魏小晶，周桓丞，靳亞梅，蔡靜靜，倪永清，張 艷

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

嬰幼兒期是腸道菌群定植的關(guān)鍵時(shí)期，嬰幼兒腸道微生物群的發(fā)育和成熟是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、非隨機(jī)的過(guò)程[1]，此過(guò)程中腸道菌群的建立影響著嬰幼兒免疫系統(tǒng)的構(gòu)建及未來(lái)成長(zhǎng)過(guò)程中疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，在母乳喂養(yǎng)兒腸道內(nèi)大量存在的雙歧桿菌（Bifidobacterium）為嬰幼兒胃腸道健康提供獨(dú)特的保護(hù)作用[2]。雙歧桿菌是存在于人體和動(dòng)物胃腸道的一種革蘭氏陽(yáng)性、專(zhuān)性厭氧、呈多形態(tài)的桿菌[3]。最初于1899年被Tissier從母乳喂養(yǎng)兒的糞便中分離而來(lái)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該雙歧桿菌具有治療嬰幼兒腸道腹瀉、促進(jìn)健康的作用[4]。后來(lái)有研究顯示雙歧桿菌是人體與微生物相互作用中的關(guān)鍵共生體，其在維持人體胃腸道健康方面扮演著至關(guān)重要的角色[5]。定植于人體腸道中的雙歧桿菌具有抑制病原微生物增殖、抗過(guò)敏、抗腫瘤、治療乳糖不耐癥、調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障功能、免疫功能及控制內(nèi)毒血癥等作用[6-8]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)可雙歧桿菌對(duì)人體的益生作用[9]，其作為益生菌篩選的首要菌種，必須具備一定的特性，如能夠?qū)ξ杆帷⒛扄}有抗性，能在腸道中定植以及對(duì)宿主具有安全性[10]。Delcaru等[11]研究證實(shí)雙歧桿菌對(duì)大腸埃希菌、李斯特菌和芽孢桿菌等有拮抗作用；也有研究表明嬰兒雙歧桿菌抑制病原菌的生長(zhǎng)可能是產(chǎn)生的非有機(jī)酸類(lèi)的廣譜抑菌物質(zhì)發(fā)揮作用[12]；1984年Anand等[13]首次發(fā)現(xiàn)由兩歧雙歧桿菌NCDC 1452產(chǎn)生的拮抗性物質(zhì)雙歧菌素；隨后Cheikhyoussef等[14]分別從嬰兒雙歧桿菌BCRC 14602分離得到雙歧菌素，從長(zhǎng)雙歧桿菌DJO10A中分離得到羊毛硫細(xì)菌素。隨著對(duì)雙歧桿菌益生性能更進(jìn)一步的探究，有研究發(fā)現(xiàn)在嬰幼兒配方食品中添加益生雙歧桿菌對(duì)于輔助治療兒童性過(guò)敏、腹瀉等疾病具有很大的潛力[15]；Arboleya等[16]通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)部分雙歧桿菌可作為益生菌添加于新生兒配方奶粉中，人源雙歧桿菌益生特性研究的主要目的在于為益生雙歧桿菌功能性食品的研發(fā)提供優(yōu)良菌株，然而目前針對(duì)我國(guó)少數(shù)民族群體中益生雙歧桿菌的開(kāi)發(fā)研究相對(duì)較少，尤其是產(chǎn)細(xì)菌素雙歧桿菌鮮見(jiàn)報(bào)道[17]，有待后期進(jìn)行更深入的研究。

喀什地區(qū)位于我國(guó)西北部，新疆維吾爾自治區(qū)的西南部，長(zhǎng)年干冷水分蒸發(fā)強(qiáng)，晝夜溫差大，地域性分明，世代生活在當(dāng)?shù)氐纳贁?shù)民族眾多且各自有不同的飲食習(xí)慣，進(jìn)而直接影響少數(shù)民族群體的腸道微生物菌群。雙歧桿菌作為一種重要的腸道有益微生物，對(duì)嬰幼兒的健康發(fā)揮著重要的作用，因此分離得到可以在腸道內(nèi)定植的益生雙歧桿菌具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。本研究旨在從喀什地區(qū)嬰幼兒腸道糞便中分離鑒定雙歧桿菌，對(duì)其遺傳差異進(jìn)行分析，并從中分離篩選具有潛在益生特性的雙歧桿菌菌株，以期為開(kāi)發(fā)適應(yīng)人體腸道的高活性益生雙歧桿菌及為其他益生菌產(chǎn)品的研發(fā)奠定相關(guān)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

26 份嬰幼兒糞便樣品采集自新疆喀什市不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)（伽師縣、夏阿瓦提鄉(xiāng)及克孜勒蘇鄉(xiāng)）母乳喂養(yǎng)的不同月份健康嬰兒，嬰幼兒皆為順產(chǎn)且無(wú)其他病史。采集每一位嬰幼兒的新鮮糞便樣品適量，放入已滅菌的采樣管中，并立即加入適量的保護(hù)劑（糞便-保護(hù)劑體積比為1∶2），作好標(biāo)記，將采樣管口密封后置于-4 ℃車(chē)載冰箱中保存，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

1.1.2 指示菌

抑菌實(shí)驗(yàn)采用的致病菌分別為致瀉大腸埃希氏菌Escherichia coliO127:K63（CICC 10411）、出血性大腸埃希氏菌E. coliO157:H7（CICC 21530）、單核細(xì)胞性李斯特菌Listeria monocytogenes（CGMCC 1.9136）、無(wú)害李斯特菌L. innocua（CGMCC 1.2990）、鼠傷寒血清型腸沙門(mén)氏菌腸亞種Salmonella entericasubsp.enterica serovar typhimurium（CICC 10420）及血清型腸炎沙門(mén)氏菌腸亞種S. entericasubsp.enterica（CGMCC 1.10754），購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、ddH2O 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司； Marker 北京天根生化科技有限公司；PCR引物 上海 捷瑞生物工程有限公司；0.22 μm微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；Wilkins-Chalgren厭氧瓊脂培養(yǎng)基 山東拓普生物工程有限公司；改良MRS（de Man, Rogosa, Sharpe）培養(yǎng)基、LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、胨酵母浸膏葡萄糖（peptone yeast extract glucose，PYG）培養(yǎng)基、胰胨大豆瓊脂（trypcasein soy agar，TSA）斜面培 養(yǎng)基 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；14 種碳源及牛膽鹽 北京索萊寶科技有限公司；抗生素藥片 江西盈科科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG520厭氧培養(yǎng)箱 英國(guó)DWS公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；TC-512 PCR儀 英國(guó)Techne公司；PowerPac Universal水平電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 雙歧桿菌的分離純化

將1 g新鮮糞便樣品用添加有0.5% L-半胱氨酸的生理鹽水梯度稀釋至10-2、10-3、10-4，分別吸取100 μL進(jìn)行平板涂布，于厭氧箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，使用相差顯微鏡對(duì)單菌落進(jìn)行鏡檢，將V形、分枝或分叉形、棍棒狀或匙形的桿狀菌株轉(zhuǎn)接劃線培養(yǎng)3 次，挑選純化后的單菌落于添加了0.5% L-半胱氨酸的改良MRS液體培養(yǎng)基中厭氧富集，通過(guò)革蘭氏染色及接觸酶實(shí)驗(yàn)初步篩選疑似雙歧桿菌，將純培養(yǎng)物5 000 r/min離心10 min，棄上清液后重懸于50%的甘油中保藏，置于-80 ℃冷凍冰箱。

1.3.2 雙歧桿菌屬間鑒定、16S rRNA基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株DNA的提取依據(jù)苯酚-氯仿-玻璃珠擊打的方法進(jìn)行[18]。經(jīng)PCR指紋去重、雙歧桿菌屬間鑒定后挑選代表性菌株進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序分析。采用通用引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’），95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)（BLAST），采用CLUSTAL X1.83軟件排列對(duì)齊序列[19]，并用MAGE 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 基因外重復(fù)回文序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（repetitive extragenic palindromic elements-polymerase chain reaction，rep-PCR）指紋圖譜分析

采用引物(GTG)5和BOXAIR對(duì)分離菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。所有反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，其中：PCR Master Mix 12.5 μL，引物(GTG)5或BOXAIR（10 μmol/L）1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0 g/100 mL的瓊脂糖凝膠在0.5×TAE Buffer中，80 V電泳5 h后，在紫外凝膠成像儀下拍照保存，采用軟件Gel Compar II對(duì)基因指紋圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析。

表 1 rep-PCR引物和PCR條件Table 1 Sequences of primers and PCR conditions used for rep-PCR

1.3.4 雙歧桿菌益生特性分析

1.3.4.1 抑菌實(shí)驗(yàn)

將分離得到的雙歧桿菌按2%的接種量接種于添加0.5% L-半胱氨酸的改良MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后將菌株發(fā)酵液離心（12 000×g，10 min，4 ℃），通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾得到無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液（cell-free supernatant，CFS），4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將指示菌株致瀉大腸埃希氏菌CICC 10411、出血性大腸埃希氏菌CICC 21530接種于LB液體培養(yǎng)基，單核細(xì)胞性李斯特菌CGMCC 1.9136、無(wú)害李斯特菌CGMCC 1.2990接種于PYG液體培養(yǎng)基，鼠傷寒血清型腸沙門(mén)氏菌腸亞種CICC 10420、血清型腸炎沙門(mén)氏菌腸亞種CGMCC 1.10754分別接種于TSA液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，取1 mL指示菌懸液于無(wú)菌生理鹽水中梯度稀釋至濃度約為106～107CFU/mL。吸取100 μL稀釋后的菌懸液均勻涂布于每種指示菌相對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基表面，隨后將牛津杯輕輕按壓其上，再向杯中加入200 μL CFS，同時(shí)以不加菌的MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照。在4 ℃冰箱預(yù)擴(kuò)散6 h后，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑大小，確定抑菌能力，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行，取平均值。

1.3.4.2 抑菌雙歧桿菌糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Dong Xiuzhu等[20]描述的方法進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并做空白對(duì)照，所用碳源包括葡萄糖、木糖、核糖、甘露糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇。

1.3.4.3 耐酸、耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

菌株耐酸性實(shí)驗(yàn)依據(jù)Owusu-Kwarteng等[21]改良方法進(jìn)行。將活化后的雙歧桿菌按2%接種量接種于添加0.5% L-半胱氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h，無(wú)菌條件下離心（10 000×g，5 min，4 ℃）棄上清液，用pH 7.2磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）將菌體洗滌2 次后，重懸于不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0）處理后PBS中，37 ℃厭氧培養(yǎng)4 h后取樣涂平板，24 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行；相同的方法將菌體重懸于不同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.3%、0.5%、1%）處理后的PBS中，取樣涂平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行；將菌懸液加入到未經(jīng)任何處理的PBS中作為空白對(duì)照，涂板后置于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果，按下式計(jì)算存活率：

式中：N1為不同pH值或膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理后平板上的活菌數(shù)/（CFU/mL）；N為對(duì)照樣品中的活 菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)C L S I（2012）[22]，抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行。吸取100 μL活化后濃度在107～108CFU/mL的雙歧桿菌菌懸液，使用無(wú)菌棉簽將其均勻涂布于MRS瓊脂平板表面，將藥片輕輕貼于其上，37 ℃倒置厭氧培養(yǎng)36 h，檢測(cè)抑菌圈直徑，每種抗生素做3 個(gè)平行。10 種常用抗生素藥敏紙片（OXOID）中抗生素的含量分別為：青霉素（10 μg/片）、氨芐西林（10 μg/片）、苯唑西林（1 μg/片）、頭孢噻肟（30 μg/片）、利福平 （5 μg/片）、慶大霉素（120 μg/片）、阿米卡星 （3 0 μ g/片）、四環(huán)素（3 0 μ g/片）、米洛環(huán)素 （30 μg/片）、萬(wàn)古霉素（30 μg/片）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Gel Compar II凝膠分析軟件進(jìn)行指紋圖譜聚類(lèi)分析，采用NTSYS-pc 2.01軟件對(duì)糖發(fā)酵代謝情況進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，熱圖的繪制采用Heml 1.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌的分離與鑒定

從不同來(lái)源的26 份嬰幼兒糞便中共分離得到180 株純培養(yǎng)物，經(jīng)鏡檢菌落形態(tài)、革蘭氏染色及過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)初步確定疑似雙歧桿菌。通過(guò)雙歧桿菌屬間鑒定，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序。測(cè)序所得序列經(jīng)BLAST同源性比對(duì)后最終確定有75 株為雙歧桿菌。其中長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種（B. longum subsp. infantis）33 株，長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種（B. longum subsp. suis） 8 株，兩歧雙歧桿菌（B. bifidum）19 株，假小鏈雙歧桿菌（B. pseudocatenulatum）10 株，青春雙歧桿菌 （B. adolescentis）5 株。

2.2 雙歧桿菌遺傳差異性分析

根據(jù)rep-PCR指紋分型技術(shù)，從同種指紋帶型相同的菌株中挑選2～4 個(gè)典型菌株，共得到27 株代表性雙歧桿菌，采用Gel Compar II軟件將兩種不同引物對(duì)應(yīng)的指紋圖譜進(jìn)行聚類(lèi)。由BOXAIR-PCR和(GTG)5-PCR指紋聚類(lèi)圖（圖1）可以清晰看出，27 株雙歧桿菌的指紋圖譜帶型較豐富，能夠反映菌株在種水平上的遺傳差異。

BOXAIR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小在300～5 000 bp之間，包括3～8 個(gè)明顯的亮帶，并有一些弱帶；(GTG)5-PCR指紋圖譜也在300～5 000 bp范圍內(nèi)并有1～10 個(gè)相對(duì)明顯的條帶，大多數(shù)產(chǎn)物的條帶數(shù)在5 條以上。由圖1可知，27 株代表性雙歧桿菌根據(jù)指紋相似性被聚為4 群，Cluster I由3 株B. longumsubsp.suis和11 株B. longumsubsp.infantis組成，在3 株B. longumsubsp. suis中菌株f65-5和f65-1帶型相似，而菌株f65-6的帶型與它們相差較大，其中11 株B. longumsubsp. infantis有4 種帶型；Cluster II由6 株B. bifidum構(gòu)成，菌株f107-11、f107-7和f105-15帶型相似，但明顯不同于其他3 個(gè)菌株，存在2 種帶型；Cluster III由5 株B. pseudocatenulatum組成，其中菌株f115-8和f40-16帶型相似，菌株f40-15的帶型與它們相差較大，尤其是BOXAIR-PCR擴(kuò)增的指紋圖譜條帶更為明顯；Cluster IV由2 株帶型相似B. adolescentis組成。27 株雙歧桿菌種間具有明顯差異，遺傳多樣性較豐富。

圖 1 基于rep-PCR擴(kuò)增的27 株代表性雙歧桿菌的聚類(lèi)圖Fig. 1 Dendrogram depicting 27 representative Bifidobacterium strains according to the genetic profiles obtained by rep-PCR

2.3 益生特性分析

2.3.1 抑菌活性分析

采用牛津杯法檢測(cè)27 株雙歧桿菌對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)菌株中有16 株雙歧桿菌發(fā)酵上清液具有較好的抑菌性能，均可以抑制致瀉大腸埃希氏菌CICC 10411、出血性大腸埃希氏菌CICC 21530、鼠傷寒血清型腸沙門(mén)氏菌腸亞種CICC 10420和血清型腸炎沙門(mén)氏菌腸亞種CGMCC 1.10754；其中B. longumsubsp.infantis中菌株f65-26、f115-9、f107-6、f77-16和f77-11的抑菌性能較好；在B. longumsubsp.suis中菌株f65-5、f65-1的抑菌能力較強(qiáng)，具有廣譜抑菌性；在B. bifidum中菌株f107-7和f105-15可以抑制本實(shí)驗(yàn)中所有的腸道致病菌；相對(duì)而言，B. adolescentis菌株抑菌能力很弱。

表 2 雙歧桿菌菌株的抑菌活性分析Table 2 Bacteriostatic activities of Bifidobacteria strains

2.3.2 抑菌雙歧桿菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

圖 2 基于16S rRNA序列抑菌雙歧桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of Bifidobacterium with bacteriostatic activity based on 16S rRNA sequences

將具有較好抑菌活性的16 株雙歧桿菌的部分16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取序列相似度高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2，由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，16 株雙歧桿菌被劃分為3 個(gè)分支。其中B. longumsubsp.infantis和B. longumsubsp.suis親緣關(guān)系較近，分布在同一個(gè)大分支上；B. pseudocatenulatum和B. bifidum各自構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的大分支，相似度分別達(dá)到99%和100%。

2.3.3 抑菌雙歧桿菌的碳源代謝分析

根據(jù)Dong Xiuzhu等[20]的方法對(duì)16 株雙歧桿菌進(jìn)行14 種糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，碳源代謝結(jié)果使用NTSYS-pc 2.01軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)（圖3）。根據(jù)糖發(fā)酵代謝情況，在70%相似性水平可以將雙歧桿菌菌株聚為3 類(lèi)，其中菌株f65-5和f65-1聚在一起，碳源代謝情況相似；在4 株B. bifidum中菌株f40-5的碳水化合物利用能力與菌株f107-11、f107-7、 f105-5存在明顯差異，這與圖1中菌株指紋差異相對(duì)應(yīng)，對(duì)于基因型相同的菌株，碳源代謝能力基本相同；B. longumsubsp.infantis中菌株f115-9和f65-26的碳源利用情況存在明顯差異，且菌株f115-9可以代謝9 種碳源，碳源利用率較高，尤其菌株f107-6和f77-11可以利用10 種碳源；B. pseudocatenulatum中菌株f115-8和f40-16碳源利用情況相同。16 株雙歧桿菌均可以代謝葡萄糖、乳糖、蔗糖和半乳糖。

圖 3 雙歧桿菌糖發(fā)酵代謝譜及聚類(lèi)圖Fig. 3 Sugar metabolism spectrum and clustering map of Bifidobacterium

2.3.4 抑菌雙歧桿菌菌株對(duì)酸及膽鹽的耐受性

如表3所示，所有菌株在pH 4.0、5.0、6.0的PBS中均能存活，而在pH 3.0的PBS中僅有菌株f65-26、f40-15和f115-8能夠存活，其具有較強(qiáng)的耐酸能力。實(shí)驗(yàn)中多數(shù)菌株能夠在0.3%的膽鹽中存活，當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，僅有菌株f65-26和f115-8存活率分別達(dá)到24.11%和27.06%，當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，幾乎所有菌株存活率低于0.000 1%，相對(duì)而言，菌株f40-15在pH 3.0的PBS中存活率較好，而在0.5%的膽鹽中幾乎不能存活。根據(jù)菌株耐酸耐膽鹽的整體結(jié)果來(lái)看，菌株f65-26和菌株f115-8為耐受性最優(yōu)菌株。

表 3 抑菌雙歧桿菌菌株的耐酸、耐膽鹽結(jié)果分析Table 3 Acid and bile tolerance of Bifidobacterium with bacteriostatic activity

2.4 抗生素耐藥性分析

圖 4 基于抑菌圈直徑對(duì)16 株具有抑菌特性雙歧桿菌的抗生素抗性的熱圖分析Fig. 4 Heat map analysis of antibiotic resistance of 16 strains of bacteriostatic Bifidobacteriums based on the diameter of inhibition zone

根據(jù)紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)抑菌雙歧桿菌菌株進(jìn)行10 種抗生素抗性分析，通過(guò)顏色梯度直觀反映16 株抑菌雙歧桿菌產(chǎn)生的抗生素抑菌圈的直徑大小，表明雙歧桿菌的抗生素耐藥情況。從圖4可知，16 株抑菌雙歧桿菌對(duì)大多數(shù)抗生素表現(xiàn)敏感，而深綠色區(qū)域主要集中在阿米卡星和萬(wàn)古霉素，由美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)CLSI判斷表明，除菌株f107-6和f65-26分別對(duì)萬(wàn)古霉素和阿米卡星表現(xiàn)敏感外，其余所有實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)這兩種抗生素表現(xiàn)耐藥；其中部分菌株對(duì)慶大霉素也表現(xiàn)耐藥；在青霉素類(lèi)抗生素中，所有雙歧菌株對(duì)青霉素和氨芐西林敏感，相對(duì)苯唑西林而言，除菌株f77-16對(duì)苯唑西林表現(xiàn)敏感外，所有菌株對(duì)其表現(xiàn)中敏或耐藥，可見(jiàn)同種抗生素耐藥情況也不相同。

3 討 論

雙歧桿菌作為新生兒腸道早期定植的細(xì)菌群之一，被認(rèn)為在調(diào)節(jié)宿主黏膜生理和先天免疫方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[23]。嬰幼兒期腸道菌群中雙歧桿菌的建立與嬰幼兒未來(lái)健康成長(zhǎng)之間的關(guān)系早已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，為快速分析和鑒別嬰幼兒腸道中的雙歧桿菌，傳統(tǒng)的表型方法在菌株的鑒別能力和準(zhǔn)確性方面都受到限制，因此菌株區(qū)分需要基于相應(yīng)的DNA技術(shù)，rep-PCR指紋技術(shù)基于快速、易于操作和可重復(fù)性等性能，具備高的分辨能力，可用于區(qū)分在種、亞種及菌株水平上的多種 菌株[24-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合分子生物學(xué)及傳統(tǒng)菌株的分離鑒定方法，從26 份新疆維吾爾族嬰幼兒糞便中共分離得到75 株雙歧桿菌，其中B. longum subsp. infantis33 株，B. longumsubsp.suis8 株，B. bifidum19 株，B. pseudocatenulatum10 株，B. adolescentis5 株。為準(zhǔn)確反映雙歧桿菌菌株間的遺傳多樣性，本研究采用(GTG)5和BOXAIR兩種不同引物的rep-PCR指紋圖譜技術(shù)對(duì)篩選到的雙歧桿菌進(jìn)行遺傳差異性分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株種間具有明顯的差異，種內(nèi)帶型多樣，存在極高的遺傳多態(tài)性，與Jarocki等[26]的研究結(jié)果一致。有文獻(xiàn)報(bào)道B. longum subsp. suis僅在豬仔糞便中被發(fā)現(xiàn)[27]，而本研究從喀什地區(qū)嬰幼兒糞便中也分離得到了該菌株，后續(xù)將對(duì)該菌株進(jìn)行更深入的研究。

雙歧桿菌具有潛在益生和促進(jìn)健康的特性，如免疫調(diào)節(jié)、產(chǎn)生細(xì)菌素和抑制病原體等，有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與肥胖、糖尿病、炎癥性腸炎和胃腸道癌癥等疾病具有一定的相關(guān)性，存在于人體腸道中的條件致病菌數(shù)量占比雖較少，但在一定條件下能夠?qū)е氯梭w疾病的發(fā)生，根據(jù)Eshaghi等[28]報(bào)道，部分嬰幼兒腸道雙歧桿菌可以抑制志賀氏痢疾桿菌和致瀉大腸埃希氏菌，從而有效預(yù)防嬰幼兒腸道腹瀉；趙志霞等[29]從新疆喀什地區(qū)維吾爾族母乳中分離到雙歧桿菌對(duì)表皮葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、糞腸球菌等條件致病菌有明顯的抑菌效果。本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法對(duì)從新疆喀什地區(qū)維吾爾族嬰幼兒腸道中分離得到的雙歧桿菌菌株進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有16 株雙歧桿菌對(duì)6 種腸道致病菌具有明顯的抑菌活性，從系統(tǒng)發(fā)育來(lái)看，其中7 株屬于B. longumsubsp.infantis、4 株屬于B. bifidum、3 株屬于B. pseudocatenulatum、2 株屬于B. longumsubsp.suis。這些具有良好抑菌性能的雙歧桿菌在人體發(fā)揮益生特性必須要具備一定的耐受能力，根據(jù)Awasti等[30]從成人及嬰兒糞便中分離到雙歧桿菌的耐受性研究發(fā)現(xiàn)，1 株B. breve在低pH值和較高膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)液中的存活率分別可達(dá)87%和63%，本實(shí)驗(yàn)對(duì)抑菌性能較好的菌株進(jìn)行耐酸耐膽鹽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B. longumsubsp. infantisf65-26和B. pseudocatenulatumf115-8分別在pH 3.0和膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的培養(yǎng)液中存活率較高，具有較好的耐受性，后期對(duì)這些潛在益生性菌株進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是非常關(guān)鍵和必要的。

隨著雙歧桿菌活菌制劑及益生菌產(chǎn)品需求量的擴(kuò)大，有關(guān)雙歧桿菌耐藥安全性問(wèn)題的研究逐漸引起了廣大學(xué)者的重視。Matteuzzi等[31]對(duì)人體糞便中分離得到的459 株雙歧桿菌進(jìn)行15 種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)短型雙歧桿菌B. breve和豬雙歧桿菌B. suis對(duì)卡那霉素的耐藥性最強(qiáng)；石晶紅[32]對(duì)10 株雙歧桿菌進(jìn)行12 種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 株雙歧桿菌對(duì)鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星和甲硝唑表現(xiàn)很強(qiáng)的耐性，而對(duì)四環(huán)素、氯霉素和紅霉素均敏感。本研究采用紙片擴(kuò)散法對(duì)16 株具有抑菌活性的雙歧桿菌進(jìn)行10 種抗生素敏感性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)菌株除對(duì)阿米卡星及萬(wàn)古霉素表現(xiàn)耐藥外，對(duì)其他抗生素均表現(xiàn)敏感或中度敏感，這些嬰幼兒腸道中雙歧桿菌抗生素耐藥問(wèn)題可能是雙歧桿菌本身具有耐藥基因存在于其染色體上，也可能是嬰幼兒及母親在飲食或生活環(huán)境中接觸了相關(guān)抗菌藥物。因此在今后實(shí)驗(yàn)中將探明其耐藥機(jī)理及耐藥基因的轉(zhuǎn)移問(wèn)題，為進(jìn)一步選育安全的益生雙歧桿菌菌株提供一定參考研究基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究從新疆喀什地區(qū)維吾爾族嬰幼兒腸道中分離篩選得到75 株可培養(yǎng)的雙歧桿菌菌株，并通過(guò)rep-PCR指紋分型技術(shù)對(duì)菌株遺傳結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析。此外，對(duì)代表性雙歧桿菌菌株進(jìn)行抑菌、耐酸耐膽鹽及抗生素耐藥性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有16 株雙歧桿菌菌株具有良好的抑菌性能并對(duì)多數(shù)抗生素表現(xiàn)敏感，尤其是B. longumsubsp.infantisf65-26和B. pseudocatenulatumf115-8為耐受性最優(yōu)菌株，具有潛在的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。