梁麗喆，胡鏡清 ，吳 怡

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院 沈陽 110034；2. 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所 北京 100700）

冠心病全名為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，是冠狀動脈因為粥樣硬化的器質性改變導致管腔狹窄或阻塞，和（或）因功能性改變導致心肌缺氧缺血或壞死，從而引起的一類心臟疾病的統(tǒng)稱[1]。近年來，城市人群中冠心病患病人數(shù)和住院人數(shù)已上升至內(nèi)科疾病的首位[2]。目前，對于冠心病預防和治療的手段仍以藥物干預為主，研究中藥在冠心病治療中的作用機制，能夠更好的為日后的藥理學研究、冠心病臨床治療以及藥物研發(fā)提供參考[3]。

文獻整理結果表明，冠心病的現(xiàn)代機制研究多以內(nèi)皮反應損傷學說立論，而中醫(yī)藥多從“痰”“瘀”“熱”等常見證型入手，進行辨證論治[4-6]。胡鏡清教授在病機兼化的理論框架下，提出的冠心病“早期濕化、中期熱化、晚期虛化”的病機，為該病的診療提供了新思路。本研究依托博士后和國家人才項目基金，在前期研究中，初步驗證了清熱解毒類中藥與化痰祛瘀類中藥在冠心?。ǜ咧喜⒀軆?nèi)皮損傷）模型中的降血脂、抗氧化等療效。本文通過血清代謝組學技術，再次將化濕類臨床驗方通陽化濁方與清熱解毒類經(jīng)方四妙勇安湯作對比，探討兩種臨床療效確切的不同類型方劑在冠心病治療起效過程中作用機制的差異[7]。

1 材料

1.1 動物模型

40 只清潔級日本大耳兔，雄性，體質量均為2.5-3.5 kg，購置于青島康大生物科技有限公司。在遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心適應性喂養(yǎng)3-5天后進行正式實驗。實驗室溫度20℃-26℃，濕度40%-70%，實驗室證書編號：SYXK(遼）2019-0004。

1.2 試劑與儀器

儀器分析平臺：LC-MS (Waters，Xevo G2-XS QTof)；乙腈（德國Merck 公司提供）、甲醇（德國Merck公司提供）、甲酸（中國上海CNW 公司提供）、超純水（Mili-Q）、2-氯苯丙氨酸（中國上海GL Biochem 公司提供）

2 方法

2.1 樣本采集及處理

40 只雄性白兔，隨機分為空白組、模型組、通陽化濁方組與四妙勇安湯組4 組，每組10 只。空白組正常飲食，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)至第8 周，于第4 周結束后，用球囊法手術損傷實驗兔的右側頸總動脈；在模型組基礎上，兩個實驗組分別在術后，灌胃給予通陽化濁方和四妙勇安湯，連續(xù)4 周，每日1 次。給藥結束后，采取空白組與模型組病理和血液樣本，證明造模成功的前提下，模型組與實驗組每組抽取3只家兔，促凝管采集全血后，置冰上約30 min，12000 r·min-1離心10 min，取血清300μL分裝EP管，置干冰中，用于血清代謝組學檢測。

2.2 檢測條件

2.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3，（100× 2.1 mm，1.8μm）；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：4μL；自動進樣器溫度：4℃；流動相組成A：水 + 0.1%甲酸；B：乙腈；流動相梯度洗脫程序（表1）。

2.2.2 質譜條件

掃描范圍：50-1200；掃描時間：0.2 s；模式：ESI+和ESI-；毛細管電壓：3 kV（ESI+）；2.5 kV（ESI-）；錐孔電壓：30 V；碰撞能量（eV）：Low CE：6，HighCE：15-45；源溫度：120℃；去溶劑化溫度：550℃；錐孔氣體流量：50 L·h-1；去溶劑化氣體流量：900 L·h-1；數(shù)據(jù)采集時間：25 min。

表1 流動相洗脫程序

2.3 生物樣品處理方法

血液樣本置于室溫解凍，用移液槍吸取100μL 樣本于 1.5 mL EP 管中，加入 300μL 甲醇，渦旋混勻30 s。-40℃靜置1 h，渦旋混勻30 s，4℃靜置0.5 h。置于4 ℃離心機中，12000 r·min-1離心15 min。取出全部上清液于離心管中，-40℃靜置1 h。置于4℃離心機中，12000 r·min-1離心15 min。吸取200μL 上清，并加入5μL 內(nèi)標（140μg·mL-1，2-氯苯丙氨酸），轉入進樣小瓶中待LC-MS檢測。

2.4 數(shù)據(jù)處理方法

本研究在使用SMICA-P 軟件正式分析前，為獲得更加直觀可靠的結果，對數(shù)據(jù)組進行了歸一化處理；采用PCA 的非監(jiān)督性方法和OPLS-DA 的有監(jiān)督性方法對樣本進行建模分析，PCA 分析通過主要參數(shù)模型的解釋率R2X來判別模型質量好壞，更真實地反映組間差異以及識別組內(nèi)變異；OPLS-DA 分析以參數(shù)R2Y來描述模型的解釋率，用Q2來表示模型的預測率，采用OPLS-DA 模型的 VIP 值，結合t檢驗的P值，尋找不同組別的差異性表達代謝物。

3 結果

3.1 總體PCA分析

采用PCA 模型鑒定各組之間代謝產(chǎn)物的差異，PCA模型由R2X和Q2值進行驗證（圖1）。

結果表明：由圖1 分析可知，正模式下獲得2 個主成分，累計R2X=0.502，Q2=0.182；負模式下獲得2 個主成分，累計R2X= 0.436，Q2= 0.0772。在正模式下control 組、TYHZ 組和 SMYA 組樣品間，在負模式下control組和SMYA 組間，雖然有部分重疊，但是均有分離趨勢。QC 樣本是等量混合了所有被檢測樣本，圖中QC樣本緊密聚集，證明方法穩(wěn)定，重復性良好。

3.2 OPLS-DA分析

3.2.1 OPLS-DA得分圖

圖1 總PCA得分圖

圖2 control-TYHZ兩組的OPLS-DA得分圖

采 用 OPLS-DA 模 型 鑒 定 control-TYHZ 組 、control-SMYA 組、TYHZ-SMYA 組之間代謝產(chǎn)物的差異（圖2-4）。

結果表明：OPLS-DA 模型由 R2Y 和 Q2值進行驗證，參數(shù)R2Y 代表模型與數(shù)據(jù)是否匹配，參數(shù)Q2用來提供對模型的預測能力的評估。R2Y、Q2都大于0.5 表示模型有很好的解釋率和預測率，越接近1 模型的解釋能力和預測能力越好。

由圖2 分析可知，正模式下共得到1 個主成分和3個正交成分，R2X=0.863，R2Y=1，Q2=0.943；負模式下同樣得到1 個主成分和3 個正交成分，R2X=0.893，R2X= 1，Q2= 0.934。在正模式和負模式下，control 組和TYHZ組間區(qū)分明顯，所以內(nèi)源性代謝物存在差異，說明TYHZ對于冠心病模型家兔有一定的作用。

由圖3 分析可知，正模式下可以得到1 個主成分和3 個正交成分，R2X= 0.875，R2X= 1，Q2= 0.92；負模式下同樣得到1 個主成分和3 個正交成分，R2X =0.855，R2X= 1，Q2= 0.732。在正模式和負模式下，control 組和SMYA 組間區(qū)分明顯，所以內(nèi)源性代謝物存在差異，說明SMYA 對于冠心病模型家兔有一定的作用。

由圖4 分析可知，正模式下可以得到1 個主成分和3個正交成分，R2X=0.853，R2X=1，Q2=0.995；負模式下同樣得到1 個主成分和3 個正交成分，R2X=0.851，R2X= 1，Q2= 0.865。在正模式和負模式下，SMYA 組和TYHZ 組間區(qū)分明顯，所以內(nèi)源性代謝物存在差異，說明TYHZ 和SMYA 對于冠心病模型家兔均有一定的作用。

圖3 control-SMYA組的OPLS-DA得分圖

圖4 TYHZ-SMYA組的OPLS-DA得分圖

3.2.2 OPLS-DA 3D-score圖

圖 5、圖 6、圖 7 分別為 control-TYHZ 組、control-SMYA 組和TYHZ-SMYA 組，其代謝物譜經(jīng)OPLS-DA處理后得到的3D-score圖。

3.2.3 OPLS-DA載荷圖

結果表明：載荷圖圖中的每個點分別代表樣本中檢測到的一個代謝物信息，其距離中心原點越遠，表明該代謝物對各樣本組間的分離貢獻度越大，就越有可能是潛在的生物標志物。

在圖8 通陽化濁方與模型組的比較中，代謝物信息多聚集于離中心較遠處，提示潛在生物標志物較多；圖9 四妙勇安湯與模型組次之，圖10 兩個實驗組間潛在的差異性生物標志物較少。

3.3 差異物質表

3.3.1 通陽化濁方與模型組比較

本研究中，為了探究通陽化濁方對冠心?。▋?nèi)皮損傷且高脂）模型的影響，將通陽化濁方與模型組比較，共篩選出45個差異化合物（表2）。

將上述鑒定出的差異化合物輸入MetaboAnalyst（http://www. metaboanalyst.ca/）數(shù)據(jù)庫，進行代謝通路分析（表3、圖11）。

結果顯示：control-TYHZ 組一共涉及18 條代謝通路，根據(jù)Impact值＞0.05 篩選出5 條主要代謝通路，即精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、?；撬岷团；撬岽x、精氨酸生物合成和α-亞麻酸代謝。提示在血清中通陽化濁方對冠心?。▋?nèi)皮損傷合并高脂）模型的影響可能與這5 條代謝通路相關，影響這些代謝通路可能會對通陽化濁方在冠心病模型中作用產(chǎn)生影響。

圖5 control-TYHZ兩組的OPLS-DA 3D-score圖

圖6 control-SMYA兩組的OPLS-DA 3D-score圖

圖7 TYHZ-SMYA兩組的OPLS-DA 3D-score圖

圖8 control-TYHZ兩組的OPLS-DA載荷圖

圖9 control-SMYA兩組的OPLS-DA載荷圖

圖10 TYHZ-SMYA兩組的OPLS-DA載荷圖

3.3.2 四妙勇安湯與模型組比較

本研究中，為了探究四妙勇安湯對內(nèi)皮損傷的高脂模型的影響，將四妙勇安湯與模型組比較，共篩選出27個差異化合物（表4）。

將上述鑒定出的差異化合物輸入MetaboAnalyst（http://www.metaboanalyst.ca/）數(shù)據(jù)庫，進行代謝通路分析（表5和圖12）。

結果顯示：control-SMYZ 組一共涉及11 條代謝通路，根據(jù)Impact值＞0.05 篩選出2 條主要代謝通路，即?；撬岷团；撬岽x和組氨酸代謝。提示在血清中四妙勇安湯對內(nèi)皮損傷的高脂模型的影響可能與這2條代謝通路相關，影響這些代謝通路可能會對四妙勇安湯對內(nèi)皮損傷的高脂模型產(chǎn)生影響。

表2 control-TYHZ組血清樣本差異物質列表

表3 control-TYHZ組血清樣本代謝途徑列表

圖11 control-TYHZ血清組代謝途徑分析結果

4 討論

在理論基礎方面：胸痹之為病，大體脾虛運化水濕不利，久則聚濕成痰，痰濁壅遏中焦，蒙蔽胸陽，陽氣不得疏布而致。本研究針對冠心病較為公認的“濕濁”與“熱毒”兩個病理因素，通過“化濕”與“清熱解毒”兩類中藥干預的對比，探討其在治療冠心病過程中起效的不同作用途徑，為研究中冠心病“早期濕化、中期熱化、晚期虛化”的理論假說提供數(shù)據(jù)支持。

表4 control-SMYZ組血清樣本差異物質列表

在用藥選擇方面：通陽化濁方為路志正國醫(yī)大師的臨床驗方。路志正國醫(yī)大師致力于推廣脾胃學說，提出“持中央、運四旁”的學術觀點，為冠心病治療提供了中醫(yī)診療思路[8-10]。方中廣藿香辛而微溫，專入脾胃，以其芳香化濁，和中祛濕，宣散濕濁中阻，消解胸悶脘痞，為君藥。厚樸、枳實味辛苦，亦歸脾胃，兩藥相須為用，辛開苦降，善燥濕化痰，寬胸散結，行氣消痞，以助君藥祛痰化濁，振奮中焦，疏布胸陽之力，合為臣藥。另取苦杏仁降氣祛痰而寬胸；茵陳清利而導濕下行；郁金行氣活血而止痛，合而祛痰濕，行瘀滯，寬胸膈，蠲痹痛，共為佐藥。本劑寒溫合用，性偏溫和。袪痰化濁，振奮脾胃，消除陰霾而治其本；化瘀行滯，寬胸散結，通陽蠲痹而理其標。六味合用，共奏祛痰化濁，寬胸散結，通陽蠲痹之效。四妙勇安湯以治療熱毒熾盛證見長，臨床應用較為廣泛，基于抗炎、抗氧化、調(diào)血脂、抗血栓、改善血液流變等臨床藥理作用，其在冠心病治療中的應用研究引起關注[11-15]。方中金銀花清熱解毒，重為君藥；玄參清熱涼血，瀉火解毒，當歸活血化瘀，與玄參合用養(yǎng)血滋陰而生新，共為臣藥；生甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥，自為佐使。

表5 control-SMYZ組血清樣本代謝途徑列表

圖12 control-SMYZ血清組代謝途徑分析結果

在方法選擇方面：代謝組學技術由Nicholson 在1999 年首次提出，它是繼基因組學和蛋白質組學之后，系統(tǒng)生物學的重要組成部分。由于代謝組學可以使用尿液或血液做無損的連續(xù)取樣，通過大規(guī)模信息提取技術，觀察疾病發(fā)生、發(fā)展過程中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化，揭示人體內(nèi)部各組成成分相互作用和運行規(guī)律，在中藥復方藥理學研究方面，與中醫(yī)“整體觀”“動態(tài)觀”“辨證觀”相吻合，對探討疾病早期診斷與初步療效的生物標志物，具有明顯優(yōu)勢[16，17]。

在代謝途徑方面：牛磺酸和?；撬岽x、組氨酸代謝是通陽化濁方與四妙勇安湯共同涉及的兩條主要代謝通路，除此之外，通陽化濁方的代謝還與精氨酸和脯氨酸代謝、精氨酸生物合成以及α-亞麻酸代謝通路相關。既往研究表明，?；撬嶙鳛橛坞x氨基酸中的一員，具有較強的抗氧化活性，能夠通過清除自由基，改善冠心病患者血管內(nèi)皮的舒張功能，從而減少心肌受損，在冠心病，特別是痰瘀或瘀熱互結證患者中，血液含量明顯低于正常人[18，19]；脫羧酶催化組氨酸生成組胺，大量組胺可誘導冠脈收縮，還可擾亂心肌內(nèi)皮和線粒體功能，其釋放水平與冠心病嚴重程度呈正相關，用藥后組氨酸水平的降低，提示CHD 的心肌缺血程度減輕[20-22]；精氨酸在冠心病中的作用，主要通過二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非對稱性二甲基精氨酸（DDAH-ADMA）系統(tǒng)，來抑制NOS 生物利用度，精氨酸和ADMA 的降低，可以一定程度上維持及穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能，減少冠心病的發(fā)生[23-25]；脯氨酸參與蛋白質氨基酸的代謝過程，可作為判斷是否冠心病血瘀證的主要物質，能夠區(qū)分氣虛血瘀與其他血瘀證，與冠心病血瘀證發(fā)生成負相關[26-28]；α-亞麻酸屬于多不飽和脂肪酸（ω3-PUFAs），是人體必需脂肪酸，它可通過減弱對血管平滑肌刺激或影響前列腺素生成而起到降壓作用，有研究報道，不飽和脂肪酸可降低冠心病發(fā)病風險，保護性脂肪酸含量降低與CHD 密切相關[29，30]。

5 小結

血清代謝組學技術具有直接、無創(chuàng)、靈敏度高的顯著優(yōu)勢，與中醫(yī)整體觀念有異曲同工之妙。本研究通過血清代謝組學的研究方法，篩選了通陽化濁方與四妙勇安湯在治療冠心病模型家兔的過程中存在差異性代謝產(chǎn)物，提示干預相應的代謝通路，可能會對藥物在模型中的作用產(chǎn)生影響。