高 翔， 羅 靜， 錢佳怡， 梁 雪， 張一帆， 李小杰， 陳明清

（江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，合成與生物膠體教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

超支化聚合物是繼線形、支鏈形和交聯(lián)聚合物之后一類新型的合成高分子[1,2]。與線形聚合物不同，超支化聚合物具有高度支化、三維橢球狀結(jié)構(gòu)、表面官能團豐富等與樹枝狀聚合物類似的特點，能包埋和化學(xué)鍵合客體分子，并可以進行功能改性。由于其獨特的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)以及簡單的合成步驟，超支化聚合物被廣泛關(guān)注[3,4]，在納米載體、催化、光電材料等領(lǐng)域已經(jīng)展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力[5,6]。

近年來，生物相容性好、具備生物降解能力的超支化聚合物的合成及應(yīng)用已經(jīng)成為研究熱點[7]。國內(nèi)外科學(xué)家們通過對超支化聚合物分子結(jié)構(gòu)進行設(shè)計，構(gòu)筑了很多可生物降解的超支化聚合物?？茖W(xué)家們合成了可在pH、氧化還原、蛋白酶等作用下降解的超支化聚合物，包括聚縮酮羥基醚[8]、聚酰腙[9,10]、聚磷酸酯[11-13]、聚多肽[14]等超支化聚合物，研究了它們的自組裝行為，以及在藥物輸送領(lǐng)域的應(yīng)用。在基因治療研究方面，科學(xué)家們通過將二硫鍵[15-17]或者酯鍵[18]引入超支化聚合物骨架，合成了可生物降解的超支化聚（酰胺-胺）和超支化聚酯胺，與不能生物降解的超支化聚乙烯亞胺（HPEI）相比，它們的細胞毒性大大降低，提高了超支化聚合物在基因治療應(yīng)用中的安全性。其中超支化聚酯胺大多采用碳鏈的二丙烯酸酯類化合物作為A2單體（含有兩個A 基因的單體，其余類推）通過邁克爾加成聚合反應(yīng)制得，此類超支化聚酯胺的水溶性和生物相容性較差，而聚乙二醇（PEG）是一種用途廣泛的醚類高分子化合物，具有良好的水溶性和生物相容性，在生物體內(nèi)能溶于組織液中，能被機體迅速排出體外而不產(chǎn)生毒副作用，而且當把PEG 和其他分子偶合時它的許多優(yōu)良性能也會隨之轉(zhuǎn)移到結(jié)合物中[19，20]。利用PEG 對超支化聚酯胺表面進行改性，可使其水溶性得以改善。朱新遠等[21]利用聚乙二醇二丙烯酸酯的A2單體和胺類的B4單體通過邁克爾加成聚合反應(yīng)合成了端胺基的超支化聚酯胺并用于基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，但此A2+B4聚合方法會產(chǎn)生凝膠化現(xiàn)象，不適用于合成端基為丙烯酸酯的超支化聚合物。

本文首先以含PEG 長鏈的聚乙二醇二丙烯酸酯為A2單體，N-乙基乙二胺為B'B2單體，合成了表面含丙烯酸酯鍵、骨架含PEG、內(nèi)部含叔胺的具有三維橢球狀結(jié)構(gòu)的超支化聚酯胺。然后利用咪唑中的胺基與丙烯酸酯鍵的邁克爾加成反應(yīng)，對超支化聚酯胺進行功能化改性，并對改性后超支化聚酯胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子組成進行了表征，初步研究了其水溶性和pH 響應(yīng)性。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）：化學(xué)純，西格瑪化學(xué)試劑有限公司；N-乙基乙二胺、N-甲基咪唑：化學(xué)純，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；咪唑、二甲基亞砜（DMSO）、氯仿、無水乙醚：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 測試與表征

核磁共振（NMR）譜儀（瑞士Bruker 公司AVANCE 400 MHz 型）：以DMSO-d6或CDCl3為溶劑，四甲基硅氧烷為內(nèi)標；傅里葉紅外（FT-IR）光譜儀（中國賽默飛世爾科技公司Nicolet iS50 型）：采用溴化鉀涂膜制樣，波數(shù)范圍500～3 000 cm-1，分辨率為2 cm-1；凝膠滲透色譜儀（美國沃世特公司W(wǎng)aters GPC 486 型）：以四氫呋喃（THF）為流動相，PEG 為標準樣；Zeta 電位及納米粒度分析儀（美國布魯克海文儀器公司 Zeta PALS 型）：采用鈀電極測量，掃描時間5 min；GPC-MALLS 多角度激光散射系統(tǒng)（美國懷雅特技術(shù)公司DAWN HELEOS II型）：以N，N-二甲基甲酰胺為流動相，樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL。

1.3 實驗步驟

1.3.1 超支化聚酯胺的合成 向圓底燒瓶中加入PEGDA（0.02 mol）、30 mL DMSO（0.2 g/mL），在60 ℃下攪拌均勻并且通氮排除空氣，將N-乙基乙二胺（0.882 g，0.01 mol）加入到燒瓶中，避光反應(yīng)24 h，得到超支化聚酯胺。依據(jù)原料PEGDA 的數(shù)均分子量250 和575，將樣品分別標記為HBPAE-250 和HBPAE-575。合成路線如圖1 所示。

1.3.2 咪唑功能化超支化聚酯胺（HBPAE-imidazole）的合成 向100 mL 圓底燒瓶中加入PEGDA（Mn=250，5.000 g，0.02 mol）、30 mL DMSO，在60 ℃下攪拌均勻并且通氮排除空氣，將N-乙基乙二胺（0.882 g，0.01 mol）加入到燒瓶中，避光反應(yīng)24 h。將N-甲基咪唑（0.164 g，2 mmol）、咪唑（2.042 g，0.03 mol）加入燒瓶中，并升溫至70 ℃，避光反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溶液在無水乙醚中沉淀、氯仿溶解，沉淀-溶解3 次，最終旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到黃色黏稠液體HBPAE-imidazole 6.235 g，產(chǎn)率為78.69%。

圖 1 超支化聚酯胺的合成路線Fig. 1 Synthesis route of hyperbranched poly(amino-ester)

2 結(jié)果與討論

2.1 超支化聚酯胺的合成

由PEGDA 和N-乙基乙二胺合成超支化聚酯胺的合成機理如圖2 所示。由于N-乙基乙二胺中伯胺的反應(yīng)活性高于仲胺，所以雙鍵會先與伯胺進行邁克爾加成反應(yīng)，生成AB2型中間體，進而發(fā)生AB2型單體的自縮聚，最終生成超支化聚酯胺。

圖 2 超支化聚酯胺的合成機理Fig. 2 Synthesis mechanism of hyperbranched poly(amino-ester)

反應(yīng)過程中對樣品不提純進行實時核磁檢測，利用1H-NMR 譜圖中各基團的化學(xué)位移及積分比例來確定聚合反應(yīng)程度。圖3（a，b）分別為不同反應(yīng)時間下HBPAE-250、HBPAE-575 的1H-NMR 譜圖，化學(xué)位移4.0～4.1 處為與酯基相連的亞甲基質(zhì)子峰，4.1～4.3 處為與丙烯酸酯基相連的亞甲基質(zhì)子峰，5.8～6.5 處為丙烯酸酯鍵上的雙鍵質(zhì)子峰。隨著反應(yīng)的進行，與丙烯酸酯基相連的亞甲基和雙鍵的質(zhì)子峰積分面積逐漸減小，與普通酯基相連的亞甲基質(zhì)子峰積分面積逐漸增加，通過核磁譜圖中積分面積的變化，可以計算聚合反應(yīng)的程度。聚合反應(yīng)程度與時間的關(guān)系如圖3（c，d）所示。由圖3（c，d）可見，兩種體系的聚合反應(yīng)程度都隨著時間的增加而增加，HBPAE-250 體系在反應(yīng)到24 h 時聚合反應(yīng)程度達到99.0%，反應(yīng)48 h 時達到100%；HBPAE-575 體系在反應(yīng)到24 h 時，聚合反應(yīng)程度僅為70%，反應(yīng)48 h 時僅達到78%。

圖 3 不同時間下HBPAE 的1H-NMR 譜圖（a，b）和聚合反應(yīng)程度（c，d）Fig. 3 1H-NMR spectra （a, b） and degree of polymerization （c,d） of HBPAE at different time

與HBPAE-250 相比，HBPAE-575 由于A2單體分子量的增大，鏈長度增大，導(dǎo)致分子鏈兩側(cè)的丙烯酸酯基團反應(yīng)位阻增大，反應(yīng)活性降低，聚合反應(yīng)程度降低。因此，本文將反應(yīng)體系溫度提高至80 ℃進行反應(yīng)，并利用1H-NMR 監(jiān)測反應(yīng)的進行，結(jié)果匯總于表1。由表1 可見，當體系反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時間為48 h 時，HBPAE-575 體系聚合反應(yīng)程度僅有80.0%，聚合反應(yīng)程度提高不明顯。當繼續(xù)提高反應(yīng)溫度至100 ℃時，聚合反應(yīng)體系極易發(fā)生凝膠。

研究表明，合成表面含丙烯酸酯鍵、骨架含PEG、內(nèi)部含叔胺的具有三維橢球狀結(jié)構(gòu)的超支化聚酯胺的反應(yīng)條件是：A2單體為Mn=250 的PEGDA，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時間為24 h。

表 1 不同時間和溫度下的聚合反應(yīng)程度Table 1 Degree of polymerization at different time and temperatures

2.2 HBPAE-250 的結(jié)構(gòu)表征

超支化聚酯胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4 所示。HBPAE-250 提純后的1H-NMR 和FT-IR 譜圖如圖5 所示。HBPAE-250 的核磁共振氫譜圖中，化學(xué)位移2.5～3.0 處出現(xiàn)與N 相連亞甲基的質(zhì)子峰，4.0～4.1 處出現(xiàn)與酯基相連的亞甲基的質(zhì)子峰，4.1～4.3 處為與丙烯酸酯基相連的亞甲基質(zhì)子峰，5.8～6.5 處為丙烯酸酯鍵上的雙鍵質(zhì)子峰，其他質(zhì)子峰的位置以及積分面積如圖5（a）所示。HBPAE-250 的紅外譜圖中，1 734 cm-1處出現(xiàn)了―C＝O 的伸縮振動峰，1 360 cm-1處出現(xiàn)了C―N 的伸縮振動峰。結(jié)果表明，超支化聚酯胺合成成功。

由于HBPAE-250 不能通過核磁共振氫譜計算其支化度，因此通過GPC-MALLS 對其拓撲結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果如圖6 所示。圖6 為HBPAE-250 的Mark-Houwink-Sakurada 曲線。測試得到Mark-Houwink 參數(shù)（α）為0.417，超支化聚合物的α 一般為0.2～0.5[22]，證明HBPAE-250 具有高度支化結(jié)構(gòu)。

2.3 HBPAE-imidazole 的結(jié)構(gòu)表征

圖 4 超支化聚酯胺的結(jié)構(gòu)式Fig. 4 Chemical structure of hyperbranched poly(amino-ester)

圖 5 HBPAE-250 的1H-NMR（a）和紅外譜圖（b）Fig. 5 1H-NMR （a） and FT-IR （b） spectra of HBPAE-250

HBPAE-imidazole 的結(jié)構(gòu)式、1H-NMR 圖譜、FT-IR 光譜和GPC 曲線如圖7 所示。HBPAE-imidazole 的1H-NMR 譜圖中，5.8～6.5 處丙烯酸酯鍵上的雙鍵質(zhì)子峰消失，6.8～7.5 處出現(xiàn)咪唑上亞甲基的質(zhì)子峰，其他質(zhì)子峰的位置和積分面積如圖7（b）所示。HBPAEimidazole 的紅外譜圖中，1 360 cm-1處為C—N 的伸縮振動峰，其他基團特征峰如圖7（c）所示。通過HBPAE-imidazole 的GPC 曲線測得其Mw=1.42×103，Mn=1.36×103，PDI=1.05。結(jié)果證明HBPAE-imidazole已成功合成。

圖 6 HBPAE-250 的Mark-Houwink-Sakurada 曲線Fig. 6 Mark-Houwink-Sakurada curves of HBPAE-250

2.4 超支化聚酯胺的水溶性和pH 響應(yīng)性

將HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 分別溶解于pH 為7.4 和6.0 的PBS 緩沖液（20 mg/mL）中，溶液的數(shù)碼照片如圖8 所示。從圖8 可觀察到，在pH 為7.4 和6.0 的緩沖液中，HBPAE-250 和HBPAEimidazole 都呈淡黃色透明狀，表現(xiàn)出良好的水溶性。但是HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 在pH 為7.4 的緩沖液中溶解時間略長，這是因為兩者內(nèi)部均含大量叔胺，在酸性條件下，叔胺發(fā)生質(zhì)子化，聚合物攜帶大量正電荷，從而導(dǎo)致聚合物的溶解更快。結(jié)果表明PEG 的引入賦予了超支化聚酯胺水溶性。

圖 7 HBPAE-imidazole 的結(jié)構(gòu)式 （a），1H-NMR 譜圖 （b），F(xiàn)T-IR 譜圖 （c） 和GPC 曲線 （d）Fig. 7 Chemical structure （a）, 1H-NMR spectrum （b）, FT-IR spectrum （c） and GPC curve （d） of HBPAE-imidazole

圖 8 HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 在不同pH 的PBS 緩沖液中的數(shù)碼照片F(xiàn)ig. 8 Photos of HBPAE-250 and HBPAE-imidazole in PBS buffer at different pH values

圖 9 不同pH 下HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 的Zeta 電位Fig. 9 Zeta potential of HBPAE-250 and HBPAE-imidazole at different pH values

將HBPAE-imidazole 和HBPAE-250 分別溶于PBS 緩沖液（20 mg/mL）中進行Zeta 電位測試，結(jié)果如圖9 所示。兩種聚合物的Zeta 電位隨著pH 的增大而減小，這是因為HBPAE-250 和HBPAE-imidazole內(nèi)部均含大量叔胺，在低pH 時，叔胺易發(fā)生質(zhì)子化，使聚合物攜帶大量正電荷；而相同pH 下HBPAEimidazole 的Zeta 電位遠比HBPAE-250 的Zeta 電位高，這是因為HBPAE-imidazole 表面含有大量咪唑基團，叔胺數(shù)量遠高于HBPAE-250，導(dǎo)致叔胺質(zhì)子化后，攜帶的正電荷數(shù)量更多。結(jié)果表明咪唑基團的引入大大提高了超支化聚酯胺的pH 響應(yīng)性。

3 結(jié) 論

（1）合成表面含丙烯酸酯鍵、骨架含PEG、內(nèi)部含叔胺的具有三維橢球狀結(jié)構(gòu)的超支化聚酯胺的適宜條件：A2單體為Mn=250 的聚乙二醇二丙烯酸酯，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時間為24 h。

（2）聚乙二醇的引入賦予了超支化聚酯胺水溶性。

（3）利用咪唑?qū)羌芎琍EG 的超支化聚酯胺進行功能化改性，提高了超支化聚酯胺的pH 響應(yīng)性。