劉顯武，楊子明，陳 煜，何祖宇，周 闖，王 超，劉運(yùn)浩，李普旺

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，武漢 430070；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524001；3.北京理工大學(xué) 材料學(xué)院，北京 100081)

0 引 言

殼聚糖(chitosan，CS)，也稱脫乙酰甲殼素，是一種天然的陽離子聚合物，也是天然多糖中唯一的堿性多糖[1]。殼聚糖因其來源廣泛、價(jià)格低廉、良好的生物相容性和可降解性的等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于納米載體的研究，但其只溶于稀酸[2]。羧甲基殼聚糖(CMCS)與殼聚糖相比較，溶解性增加，水溶性提高，具有優(yōu)良的分散性、乳化性、保濕性、增稠性和成膜性，同時(shí)還具有兩性高分子電解質(zhì)和螯合金屬離子的特性，可以解決殼聚糖水溶性差、不易分散等缺陷[3]。

常見的納米載體形態(tài)有水凝膠、納米粒、微膠囊和膠束等。盡管大量納米藥物載體的研究被報(bào)道，但是依然存在藥物如何在機(jī)體內(nèi)分布、載藥量的優(yōu)化以及藥物緩釋的把控等問題[4-5]。D.A.Asila等[6]通過離子凝膠法制備的納米微球憑借其超微小體積，更容易穿過組織間隙，在機(jī)體內(nèi)合理分布，將所載的藥物運(yùn)輸?shù)桨邢虿课?，達(dá)到藥物緩釋和靶向給藥的目的。納米微球技術(shù)很好地改善了藥物性能，解決當(dāng)前影響藥物療效的諸多問題，在藥物緩釋上受到人們越來越多的關(guān)注[7]。

敏感型納米載體是一類能對(duì)外界物理化學(xué)刺激(光、超聲、磁場、pH值等)做出反應(yīng)，進(jìn)而改變其結(jié)構(gòu)、性能等的納米材料[8]。目前研究最多的敏感型載藥系統(tǒng)就是溫度響應(yīng)型材料，F(xiàn).Q.Daniel等[9]以聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)為溫敏材料，通過離子凝膠法制備溫敏殼聚糖納米粒的低臨界溶解溫度(LCST)約37.5 ℃，當(dāng)外界溫度高于LCST時(shí)，聚合物親水鏈崩塌，丟失大量水分子，聚合物性質(zhì)由親水變?yōu)槭杷膳蛎涀優(yōu)槭湛s，納米載體粒徑減小，有利于藥物釋放。近紅外光由于其組織穿透力強(qiáng)，損失力小而成為當(dāng)前刺激響應(yīng)性材料的研究熱點(diǎn)[10]。吲哚菁綠(ICG)是一種三羧花菁系的小分子近紅外光熱劑，可吸收波長為780 nm的近紅外光并轉(zhuǎn)化成熱能。但I(xiàn)CG在生理介質(zhì)中的不穩(wěn)定，易發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變(高濃度自聚集、不可逆降解等)，導(dǎo)致其光學(xué)性能改變，甚至喪失近紅外光吸收能力[11]。P.R.Wei等[12]研究發(fā)現(xiàn)，利用沉淀法制備的包覆吲哚菁綠的殼聚糖微球具有良好的穩(wěn)定性，并對(duì)乳腺癌細(xì)胞能夠靶向緩釋釋放藥物。因此，本文通過乳化交聯(lián)法制備包載ICG的溫敏羧甲基殼聚糖納米微球，設(shè)計(jì)出一種通過光熱條件改變來調(diào)控阿霉素穩(wěn)定釋放的納米微球載體，旨在提高藥物包載率的同時(shí)達(dá)到更好的緩釋把控效果，同時(shí)為通過光熱效應(yīng)實(shí)現(xiàn)藥物緩釋把控、提高載藥量和保證吲哚菁綠的穩(wěn)定性提供新穎思路。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

羧甲基殼聚糖(CMCS，粘度<200 mPa·s，脫乙酰度≥90%，羧化度≥80%)、吲哚菁綠(ICG，含量75%)和鹽酸阿霉素(DOX，含量98%)都采購于中國Macklin公司；N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)采購于源葉生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U765S紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；FTS3000型傅里葉紅外光譜儀，美國伯樂公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，杭州大力科教儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 羧甲基殼聚糖接枝N-異丙基丙烯酰胺

按文獻(xiàn)[13-15]的方法并加以改進(jìn)，采取自由基合成法將0.24 g CMCS分散于20 mL去離子水中，磁力攪拌器中攪拌溶解，在氮?dú)夥諊录訜岬?0 ℃，然后加入0.24 g的NIPAm單體，混合攪拌均勻。稱取10 mg過硫酸鉀溶解于4 mL水中，逐滴加入到上述溶液中，氮?dú)夥諊聰嚢璺磻?yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，由于共聚物不用于丙酮，可用丙酮沉淀，在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，制得粗產(chǎn)品在用丙酮抽濾，直到取一滴抽濾廢液滴入苯中不產(chǎn)生沉淀為止。最終產(chǎn)物在40 ℃下真空干燥即得接枝共聚物。接枝共聚物的接枝率和接枝效率分別如式(1)和(2)所示

接枝率(%)=(Wg-Wc)/Wc×100%

(1)

接枝效率(%)=(Wg-Wc)/Wm×100%

(2)

其中，Wg為純化的接枝共聚物；Wc為CMCS單體的質(zhì)量；Wm為NIPAm單體的質(zhì)量。

1.3.2 接枝產(chǎn)率條件的優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

為了提高接枝產(chǎn)率，分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 h的反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度為50，60，70，80和90 ℃，引發(fā)劑的量為10，12，20，40和50 mL，溶劑的質(zhì)量為6，8，10，12和14 mg為單因素，進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 光熱敏感型羧甲基殼聚糖微球的制備

采用快速膜乳化交聯(lián)技術(shù)制備光熱敏感型羧甲基殼聚糖納米微球[16-17]。將0.5 g羧甲基殼聚糖接枝聚合物溶于50 mL去離子水中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的羧甲基殼聚糖接枝共聚物分散體系，然后加入1 mL 0.5 mg/mL的吲哚菁綠到上述體系中攪拌20 min作為水相成分；以含有3%的司班-80和3%的吐溫-80的200 mL液體石蠟作為油相。將10 mL水相加入到200 mL油相中以600 r/min的轉(zhuǎn)速50 ℃水浴乳化1 h 制備初乳液，將初乳液以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速剪切乳化10 min，制得粒徑較均一的乳液后，將初乳液pH值調(diào)至6.0，在0～5 ℃下緩慢滴加10%的香草醛2 mL固化0.5 h，然后移入50 ℃水浴下反應(yīng)4 h得到固態(tài)羧甲基殼聚糖微球，之后分別用石油醚、異丙醇和去離子水離心洗滌去除油相，收集羧甲基殼聚糖化學(xué)交聯(lián)微球。

1.3.4 包載DOX的微球制備

制備包載阿霉素(DOX·HCl)的納米微球時(shí)，首先要對(duì)DOX·HCl進(jìn)行預(yù)處理。精密稱取DOX·HCl 12 mg溶于20 mL的二甲基亞砜中，磁力攪拌，加入4 mL的三乙胺(TEA)，室溫下攪拌過夜，用作待用試劑，4 ℃下保存。

精密稱取0.01 g的干燥微球，加入圓底燒瓶中，加入20 mL去離子水，攪拌20 min，使其充分分散，加入5 mL的二甲基亞砜，攪拌10 min，使體系成油水混合相，讓產(chǎn)物展開，親水親油基團(tuán)分散在油水相之中。取6 mL待用DOX，恒壓滴定到混合相中，600 r/min下攪拌，時(shí)間2 h，轉(zhuǎn)移體系至透析袋中，用分子量為3 500的透析袋透析2 d，每1 h換一次水。隨著時(shí)間的推移，混合物中的油相越來越少。透析完經(jīng)0.45 μm的膜過濾掉不溶物和大分子物質(zhì)，冷凍干燥得包載阿霉素的納米微球。

1.4 樣品表征與性能測試

1.4.1 FT-IR光譜和1H-NMR表征

FT-IR光譜表征：將改性后的CMCS-PNIPAm接枝共聚物研磨成粉末，采用KBr壓片法，F(xiàn)T-IR測樣品采集記錄光譜數(shù)據(jù)，根據(jù)特征吸收峰推斷其化學(xué)結(jié)構(gòu)。掃描范圍從4 000～400 cm，掃描間距為4 cm-1[18]。

1H-NMR表征：將定量CMCS-PNIPAm接枝共聚物樣品溶解在D2O中，磁場強(qiáng)度為299.95 MHz，化學(xué)位移以×10-6表示，以TMS作為內(nèi)標(biāo)，譜線寬度3 264.1 Hz，掃描記錄1H-NMR圖。

1.4.2 包粒度電位測定和SEM分析

粒度電位測定：通過納米粒度-電位分析儀對(duì)空白CMCS納米微球和阿霉素CMCS納米微球的粒度和Zeta電位進(jìn)行評(píng)估。樣品濃度為1 mg/mL，測定CMCS納米微球的粒度以及電位，每個(gè)指標(biāo)測量3次。

SEM分析：用鑷子取少許光熱敏感型CMCS納米微球固體放在金屬載物臺(tái)的導(dǎo)電膠上，60 ℃烘干，通過SEM在電壓10 kV下觀察CMCS納米微球的表面形態(tài)。

1.4.3 臨界可溶溫度點(diǎn)(LCST)的測定

使用紫外-可見分光光度計(jì)(U765S，日本島津公司)在600 nm處監(jiān)測聚合物溶液的濁度或透光率。隨著溫度從25 ℃增加到42 ℃，記錄通過聚合物溶液的可見光吸收率。在每個(gè)測試溫度下，聚合物溶液平衡30 min。從測量溶液開始混濁的溫度來確定聚合物溶液的LCST。

1.4.4 CMCS微球優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及包封率與載藥量的測定

配制一定濃度的阿霉素微球溶液，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行200～800 nm的全波長掃描，確定阿霉素紫外最大吸收波長。分別精密稱取配制5，10，15，20，25，30，35和40 μg/mL的鹽酸阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最大吸收波長下測定標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。

分別以油水相比10∶1，20∶1和30∶1；乳化時(shí)間0.5，1.0和1.5 h；攪拌速度400，600和800 r/min；香草醛的量1，2和3 mL為單因素，采用L9(34) 正交試驗(yàn)，以載藥量和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，制備粒徑小且均一的納米微球。

取包埋阿霉素的微球溶液，稀釋一定倍數(shù)，在最大紫外吸收波長下測定藥物載藥量和包封率。載藥量(DL)和包封率(EE)的計(jì)算如式(3)和(4)所示

DL=We/Wm×100%

(3)

EE=We/(We+Wo)×100%

(4)

其中，We為納米微球包裹的藥物質(zhì)量；Wo為體系游離的藥物質(zhì)量 ；Wm為納米微球總質(zhì)量。

1.4.5 CMCS納米微球體外釋放

通過研究在不同溫度(25，37，40 ℃)和不同光照(無光照，光照10 s，光照60 s)條件下測定阿霉素釋放效果來探討納米微球的光熱性能。將包載藥物后的納米微球放入PBS緩沖液中，每隔0.5 h移取一定量的釋放溶液，同時(shí)補(bǔ)充相同量的空白PBS緩沖溶液，以維持釋放體系的溶液體積不變。用紫外分光光度計(jì)測定其在阿霉素紫外最大吸收波長下，每隔0.5 h測定其吸光度，并繪制阿霉素釋放曲線圖。觀察其體外釋放效果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示。當(dāng)獲得的P值<0.05時(shí)表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMCS-PNIPAm合成優(yōu)化條件分析

圖1為不同單因素條件(時(shí)間、溫度、引發(fā)劑的量和溶劑的量)與接枝率的關(guān)系圖。從圖1(a)可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，單體自由基增多，CMCS-PNIPAm共聚物的接枝率先快速上升后趨于平穩(wěn)，反應(yīng)2.5 h后，反應(yīng)基本結(jié)束，接枝率變化不大，為了保證實(shí)驗(yàn)充分反應(yīng)，最佳反應(yīng)時(shí)間為3 h。

從圖1(b)可以看出，反應(yīng)溫度低于60 ℃時(shí)，體系需要6 h以上才出現(xiàn)白色渾濁液；在60～90 ℃之間時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，產(chǎn)生的自由基增多，接枝率變大，但溫度過高，溶劑蒸發(fā)大，體系不穩(wěn)定。且由于氫鍵作用，產(chǎn)物水溶性變差。因此，最佳反應(yīng)溫度為70 ℃。

從圖1(c)可以看出，隨著引發(fā)劑用量的增加，接枝率逐漸增加，當(dāng)引發(fā)劑量10 mg時(shí)，達(dá)到極大值18.24%。然而過量引發(fā)劑會(huì)使體系產(chǎn)生過多的單體自由基，除參與接枝反應(yīng)外，還會(huì)發(fā)生均聚反應(yīng)，因PNIPAm單體總量不變，接枝率遂下降。因此，引發(fā)劑最佳用量為10 mg。

從圖1(d)可以看出，當(dāng)溶劑量<10 mL時(shí)，體系粘度太大，無法反應(yīng)。隨著溶劑量的增加，接枝率先上升后下降。溶劑量過多，體系濃度下降，接枝效率下降導(dǎo)致接枝率降低。因此，溶劑最佳用量為20 mL。

通過單因素實(shí)驗(yàn)得出最佳各單因素條件分別為：時(shí)間3 h，溫度70 ℃，引發(fā)劑的量10 mg，溶劑的量20 mL。

圖1 不同時(shí)間、溫度、引發(fā)劑的量和溶劑的量與接枝率的關(guān)系圖Fig 1 The graph of time,temperature,initiator dose and solvent dose to grafting rate

2.2 CMCS-PNIPAm表征分析

2.2.1 FT-IR光譜分析

圖1為CMCS、PNIPAm和CMCS-PNIAm共聚物的FT-IR光譜圖。從圖1(a)可以看出，CMCS的光譜特征如下：3 427 cm-1處為O-H和N-H伸縮，1 608 cm-1處為CO伸展酰胺基，1 418 cm-1處為N-H酰胺基的平面彎曲振動(dòng)，1 303 cm-1處為甲基和亞甲基的C-H彎曲振動(dòng)，1 080 cm-1歸因于CMCS中烷氧基鍵的C-O伸縮。從圖1(b)可以看出，PNIPAm的光譜特征如下：3 309 和3 076 cm-1處為PNIPAm中的N-H伸縮，2 967 和2 935 cm-1處為甲基、亞甲基和甲烷的C-H伸縮，1 649和1 541 cm-1處為特征性的寬酰胺帶吸收峰，1 457和1 374 cm-1處為甲基、亞甲基和甲烷的C-H彎曲振動(dòng)。從圖1(c)可以看出，出現(xiàn)在PNIPAm的FT-IR光譜中的吸收峰也顯示在CMCS-PNIPAm共聚物的光譜中。與CMCS的光譜圖相比，CMCS-PNIPAm共聚物光譜圖在3 600～2 900 cm-1范圍內(nèi)增加了兩個(gè)特征峰，這是由于CMCS與PNIPAm反應(yīng)，產(chǎn)物中引入的甲基、亞甲基和甲烷的C-H伸縮吸收峰，同時(shí)1 654和1 546 cm-1寬酰胺帶的接入，表明PNIPAm接枝到CMCS上，成功合成CMCS-PNIPAm共聚物。

圖2 CMCS、PNIPAm和CMCS-PNIAm的FT-IR光譜圖Fig 2 FT-IR spectra of CMCS,PNIPAm and CMCS-PAIPAm

2.2.21H-NMR 表征分析

將CMCS和CMCS-PNIPAm共聚物溶解在D2O中測得1H-NMR圖，如圖3所示。由圖3可知，化學(xué)位移1.09×10-6和1.52×10-6分別為PNIPAm中的H-2和H-3的特征共振峰，化學(xué)位移3.90×10-6為CMCS中的H-1的特征共振峰。與圖1(b) 相比，圖1(a)中出現(xiàn)了H-2和H-3的兩個(gè)特征共振峰，而H-1的特征共振峰強(qiáng)度減弱，是由于CMCS中游離的部分氨基與PNIPAm反應(yīng)消耗掉部分H+而減弱。這說明PNIPAm已經(jīng)接枝到CMCS上了。

圖3 CMCS-PNIAm共聚物和CMCS在 D2O中的1H-NMR圖Fig 3 1H-NMR spectrum of CMCS-PNIAm copolymer and CMCS in D2O

2.3 LCST的測定結(jié)果分析

圖4顯示了CMCS、PNIPAm、CMCS-PNIPAm和ICG-CMCS-PNIPAm溶液透光率隨溫度的變化情況。從圖4可以看出，隨著溫度升高至42 ℃，CMCS的透射率保持在約95.40%，而PNIPAm溶液和CMCS-PNIPAm共聚物溶液的透過率分別從98.20%降至11.56%和98.17%降至52.74%。在相同的條件下，ICG-CMCS-PNIPAm溶液隨溫度改變透射率范圍為86.43%至44.32%。該研究報(bào)告表明，CMCS溶液透射率不受溫度變化影響，PNIPAm溶液的LCST被證實(shí)約為32 ℃，CMCS-PNIPAm共聚物溶液在37.5 ℃時(shí)出現(xiàn)渾濁，根據(jù)圖4預(yù)測其LCST約為37.5 ℃，這是由于CMCS與PNIPAm之間的自由基反應(yīng)改變了該溶液體系的LSCT。此外，ICG-CMCS-PNIPAm溶液因包載了ICG影響了CMCS共軛導(dǎo)致親水改性，導(dǎo)致LCST向更高溫度的轉(zhuǎn)變。ICG-CMCS-PNIPAm的LCST值測得為38 ℃，幾乎不高于共聚物。綜上，共聚物溶液具有良好的溫敏性能和穩(wěn)定性。

圖4 CMCS、PNIPAm、CMCS-PNIPAm和ICG-CMCS-PNIPAm溶液透光率隨溫度的變化Fig 4 Variation in the transmittance of solutions of CMCS,PNIPAm,CMCS-PNIPAm and ICG-CMCS-PNIPAm as a function of temperature

2.4 CMCS納米微球粒徑和電位分析

采用納米粒度分析儀測得空白CMCS微球和包載DOX的CMCS微球平均粒徑分別為143和192 nm，均呈正態(tài)分布，如圖5所示。從圖5可以看出，空白CMCS微球PdI值為0.273，粒徑大小分布均勻主要集中在60～325 nm之間，而包載DOX的CMCS微球PdI值為0.256，由于包載了DOX，平均粒徑變大，主要集中分布在80～450 nm。研究表明，采用乳化交聯(lián)法制備的納米微球粒徑均勻。此外，采用納米粒度電位分析儀測量空白CMCS微球溶液電勢為負(fù)，約-21.2 mV，而包載DOX的CMCS微球溶液電勢為-3.71 mV，這是由于DOX上的氨基被質(zhì)子化帶正電，與空白微球表面發(fā)生靜電吸附作用導(dǎo)致，電勢的變化證實(shí)了采用乳化交聯(lián)法可以將DOX包載在帶負(fù)電荷的CMCS溶液中。

圖5 空白CMCS和包載DOX微球的粒徑分布Fig 5 Particle size distribution of quercetin nanoparticles blank CMCS and coated DOX micropheres

2.5 CMCS納米微球SEM分析

圖6為空白CMCS和包載CMCS微球的SEM圖。從圖6可以看出，CMCS納米微球微觀形態(tài)為球形，分布較為均勻。研究表明，CMCS納米微球烘干后的掃描電鏡尺寸與納米粒度及電位分析儀結(jié)果較為接近。

2.6 阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制一系列不同濃度(5,10,15,20,25,30,35和40 μg/mL)的阿霉素(DOX)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液，采用紫外分光光度計(jì)在最大波長(480 nm)條件下測得DOX吸光度。以吸光度對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖7所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.01028+0.02319*X，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.99905，線性關(guān)系良好。

圖7 阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 DOX standard curve

2.7 CMCS納米微球正交結(jié)果分析

以油水相比、轉(zhuǎn)速、香草醛的量和乳化時(shí)間為研究對(duì)象，其中微球總質(zhì)量為13 mg，阿霉素的投入量為3 mg，采用單因素正交試驗(yàn)，以載藥量和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇最佳的微球制備工藝參數(shù)。

圖6 空白CMCS和包載CMCS微球的SEM圖Fig 6 SEM images of blank CMCS and encapsulated CMCS microspheres

表1 L9 (34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 L9 (34) orthogonal test results

表1為L9 (34)正交試驗(yàn)結(jié)果。由表1可知，分析納米微球的載藥量和包封率得出，納米微球制備條件的主要影響因素為油水相比，其次是香草醛的量和乳化時(shí)間，轉(zhuǎn)速主要是乳化時(shí)對(duì)于反應(yīng)的影響以及對(duì)納米微球粒徑的影響，對(duì)納米微球載藥量和包封率影響不大。據(jù)一般規(guī)律，油水相比越大，包埋體積越大，載藥量越高，但油相過多，體系粘度過大，微球粘連使表面積減少而降低載藥量。其次香草醛越多，微球粘連嚴(yán)重，同樣降低載藥量，乳化時(shí)間主要是使微球分散均一，乳化時(shí)間長，微球分散均勻，載藥量增加，乳化時(shí)間不宜過長，過長會(huì)使體系溶劑揮發(fā)，降低載藥量。因此，制備納米微球最佳工藝參數(shù)為：油水相比為20∶1，轉(zhuǎn)速為600 r/min，香草醛滴加量為1 mL，乳化時(shí)間3 h。

2.8 CMCS納米微球載藥量和包封率分析

圖8為阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線。由阿霉素線性擬合方程得知，阿霉素的載藥量和包封率隨阿霉素投入量的增加而改變。由圖8可知，隨著阿霉素的投入量的增加，載藥量由3.81%增加到極大值23.46%，由于載藥量達(dá)到峰值，隨著阿霉素投入量的增加，載藥量緩慢下降至21.54%，同時(shí)，阿霉素的包封率由90.00%下降到52.33%。隨著阿霉素的投入量增加，載藥量呈現(xiàn)先快速上升后緩慢下降趨勢，包封率下降趨勢先快后慢，兩者變化規(guī)律相似。結(jié)果表明，CMCS納米微球?qū)Π⒚顾鼐哂辛己玫陌裥Ч?，提高了藥物的利用率?/p>

圖8 阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 8 DOX standard curve

2.9 CMCS納米微球體外釋放結(jié)果分析

通過研究在不同溫度和不同光照時(shí)間條件下的DOX體外釋放情況來探討CMCS納米微球的光熱性能，如圖9所示。由圖9(a)可知，在溫度為25 ℃條件下，CMCS納米微球僅釋放約36.65%的阿霉素；當(dāng)溫度升至37和40 ℃時(shí)，阿霉素的釋放量分別增至70.46%和87.26%。由于納米微球表面可以獲得未結(jié)合的阿霉素藥物，所以3個(gè)溫度條件下前期釋放速度均有所增加，隨著時(shí)間的延長，由于PNIPAm的穩(wěn)定親水片段，阿霉素在溫度(25 ℃)下釋放減少，當(dāng)溫度高于LCST溫度時(shí)，CMCS-PNIPAm聚合物發(fā)生相變，親水鏈崩塌，納米微球的溶劑化層破壞變形，堅(jiān)固性減弱導(dǎo)致阿霉素釋放增多。由圖9(b)可知，無光照條件下阿霉素釋放量為38.15%。隨著光照時(shí)間的延長，阿霉素釋放量分別為66.46%和90.26%。用近紅外光在808 nm波長下照射微球透析袋，光敏劑吲哚菁綠(ICG)吸收近紅外光，并將光能轉(zhuǎn)化為熱能，升高體系溫度，使CMCS-PNIPAm聚合物發(fā)生相變，結(jié)構(gòu)被破壞，加速阿霉素的釋放，增加了其釋放量。該實(shí)驗(yàn)表明，CMCS納米微球具有良好的光熱性能效果，有助于藥物的把控釋放。

圖9 CMCS納米微球在不同溫度和不同光照時(shí)間條件下阿霉素的釋放曲線Fig 9 In vitro release profile of DOX from CMCS nanospheres under different temperatures and illuminations

3 結(jié) 論

以羧甲基殼聚糖材料為載體，通過乳化交聯(lián)法制備光熱敏感型羧甲基殼聚糖納米微球，并成功包載了抗癌藥物阿霉素。光熱敏感型羧甲基殼聚糖納米微球載體，表現(xiàn)出更高的藥物負(fù)載能力，同時(shí)通過改變外界環(huán)境條件，能有效地提高藥物利用率，增強(qiáng)藥物靶向作用[20-22]。此外，改性后的羧甲基殼聚糖粘附性和通透性均顯著增強(qiáng)，有效提高了藥物的包埋率和釋放量[23]。研究得出以下結(jié)論：

(1)通過CMCS-PNIPAm共聚物的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出，最佳各單因素條件分別為反應(yīng)時(shí)間3 h，溫度70 ℃，引發(fā)劑的量10 mg，溶劑的量20 mL。經(jīng)FT-IR光譜分析，確定合成了CMCS-PNIPAm共聚物，紅外測得CMCS-PNIPAm共聚物和PNIPAm在1 400～1 660 cm-1處出現(xiàn)特征峰幾乎相同，與K.B.Miles等[24]和R.Nantharak等[25]測得結(jié)果相似。并通過1H-NMR表征分析發(fā)現(xiàn)，化學(xué)位移在1.09×10-6，1.52×10-6和3.90×10-6處特征共振峰的改變是由于接枝上PNIPAm而產(chǎn)生的變化，進(jìn)一步證實(shí)合成了CMCS-PNIPAm共聚物。

(2)粒度分析表明，空白納米微球和包載DOX納米微球PdI值分別為0.273和0.256，證明乳化處理有利于納米微粒粒徑均勻。通過Zeta電位研究表明，空白納米微球在水性環(huán)境中帶負(fù)電約-21.2 mV，而包載藥物后電勢為-3.71 mV，證實(shí)了采用乳化交聯(lián)法可以將DOX包載在帶負(fù)電荷的CMCS納米微球溶液中，體系較為穩(wěn)定[25]。SEM分析發(fā)現(xiàn)，納米微球微觀結(jié)構(gòu)為球形，表面光滑，比表面大，與其它納米載體相比有利于載藥量的提升。利用紫外分光光度計(jì)法，測得阿霉素納米微球最高載藥量為23.46%，研究表明在阿霉素投入量在0.5～7.0 mg的范圍內(nèi)，納米微球載藥量與阿霉素投入量先正相關(guān)后負(fù)相關(guān)，呈現(xiàn)出極大鋒值，而包封率與其投入量負(fù)相關(guān)。通過L9(34)正交試驗(yàn)以包載率和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)得出，制備納米微球最佳工藝參數(shù)為：油水相比為20∶1，轉(zhuǎn)速為600 r/min，香草醛滴加量為1 mL，乳化時(shí)間3 h。

(3)通過紫外分光光度計(jì)測得CMCS-PNIPAm溶液和ICG-CMCS-PNIPAm溶液的臨界溫度分別為37.5和38.0 ℃，溫敏性能敏感且穩(wěn)定。體外釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過改變外界環(huán)境條件，阿霉素的釋放情況也隨之改變。在25 ℃條件下，CMCS納米微球釋放的阿霉素釋放量比37和40 ℃時(shí)的阿霉素的釋放量少。這是由于當(dāng)溫度高于LCST溫度時(shí)，CMCS-PNIPAm聚合物發(fā)生相變，親水鏈崩塌，納米微球的溶劑化層破壞變形，堅(jiān)固性減弱導(dǎo)致阿霉素釋放增多，可見其溫敏性能良好。在近紅外光照下，阿霉素釋放量比無光照條件時(shí)多，且因不同光照時(shí)間其釋放量也不同，可見其光敏感性能和光熱轉(zhuǎn)化效果良好。

由此可見，制備的羧甲基殼聚糖納米微球光熱性能良好，能把控藥物緩釋，為開發(fā)通過光熱調(diào)控藥物釋放提高載藥量的納米載體具有重大意義。