林濤 蔡錦玲 鄭凱玲

摘要 創(chuàng)建可以同時檢測番茄抗黃化曲葉病毒病Ty-2基因和抗晚疫病Ph-3基因分子標記的多重PCR體系，以快速準確地鑒定篩選到目標基因型。采用多重PCR結合CAPS技術，同時加入2對引物T0302和TG328，進行擴增及酶切反應，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得不同基因型相應的帶型，從而建立多重PCR及產物酶切體系，優(yōu)化此體系后再進行驗證與應用。該多重PCR體系可靠高效，顯示共有9種帶型對應Ty-2和Ph-3基因相應的基因型，與采用單引物普通PCR技術分別鑒定的基因型結果一致，可以用于番茄分子標記輔助育種。

關鍵詞 番茄;多重PCR;CAPS;分子標記

中圖分類號 S641.2 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）03-0101-04

Abstract We established a multiplex PCR system to identify Ty2 and Ph3 resistance genes of tomato simultaneously，for rapid and accurate identification and screening of target genotype.Multiplex PCRCAPS technology was used to amplify and react with two pairs of primers T0302 and TG328.2%agarosegel electrophoresis was used to detect the corresponding bands to differentiate the genotype of the identified materials，and to establish multiplex PCR system.The results showed that there were 9 kinds of bands corresponding to the genotypes，which were consistent with the genotype identified by single primer PCR.The multiplexPCR systems are reliable and efficient，it could be very useful for markerassisted selection during early stage in tomato and speed up breeding procedure.

Key words Tomato;Multiple PCR;CAPS;Molecular marker

近年來，番茄黃化曲葉病毒病在我國廣西到山東沿海省份，以及云南、山西、新疆、河南、安徽、河北等番茄主產區(qū)均有暴發(fā)[1]。番茄晚疫病是致病疫霉菌侵染所致，一旦暴發(fā)常導致減產，甚至絕產，是一種番茄的毀滅性病害[2]。番茄黃化曲葉病毒病和晚疫病已成為高溫多濕番茄產區(qū)抗病育種的主攻方向之一。抗病性的鑒定受到發(fā)病條件、植株生理狀況、評價標準等影響，提高選擇效率是創(chuàng)制和篩選鑒定番茄育種新材料的關鍵。借助分子標記技術可以對育種材料進行早期、高效的選擇，加速品種選育與改良的進程[3]。

目前已經在番茄中發(fā)現(xiàn)的抗TYLCV 的基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4 和Ty-5，其中抗性基因Ty-1和Ty-3為等位基因[4]。Ty-2 基因是源于多毛番茄的單個顯性基因，Garcia等[5]開發(fā)了與Ty-2緊密連鎖的共顯性SCAR 標記T0302。番茄晚疫病抗性受兩類不同的基因控制，一類是單基因控制的質量性狀，包括完全顯性基因Ph-1，不安全顯性基因Ph-2和Ph-3，它們均來自醋栗番茄;另一類是多基因控制的數(shù)量性狀，其抗病性與環(huán)境、植株長勢等多種因素有關[6]。Ph-3基因是番茄抗晚疫病育種中分子標記輔助選擇常用的一個基因[7-10]?？追不踇11]的研究表明，標記TG328特異性引物可以很好地區(qū)分含番茄晚疫病抗性基因Ph-3的純合抗性材料、雜合抗病材料和不含Ph-3的感病材料，可以應用于番茄抗晚疫病種質資源的輔助選擇。然而在大中果型番茄種質中，抗黃化曲葉病毒病的材料基本上為含Ty-1基因，而含純合Ty-2或Ph-3抗性基因的材料很少。陳寶玲等[12]研究選用的56份大、中果型番茄材料，含雜合抗性基因Ty-2 的材料僅1 份;含純合晚疫病抗性基因Ph-3的材料只有1 份，雜合6 份。多重PCR是在一個反應體系中同時擴增多個目的片段，與普通PCR 相比有高效和低成本的優(yōu)勢[13]。國內利用多重PCR 技術對番茄抗性基因進行鑒定已有一定的研究，但能同時鑒定Ty-2和Ph-3基因的多重PCR體系尚未見報道[14-16]。

該研究利用共顯性分子標記Ty-2基因的SCAR的引物T0302和Ph-3基因的CAPS標記的引物TG328，結合多重PCR和CAPS技術的優(yōu)點，從已知基因型的番茄材料中，獲得不同基因型相應的帶型，建立和優(yōu)化可以同時檢測這2個抗病基因分子標記的多重PCR體系，采用此技術通過酶切產物的帶型來區(qū)別篩選目標材料的基因型。該研究增加了番茄黃化曲葉病毒病和晚疫病快速分子標記的鑒定手段，可促進抗性基因Ty-2和Ph-3的轉育聚合，尤其在創(chuàng)制大果型番茄育種新材料及復合多抗品種分子標記輔助選育中具有一定的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

多重PCR技術建立與優(yōu)化試驗所用番茄材料（編號1～9，A為CK1和B為CK2）來自泉州市農業(yè)科學研究所，已經田間病害鑒定過，單引物普通PCR已分別鑒定了Ty-2和Ph-3抗性基因的基因型。由表1可知，材料1～3號感番茄TY2（ty-2/ty-2基因型）;4～6號材料為純合Ty-2基因型，表現(xiàn)為抗番茄TY2;7～9號為雜合Ty-2基因型;其中2、5和8號含雜合Ph-3抗性基因，3、6和9號含純合Ph-3基因型，而1、4、7號不含抗性基因Ph-3。CK1基因型為Ty-2/Ty-2和Ph-3/Ph-3，作雙抗對照，CK2 則為雙感對照。

1.2 DNA的提取與引物設計

采用改良的CTAB 法[17]，提取試驗DNA后貯存在-20 ℃的冰箱中備用。參照Garcia 等[5]開發(fā)的共顯性SCAR 標記T0302設計Ty-2基因標記的引物序列，Ph-3基因的共顯性CAPS標記TG328參照文獻[7]的設計，所用標記的引物序列見表2，引物由北京天一輝遠生物科技公司合成。

1.3 多重PCR 體系的建立與優(yōu)化

采用多重PCR結合CAPS技術，同時加入2對引物進行擴增后，再進行擴增產物CAPS的酶切反應，獲得表1中番茄材料已知抗性基因Ty-2和Ph-3基因型組合所對應的帶型，然后進一步優(yōu)化該多重PCR及產物酶切體系。

PCR 反應體系20 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye） 10 μL，2對引物的正反引物（10 μmol/μL）各0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 補足至20 μL。

1.4 多重PCR體系的驗證與應用

采用經優(yōu)化過的多重PCR 體系對泉州市農業(yè)科學研究所的24 份番茄材料（編號801～824）進行基因型鑒定應用，即通過多重PCR酶切產物帶型區(qū)別判斷其相應的基因型，再與使用單引物普通PCR擴增的特異性標記片段分別進行分析比對，以驗證該多重PCR技術。

Ty-2基因單引物擴增的PCR反應體系為20 μL：10×PCR Buffer 2.0 μL（含Mg2+），dNTP（各2.5 mmol/μL）0.4 μL，正反引物（10 μmol/μL）各0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，easyTaq 酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH2O 補足至20 μL。PCR 擴增程序為94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

Ph-3基因單引物擴增PCR反應體系同Ty-2基因，PCR 擴增程序退火溫度為58 ℃，72 ℃延伸30 s，其他條件相同;酶切體系25 μL：2.2 μL ddH2O， 10×Buffer 2.5 μL，MvaI （BstNI） 酶（10 U/μL） 0.3 μL，混合后加到20 μL PCR產物中，水浴溫度37 ℃條件下，酶切2 h。

普通PCR 產物于加有Gold View的1.2%瓊脂糖凝膠、110 V 電壓下電泳20～30 min 檢測，在伯樂凝膠成像分析系統(tǒng)上顯示結果。

以上PCR SuperMix（+dye）混合液、easyTaq酶、Buffer和dNTP訂購自北京全式金生物技術公司，快切酶FastDigest MvaI 和限制性內切酶MvaI （BstNI）酶訂購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

2 結果與分析

2.1 酶切前擴增的特異標記片段

分子標記SCAR引物T0302和CAPS引物TG328，分別與Ty-2基因和Ph-3基因緊密連鎖，在PCR 體系中同時加入這2對引物擴增后，酶切前產物條帶清晰，目的條帶符合預期，所有材料均可擴增出500 bp的條帶（Ph-3基因酶切前抗感雜3種基因型的條帶都是500 bp），另外基因型為ty-2/ty-2 的B：CK2和材料1～3號擴增出一條800 bp 的特異性片段，基因型為Ty-2/Ty-2的A：CK1和材料4～6號擴增出900 bp 的SCAR標記的特異性片段，而基因型Ty-2/ty-2 的材料7～9號還擴增出900、800 bp這2條特異性片段，可見同時加入這2對引物酶切前對擴增產物條帶沒有影響、互不干擾 （圖1）。

48卷3期 林 濤等 番茄抗性基因Ty-2和Ph-3多重PCR的檢測應用

2.2 擴增產物酶切后的特異標記片段

為提高效率，同時加入2對引物擴增，20 μL產物加入快切酶，進行25 μL體系的酶切反應，凝膠電泳檢測顯示結果，以構建Ty-2和Ph-3這2個基因標記的多重PCR 體系。結合表1和圖2：2對引物的PCR 條帶清晰，材料1與B（CK2）基因型相同，雙感對應顯示2條特異性條帶800、500 bp;基因型為ty-2/ty-2、Ph-3/ph-3的材料2，有800、500 和260 bp 大小的3 條特異性條帶;材料3的基因型為ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3，只有2條特異性條帶800、260 bp。純合抗病基因型為Ty-2/Ty-2的A：CK1和材料4～6號的900 bp特異性片段酶切成約550、350 bp的2條帶，4號材料（Ty-2/Ty-2、ph-3/ph-3）顯示有3條帶，5號材料含雜合Ph-3基因酶切成500、260 bp，共有4條帶，6號和A（CK1）的基因型為雙抗（Ty-2/Ty-2、Ph-3/Ph-3），有550、350 和260 bp 大小的3 條特異性條帶。材料7～9號，含雜合Ty-2基因對應有900、800、550和350 bp大小的4條帶，加上Ph-3基因對應顯示的條帶，雙雜材料8號最多有6條帶。

經多次重復試驗結果表明，快切酶將純合Ty-2基因型的特異性片段900 bp切成約550、350 bp的2條帶，而雜合Ty-2基因型則表現(xiàn)為900、800、550和350 bp共4條帶，感番茄Ty2的800 bp 大小的特異性條帶無酶切位點;Ph-3 基因擴增產物酶切結果不受干擾。該多重PCR同時檢測2個基因Ty-2和Ph-3時，可以通過分子標記電泳檢測顯示找到各自的帶型，這9份材料跑出對應基因型的9種帶型，最多顯示有6條帶的是雙雜材料8號的帶型。

2.3 同時檢測Ty-2和 Ph-3 基因多重PCR體系的優(yōu)化

研究過程中對Taq酶含量、2對引物濃度、退火溫度、PCR擴增循環(huán)數(shù)，以及快切酶用量和酶切時間等因素進行多重PCR技術的優(yōu)化。最終確定使用前述試驗方法中的2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）混合液擴增時，不再增加Taq 酶用量，CAPS標記TG328引物正反引物濃度降為各0.2 μL （10 mmol/L），調整多重PCR退火溫度為56 ℃、快切酶酶切反應為10 min，其他條件不變的情況下，可獲得清晰可辨的條帶。

2.4 多重PCR體系的驗證與應用

用該多重PCR 技術，對24 份番茄材料進行2個基因Ty-2和Ph-3的基因型鑒定（圖3，編號1～24表示材料801～824）。材料1、5、8和14帶型相同，有550、350 和260 bp 大小的3 條帶，其基因型為雙抗。材料2、4、13和20均有800、260 bp大小的2條帶，表明它們的基因型為ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料3顯示的4條帶，可知其基因型為Ty-2/Ty-2、Ph-3/ph-3;材料6、7、9～12這6份材料僅有800、500 bp大小的2條帶，說明它們的基因型為雙感;編號15～19和21～23共8份材料，顯示了相同的5條帶，表明其基因型為Ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料24的帶型表明它的基因型是ty-2/ty-2、Ph-3/ph-3。

結合表2，單引物普通PCR鑒定可得材料1、3、5、8和14這5份材料含純合Ty-2 基因;7、15～19和21～23這9份材料有2條帶，說明其含雜合Ty-2基因;800 bp的單條帶表明剩余的10份材料基因型是ty-2/ty-2（圖4）。番茄晚疫病Ph3基因CAPS標記結果如圖5，含有Ph3純合抗病基因型的材料含有酶切位點，PCR產物酶切后會產生260 bp的特異條帶，雜合基因型材料酶切后有500 bp和260 bp的2條特異條帶，而純合感病基因型材料酶切后只有1條長度為500 bp的條帶。材料6、7和9～12這6份材料顯示只有500 bp的單條帶，含純合感病基因;2份材料有2條帶，說明材料3和24含雜合Ph-3基因;其他16份材料均含有純合抗病基因。

上述多重PCR技術檢測的材料基因型與單引物普通PCR分別檢測所獲的基因型進行綜合比對，兩者最終結果一致，說明選用SCAR標記T0302引物和CAPS標記TG328引物，同時檢測Ty-2、Ph-3基因的多重PCR 體系可行性得到進一步驗證。結合圖2和圖3，實際運用讀圖時，帶型顯示為6條帶的雙雜材料和顯示800 bp和500 bp這2條帶的雙感材料首先淘汰，材料雙抗基因型組合的帶型（顯示為3 條帶550、350和260 bp ）優(yōu)先入選，再根據這2個基因的優(yōu)先順序進行讀圖及材料選留，如以檢測Ty-2基因優(yōu)先時先找無800 bp條帶的帶型，以檢測Ph-3基因優(yōu)先時先找無500 bp條帶的帶型，這樣很容易通過讀圖判斷篩選到目標基因型的材料。

3 結論與討論

為快速準確地鑒定篩選到番茄抗性目標基因，要求檢測技術必須具有可靠性和操作的便利性。該研究在多重PCR 體系優(yōu)化研究過程中，對Taq酶含量、2對引物的正反引物濃度、退火溫度、PCR擴增循環(huán)數(shù)，及酶切反應中酶用量和反應時間等條件進行摸索。最終確定多重PCR反應體系為20 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye） 10 μL，SCAR標記正反引物各0.4 μL （10 mmol/L），CAPS標記正反引物各0.2 μL （10 mmol/L），DNA 模板1 μL （100 ng），ddH2O 補足至20 μL。PCR 擴增程序中退火溫度為56 ℃，時間1 min，酶切時間調整為10 min，其他條件不變。

同時使用2個共顯性分子標記的2對引物擴增時，酶切前對擴增產物沒有影響，產物經酶切后，可清晰分辨出最多有6條帶，而且每個帶型條帶間距適當、容易區(qū)分不同的帶型。通過帶型可知該多重PCR體系酶切反應，對Ph-3基因的擴增產物酶切結果不變，與該基因單引物普通PCR技術鑒定所得的條帶大小相同;而Ty-2純合抗病基因型900 bp的條帶酶切成550和350 bp的2條帶、雜合基因型酶切后有900、800、550和350 bp的4條帶，但對基因型Ty-2/ty-2和ty-2/ty-2的800 bp的條帶沒有影響，因此仍可通過帶型判斷它們的基因型。

此多重PCR檢測顯示結果表明，共有9種帶型對應相應的基因型，與單引物普通PCR分別鑒定的基因型綜合分析后的結果一致。分子標記技術發(fā)展很快，李宗俊等[18]采用委托專業(yè)機構檢測的方式，使用第三代分子標記技術，利用KASP標記基于已知SNP 檢測來輔助番茄育種。然而短期內多數(shù)育種者在學習利用新技術的同時，充分應用已有設備和相應技術還是必經階段。該多重PCR體系的基礎是第二代分子標記技術，在實踐中，即使帶型中部分條帶顯色較弱，只要掌握一定的認讀技巧，也可以通過帶型的條帶組成判斷基因型，它能同時檢測番茄抗黃化曲葉病毒病基因Ty-2和抗晚疫病基因Ph-3，且能區(qū)分其9種基因型組合，分子標記操作簡便實用和省時高效。

參考文獻

[1]薛東齊，李景富，許向陽，等.番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析及多重PCR快速檢測[J].中國蔬菜，2012（24）：27-35.

[2] 徐鶴林，李景富.中國番茄[M].北京：中國農業(yè)出版社，2007：205-207.

[3] 李景富.中國番茄育種學[M].北京：中國農業(yè)出版社，2011：213-220.

[4] VERLAAN M G，HUTTON S F，IBRAHEM R M，et al.The tomato yellow leaf curl virus resistance genes Ty1 and Ty3 are allelic and code for DFDGDclass RNAdependent RNA polymerases[J].PLoS Genet，2013，9（3）：1-11.

[5] GARCIA B E，GRAHAM E，JENSEN K S，et al.Codominant SCAR marker for detection of the begomovirus resistance Ty2 locus derived from Solanum habrochaites in tomato germplasm[J].Tomato Genet，2007，57：21-24.

[6] BRADSHAW J E，HACKER C A，LOWE R，et a1.Detection of a quantitative trait locus for both foliage and tuber resistance to late blight[Phytophthora infestans（Mont.）de Bary] on chromosome 4 of a dihaploid potato clone（Solanum tuberosum subsp.tuberosum）[J].Theoretical and applied genetics，2006，113：943-951.

[7] ROBBINS M D，MASUD M A T，PANTHEE D，et al. Markerassisted selection for coupling phase resistance to Tomato spotted wilt virus and Phytophthora infestans （Late Blight） in tomato[J].HortScience，2010，45（10）：1424-1428.

[8] 張春芝.番茄抗晚疫病QTL及Ph-3基因的分析[D].北京：中國農業(yè)科學院，201l.

[9] ZHANG C Z，LIU L，WANG X X，et al.The Ph3 gene from Solanum pimpinellifolium encodes CCNBSLRR protein conferring resistance to Phytophthora infestans[J].Theoretical and applied genetics，2014，127（6）：1353-1364.

[10] 胡明瑜，白文欽，潘曉雪，等.番茄抗晚疫病基因Ph-3 的分子標記開發(fā)及應用[J].植物病理學報，2018，48（4）：560-566.

[11] 孔凡慧.利用分子標記輔助選擇技術創(chuàng)制番茄抗多種病害與耐貯運育種材料的研究[D].哈爾濱：東北農業(yè)大學，2015.

[12] 陳寶玲，甘桂云，王先裕，等.126 份番茄材料的抗性基因分子標記檢測[J].中國蔬菜，2016（6）：34-41.

[13] 陳明潔，方倜，柯濤，等.多重PCR一種高效快速的分子生物學技術[J].武漢理工大學學報，2005，27（10）：33-36.

[14] 劉超勤，李景富，許向陽，等.四重PCR技術鑒定番茄 Ty-1、Ty -2、Mi和Cf-5基因研究[J].北方園藝，2013（9）：119-123.

[15] 胡霞，王蓉，李菲菲，等.番茄抗TYLCV基因新標記的開發(fā)及其在多抗聚合選擇中的應用[J].中國蔬菜，2014（10）：18-23.

[16] 孔凡慧，李帥，趙婷婷，等.番茄Ty-2、Ty-3和I-2 基因多重PCR鑒定技術[J].分子植物育種，2015，13（1）：184-189 .

[17] 陳昆松，李方，徐昌杰，等.改良CTAB 法用于多年生植物組織基因組DNA 的大量提取[J].遺傳，2004，26（4）：529-531.

[18] 李宗俊，王先裕，劉夢姣，等.利用KASP 分子標記技術輔助篩選多抗番茄材料[J].中國蔬菜，2019（8）：42-46.