，并將其轉(zhuǎn)化為pdbqt 格式文件，最后運(yùn)用Vina 進(jìn)行對接。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生作用的可能性越大。結(jié)合能≤0 kJ·mol-1說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，本研究以結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1為篩選條件。

1.6 生物學(xué)功能和通路分析

將佛手和T2DM 共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https://david. ncifcrf. gov/），物 種 選 擇 人 類（homo sapiens，human），進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。利用imageGP 工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）繪制“佛手干預(yù)T2DM的生物學(xué)過程分析”圖、“佛手干預(yù)T2DM的分子功能分析”圖。

2 結(jié)果

2.1 疾病靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

分別利用 TTD（56 個(gè)）、Drugbank（157 個(gè)）、OMIM（73 個(gè)）和 DisGeNET（2 個(gè)）等 4 個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索T2DM，共得到181 個(gè)相關(guān)基因，作為疾病候選靶點(diǎn)基因（圖1）。

2.2 藥效成分虛擬篩選結(jié)果

通過篩選，共得到7 種候選藥效成分，包括固醇類、黃酮類及油酸等（表1）。

2.3 藥效成分靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢，或?qū)⑵涠S結(jié)構(gòu)導(dǎo)入ALOGPS 2.1計(jì)算得到各成分的SMILE結(jié)構(gòu)，通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測出成分的作用靶點(diǎn)，并導(dǎo)入U(xiǎn)niport數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化。共得到成分-靶點(diǎn)關(guān)系65對。

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析結(jié)果

2.4.1 疾病靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入T2DM相關(guān)靶點(diǎn)基因，通過其功能插件獲得靶點(diǎn)基因關(guān)系，再利用Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建疾病靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖2）。網(wǎng)絡(luò)顯示：181個(gè)節(jié)點(diǎn)，2915條邊，分析網(wǎng)絡(luò)平均鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)結(jié)果為32.210。

2.4.2 藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Cytoscape 3.7.1 軟件中導(dǎo)入篩選出的藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系，構(gòu)建藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)顯示：72 個(gè)節(jié)點(diǎn)（7 個(gè)藥效成分節(jié)點(diǎn)、65 個(gè)成分相關(guān)靶點(diǎn)基因節(jié)點(diǎn)），65 條邊，分析網(wǎng)絡(luò)平均鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)結(jié)果為1.806。

2.4.3 疾病-藥效成分-靶點(diǎn)-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

（1）佛手干預(yù)T2DM 的靶點(diǎn)及靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系

Cytoscape 3.7.1軟件中的“Merge”功能可合并分析網(wǎng)絡(luò)，利用該功能將疾病靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)與藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)合并，得到佛手干預(yù)T2DM 的預(yù)測靶點(diǎn)，將該結(jié)果導(dǎo)入COXPRESdb 數(shù)據(jù)庫（https://coxpresdb.jp/）進(jìn)行基因共表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)拓展，通過STRING 構(gòu)建預(yù)測靶點(diǎn)相互作用關(guān)系圖（圖3），以Score ≥0.9 為條件，共篩選出25 個(gè)基因（表2），作為佛手干預(yù)T2DM 預(yù)測靶點(diǎn)的最終結(jié)果。

（2）疾病-藥效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Cytoscape 3.7.1 軟件中導(dǎo)入疾病-藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系，得到疾病-藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

圖1 疾病靶點(diǎn)維恩圖

表1 佛手候選藥效成分篩選結(jié)果表

將25 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，物種選擇Homo sapiens（Human），得到10 條KEGG 通路，包括3 條信號(hào)通路（PPAR 通路、NOD 樣受體通路、TNF 通路）。在Cytoscape 3.7.1 軟件中導(dǎo)入靶點(diǎn)-通路關(guān)系，得到靶點(diǎn)-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

基于疾病-藥效成分-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)與靶點(diǎn)-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，利用“Merge”功能合并網(wǎng)絡(luò)，最終得到疾病-藥效成分-靶點(diǎn)-通路PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖4）。網(wǎng)絡(luò)顯示：42 個(gè)節(jié)點(diǎn)（1 個(gè)佛手節(jié)點(diǎn)、6 個(gè)佛手藥效成分節(jié)點(diǎn)、25個(gè)T2DM 疾病靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)、10 個(gè)通路節(jié)點(diǎn)），91 條邊，分析網(wǎng)絡(luò)平均鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)結(jié)果為4.333。

2.4.4 藥效成分-靶點(diǎn)分子對接

選取10 個(gè)（S1-S10）關(guān)鍵蛋白與6 個(gè)佛手藥效成分，利用Vina進(jìn)行分子對接。以結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1為篩選條件，結(jié)果（表3）顯示，蛋白SQLE、CYP51A1、IDI1、PTPN1、CXCL8 與化合物 Sitosterol alpha1 結(jié)合能最低，分別為-7.2 kJ·mol-1、-7.4 kJ·mol-1、-7.0 kJ·mol-1、-8.1 kJ·mol-1、-9.3 kJ·mol-1，而蛋白HMGCR、HMGCS1、MSMO1、NCOA3、PTGS2 則與化合物5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone 結(jié)合能最低，分別為-7.5 kJ·mol-1、-7.4 kJ·mol-1、-8.5 kJ·mol-1、-8.1 kJ·mol-1、-9.0 kJ·mol-1。由分子對接結(jié)果可見，佛手的6種有效化學(xué)成分與T2DM關(guān)鍵蛋白形成構(gòu)象能量低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、結(jié)合活性較高。

圖3 佛手和T2DM共同靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系圖

表2 佛手干預(yù)T2DM的靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

圖4 疾病-藥效成分-靶點(diǎn)-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

表3 藥效成分-靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

2.4.5 結(jié)合模式分析

根據(jù)“2.4.4”項(xiàng)分子對接結(jié)果，對表3 中結(jié)合最低（潛在活性最高）的PTGS2（PDB ID：5IKR）與5,2',6'-Trihydroxy-7, 8-dimethoxyflavone、CXCL8（PDB ID：4XDX）與Sitosterol alpha1 的分子對接模型進(jìn)行分析（圖5）。3D 結(jié)合模式顯示，5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone結(jié)合于蛋白PTGS2的α螺旋結(jié)構(gòu)域和β折疊結(jié)構(gòu)域交界處的柔性loop 區(qū)靠近N 端區(qū)域，Sitosterol alpha1則結(jié)合于蛋白CXCL8的柔性loop區(qū)中心區(qū)域。

2D 結(jié)合模式顯示，5, 2', 6'-Trihydroxy-7, 8-dimethoxyflavone 與蛋白PTGS2 結(jié)合時(shí)，配體羥基可與His39B、Tyr130B、Ayg44B、Cys47B形成氫鍵作用（圖中虛線為氫鍵），在Pro153B、Cys36B、Leu152B 處有疏水作用力和范德華力。Sitosterol alpha1 與蛋白CXCL8結(jié)合時(shí)，配體羥基可與Lys3A 形成氫鍵作用，在Arg26A處有疏水作用力和范德華力。

2.5 生物學(xué)功能和通路分析結(jié)果

2.5.1 生物學(xué)功能分析

（1）GO分析結(jié)果

圖5 PTGS2與5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone和CXCL8與Sitosterol alpha1的對接模式

圖6 佛手干預(yù)T2DM的生物學(xué)過程分析（P ≤0.05）

圖7 佛手干預(yù)T2DM的分子功能分析（P ≤0.05）

將佛手和T2DM 靶點(diǎn)的25 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，物種選擇為Homo sapiens（Human），篩選條件為P≤ 0.05，進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，共確定了57 個(gè)GO 條目。其中有43 條關(guān)于生物過程的條目，主要有膽固醇生物合成過程、對脂多糖的反應(yīng)、類異戊二烯生物合成過程、葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始、血壓負(fù)調(diào)節(jié)、胰島素分泌的正調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過程、甘油三酯吸收負(fù)調(diào)節(jié)、膽固醇貯存負(fù)調(diào)節(jié)、脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)及脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)等方面；10 條關(guān)于分子功能的條目，包括藥物結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、脂肪酸結(jié)合、NADP結(jié)合、類固醇激素受體活性及趨化因子活性等方面。

（2）GO分析結(jié)果繪圖

用 imageGP 工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）繪制“佛手干預(yù)T2DM涉及的生物學(xué)過程分析”（圖6）、“佛手干預(yù)T2DM涉及的分子功能分析”（圖7）。

2.5.2 KEGG分析

將佛手和T2DM 靶點(diǎn)的25 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，物種選擇 Homo sapiens（Human），得到10條KEGG通路。顯示佛手干預(yù)T2DM可能是參與了 PPAR 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路的調(diào)控、NOD 樣受體信號(hào)通路、類固醇生物合成及代謝通路等過程，利用imageGP工具繪制“佛手干預(yù)T2DM通路”（圖8）。

圖8 佛手干預(yù)T2DM通路（P ≤0.05）

3 討論

T2DM 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前大多考慮與胰島素抵抗[1]、炎癥細(xì)胞因子[3]、及DNA 甲基化[22]等方面相關(guān)?，F(xiàn)有的治療藥物多是通過改善肝腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路[23]、調(diào)節(jié)胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）生成[24]、抑制鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 2（SGLT-2）表達(dá)[25]及改善胰島β細(xì)胞分泌功能[26]等方面治療T2DM。

本研究發(fā)現(xiàn)，佛手可通過谷甾醇α甾醇、黃酮類（甲氧基黃酮）、角鯊烯等6 個(gè)有效成分干預(yù)T2DM 的25 個(gè)靶點(diǎn)基因和10 條相關(guān)通路發(fā)揮作用，其中的靶點(diǎn)基因主要有MSMO1、PTPN1、NCOA3、PTGS2、NOS2、FABP4、RBP4、FFAR1、CXCL 家族及 PPAR 家族等，上述基因功能主要與調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路、體內(nèi)炎癥狀態(tài)、胰島素分泌、脂質(zhì)代謝等密切相關(guān)。其中MSMO1 基因的位點(diǎn)既與調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平相關(guān)[27]，又與高密度脂蛋白膽固醇相關(guān)[28]；PTPN1 基因參與胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)調(diào)控[29]，且中國女性人群中，PTPN1 啟動(dòng)子甲基化升高是T2DM 的危險(xiǎn)因素[30]；NCOA3 基因（即SRC-3）通過減少PGC-1 的乙?；饔梅乐狗逝植⑻岣咭葝u素敏感性[31]；PTGS2（COX-2）與胰島素分泌有關(guān)[32]；NOS2 可促進(jìn) COX2（PTGS2）的激活[33]，也可作用于NO 生成，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，最終影響T2DM；FABP4 也稱為A-FABP，可調(diào)節(jié)胰島素敏感性，并參與炎癥與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[34]；IRS1-Ras-MAPK 通路是胰島素受體的信號(hào)傳導(dǎo)通路，RBP4 可通過調(diào)節(jié)該通路，影響T2DM 的胰島素抵抗[35]；通過干預(yù)胰島β細(xì)胞，F(xiàn)FAR1 可調(diào)節(jié)胰島素分泌[36]；CXCL家族與糖尿病和高脂血癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)[37]。在糖尿病發(fā)病中，PPAR 信號(hào)通路是重要調(diào)節(jié)通路之一，PPARs 是核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，通過配體激活的方式在T2DM 及肥胖病程進(jìn)展中起重要作用，被認(rèn)為是代謝綜合征治療中最有前景的靶標(biāo)之一[38]。PPAR 家族與糖脂代謝及胰島素抵抗密切相關(guān)[39，40]。說明佛手干預(yù)T2DM 是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同作用的結(jié)果。

此外，研究中還發(fā)現(xiàn)，佛手的有效成分可以同時(shí)作用于HMGCR、HMGCS1、CYP51A1、IDI1 及 SQLE 等靶點(diǎn)參與膽固醇生物合成、脂質(zhì)合成和脂蛋白代謝等過程[41-45]，說明佛手具有潛在的調(diào)脂作用，這些靶點(diǎn)則是佛手發(fā)揮調(diào)脂作用的潛在靶點(diǎn)。

基于此，兼具疏肝理氣與燥濕化痰功效的佛手，可以同時(shí)作用于具有調(diào)節(jié)糖、脂代謝的靶點(diǎn)和通路，為其臨床應(yīng)用于糖脂代謝紊亂合并或并病的患者提供了依據(jù)，同時(shí)說明中藥治療慢性、代謝性、復(fù)雜性疾病具有極大的研究潛力和價(jià)值。