張玉 汪宏濤 劉嘉荔

摘要 DNA甲基化是發(fā)生在基因5′端5′-CpG-3′胞嘧啶上的DNA共價(jià)修飾作用，可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老有著密切關(guān)系。DNMT2是首先從擬南芥中發(fā)現(xiàn)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。該研究通過(guò)NCBI序列比對(duì)獲得番茄中DNMT2的同源基因SlDNMT2的編碼區(qū)序列;通過(guò)Primer5設(shè)計(jì)引物，PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得SlDNMT2基因高度特異性序列（長(zhǎng)度約500 bp）;利用一系列分子生物學(xué)試驗(yàn)研究方法最終成功構(gòu)建SlDNMT2 RNAi表達(dá)載體，并命名為pBI121-35S∷siRNA1-siRNA2。該RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建為進(jìn)一步探究SlDNMT2基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)并提供了一條高效、迅速的載體構(gòu)建途徑。

關(guān)鍵詞 番茄;DNA甲基化;SlDNMT2;RNAi;載體構(gòu)建

中圖分類(lèi)號(hào) Q5-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0097-04

Abstract DNA methylation is a covalent modification of DNA that occurs at the 5′CpG3′ cytosine at the 5′ end of the gene，it regulates gene transcription and is closely related to plant growth， development， maturation and aging.DNMT2 is a key enzyme in DNA methylation which was found in Arabidopsis. In this study， firstly， the sequence of the coding region of SlDNMT2 was obtained by NCBI sequence alignment. And then the highly specific sequences of SlDNMT2 gene were acquired by polymerase chain reaction， and the primers were designed by Primer 5. Finally， taking advantage of a series of molecular biological experiment study methods，the SlDNMT2 RNAi expression vector was constructed successfully， and named PBI12135S∷siRNA1siRNA2. The construction of the RNAi expression vector not only laid the theoretical foundation for further exploring the SlDNMT2 genes function in plant growth and development stage but also provided an efficient and rapidly way of vector construction.

Key words Tomato;DNA methylation;SlDNMT2;RNAi;Construction of vector

番茄（Solanum lycopersicum）屬茄科番茄屬植物，是一種草本植物[1]，其最早發(fā)源于南美洲，17世紀(jì)傳入亞洲。直至18世紀(jì)，番茄開(kāi)始被作為食用植物栽培，此外番茄還具有一定藥用價(jià)值[2]。至今，番茄被廣泛種植于世界各地，具有重要研究意義。DNMT（DNA methyltransferase，DNMTs）是植株DNA甲基化過(guò)程中重要的甲基轉(zhuǎn)移酶。真核生物中有3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，分別命名為DNMT1、DNMT2、DNMT3（DNMT3a和DNMT3b）[3]。DNMT1是一種維持DNA甲基化穩(wěn)定性的酶;DNMT2是植物中特有的一種甲基轉(zhuǎn)移酶，其通過(guò)與DNA結(jié)構(gòu)特異位點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮特定作用，但具體機(jī)制研究尚少;DNMT3a和DNMT3b在DNA甲基化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可使去甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)重新發(fā)生甲基化過(guò)程[4]。DNA甲基化是一種常見(jiàn)的DNA共價(jià)修飾作用，生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為輔酶，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上[5]。這種共價(jià)修飾通常發(fā)生在基因5′端5′—CpG—3′胞嘧啶上。DNA甲基化修飾可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老有著密切關(guān)系[6]。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由于雙鏈RNA導(dǎo)致的基因沉默現(xiàn)象。RNA沉默是一種通過(guò)形成雙鏈RNA，特異性剔除或關(guān)閉目的基因表達(dá)的技術(shù)[7-9]。RNA干擾技術(shù)在進(jìn)化上具有保守性，該技術(shù)將與目的基因mRNA序列同源互補(bǔ)的雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，植物細(xì)胞與dsRNA迅速發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，在核酸內(nèi)切酶作用下，將dsRNA切割成許多特定的小干擾RNA序列（small interfering RNA，siRNA）[10]。在RNA解旋酶的作用下，siRNA發(fā)生解鏈作用，反義siRNA與核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、RNA解旋酶結(jié)合，進(jìn)一步形成RNA沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）[11]。RISC可與外源性mRNA同源序列發(fā)生特異性結(jié)合作用，對(duì)mRNA進(jìn)行切割，而后降解斷裂的mRNA。此外，在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下，siRNA還可以結(jié)合植物體內(nèi)靶RNA，形成更多新的dsRNA，新dsRNA由核酸內(nèi)切酶切割，進(jìn)一步產(chǎn)生許多次級(jí)siRNA[12-14]，從而使RNA干擾的作用逐級(jí)放大，以期達(dá)到完全降解靶mRNA的效果，最終產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。

該研究通過(guò)NCBI網(wǎng)站Blast獲得番茄植株DNMT2基因編碼序列（coding sequence，CDS），通過(guò)序列保守性分析獲得目的基因的高度特異性序列，PCR擴(kuò)增該高度特異性序列。利用限制性?xún)?nèi)切酶切割pSK載體和特異性序列片段，經(jīng)轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性鑒定以及關(guān)鍵性發(fā)夾結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，最終獲得番茄植株DNMT2基因RNAi表達(dá)載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。

番茄植株是由實(shí)驗(yàn)室繁殖保存的來(lái)自美國(guó)康奈大學(xué)植物研究所的野生型番茄（Solanum lycopersicum Mill.cv.Ailsa Craig）。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒。

大腸桿菌（Escheriachia coli）DH5α、根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHAl05、植物表達(dá)載體pBI121、PSK均保存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。

1.1.3 試劑。

限制性?xún)?nèi)切酶、Taq酶、高保真Pfu DNA polymerase、T4 DNA Ligase、Trizol（購(gòu)自Invitrogen公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自TOYOBO公司）。膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒（購(gòu)自O(shè)mega公司），引物由上海生工技術(shù)有限公司合成，測(cè)序由金唯智技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 植物總RNA提取。

利用試劑盒和Trizol試劑法提取番茄植物總RNA。操作過(guò)程：①取樣，每100 mg組織中加入1 mL TP1溶液。②渦旋振蕩，4 ℃離心，12 000 r/min，5 min。③取上清，加入等體積TPII溶液，顛倒混勻;加入1/4體積氯仿，顛倒混勻，室溫靜置5 min。④4 ℃離心，12 000 r/min，5 min，取上清，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min。⑤4 ℃離心，12 000 r/min，10 min，1 mL 75%乙醇清洗2次。⑥通風(fēng)櫥干燥處理后加入30～40 μL RNA溶解沉淀，后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA質(zhì)量，最后將樣品保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 mRNA反轉(zhuǎn)錄。

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得番茄植株cDNA。操作步驟：在20 μL體系中加入如下試劑：①mRNA X μL。②Accurt Reaction Mix（4X）2 μL。③Nudease-Free H2O（8-X） μL。④42 ℃靜置2 min。⑤依次加入：Accurt Reaction stopper（5X）2 μL，5XAu-In-Due-RT-Master Mix 4 μL，Nudease-Free H2O 6 μL。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min;42 ℃ 50 min;85 ℃ 5 min。⑥儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增。

利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，表1為該研究中所需主要引物。利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增得到SlDNMT2基因。SlDNMT2目的基因PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;引物溫度（℃） 30 s;72 ℃ T（依據(jù)片段長(zhǎng)度設(shè)定時(shí)間，min）;72 ℃ 10 min;12 ℃ 60 min。SlDNMT2基因特異性序列PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s;引物溫度（℃） 30 s;72 ℃ T（依據(jù)片段長(zhǎng)度設(shè)定時(shí)間，min）;72 ℃ 10 min;12 ℃ 60 min。

1.2.4 番茄植株SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建。

利用限制性?xún)?nèi)切酶處理pSK-siRNA1-siRNA2陽(yáng)性菌重組質(zhì)粒和pBI121質(zhì)粒，經(jīng)Omega公司膠回收試劑盒回收siRNA1-siRNA2高度特異性片段，T4 DNA連接酶4 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，陽(yáng)性菌鑒定，最終得到番茄植株SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體，并將該載體重新命名為pBI121-35S∷siRNA1-siRNA2。載體構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因siRNA序列克隆及檢測(cè)

2.1.1 SlDNMT2基因生物信息學(xué)分析。

通過(guò)NCBI網(wǎng)站Blast獲得番茄DNMT2基因的編碼區(qū)，其CDS全長(zhǎng)為1 146 bp，共編碼381個(gè)氨基酸。利用Trizol試劑法提取番茄植物總RNA，質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。將SlDNMT2基因氨基酸序列與擬南芥AtDNMT2進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示番茄SlDNMT2和擬南芥AtDNMT2的同源性達(dá)62.05%（圖3）。并選取SlDNMT2基因起始密碼子（ATG）至終止密碼子（TGA）的編碼區(qū)，利用SGN-VIGS網(wǎng)站，在Solanum_lycopersicum_ITAG _v2.40資料庫(kù)中篩選，最終獲得大小約500 bp的SlDNMT2基因高度特異性序列，并命名為小干擾RNA序列（siRNA）。

2.1.2 SlDNMT2基因特異性片段克隆。

以LeDNMT2-F和LeDNMT2-R為引物PCR擴(kuò)增獲得SlDNMT2目的基因片段。而后將SlDNMT2目的基因的PCR產(chǎn)物作為模板，以LeDNMTRi-F1、LeDNMTRi-R1、LeDNMTRi-F2、LeDNMTRi-R2為引物，利用PCR技術(shù)獲得SlDNMT2的高度特異性序列（siRNA），PCR結(jié)果如圖4所示。

2.2 陽(yáng)性菌鑒定

2.2.1 siRNA1特異性序列陽(yáng)性鑒定。

限制性?xún)?nèi)切酶Xho I、Hind Ⅲ酶切pSK載體和特異性序列1（siRNA1），T4 DNA Ligase 4 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，菌落PCR陽(yáng)性鑒定。鑒定結(jié)果如圖5所示，并獲得1號(hào)陽(yáng)性菌質(zhì)粒用Xho I、Hind Ⅲ酶切獲得siRNA1片段，在瓊脂糖凝膠電泳下檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。泳道1內(nèi)可以觀察到一條大小約500 bp的特異性條帶，送金唯智技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì)，測(cè)序結(jié)果正確。

2.2.2 siRNA2特異性序列陽(yáng)性鑒定。

限制性?xún)?nèi)切酶Sac I、EcoR I酶切上述1號(hào)陽(yáng)性菌質(zhì)粒和特異性序列2（siRNA2），T4 DNA Ligase 4 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，經(jīng)堿裂解法質(zhì)?？焯彡?yáng)性鑒定，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖7所示，獲得16號(hào)陽(yáng)性菌質(zhì)粒。分別用Sac I、EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶酶切以及Xho I、EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶酶切獲得siRNA2片段（泳道1）及siRNA1-siRNA2片段（泳道2），瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，送金唯智技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì)，測(cè)序結(jié)果正確。

2.3 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證

限制性?xún)?nèi)切酶Xho I、EcoR I酶切上述16號(hào)陽(yáng)性菌質(zhì)粒，膠回收試劑盒回收siRNA1、siRNA2特異性片段，利用純化試劑盒純化后，進(jìn)行發(fā)夾結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。經(jīng)95 ℃熱處理5 min后，分別自然退火（22 ℃）和冰上退火（4 ℃）30 min，在0.8%瓊脂糖凝膠電泳下檢測(cè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的正確性，檢測(cè)結(jié)果如圖9所示。不同處理?xiàng)l件下，2個(gè)泳道內(nèi)均能檢測(cè)到特異性條帶，且條帶大小正確。

2.4 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體正確性檢測(cè)

限制性?xún)?nèi)切酶Xho I、EcoR I酶切pBI121-siRNA1-siRNA2陽(yáng)性菌質(zhì)粒，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳條帶的顯色位置，以確定SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體構(gòu)建的正確性，酶切后電泳結(jié)果如圖10所示，4個(gè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后均能獲得大小約1 200 bp的特異性條帶。

3 結(jié)論與討論

3.1 RNA干擾技術(shù)中特異性序列的選擇

在構(gòu)建SlDNMT2RNAi表達(dá)載體的過(guò)程中關(guān)鍵是特異性序列的選擇，該研究通過(guò)NCBI網(wǎng)站序列比對(duì)作用，選擇番茄植株編碼區(qū)內(nèi)高度特異性序列（約500 bp）設(shè)計(jì)引物，進(jìn)而添加酶切位點(diǎn)，最終通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了SlDNMT2基因高度特異性序列。

3.2 RNAi表達(dá)載體構(gòu)建中陽(yáng)性鑒定

利用RNA沉默技術(shù)構(gòu)建RNAi表達(dá)載體。在此過(guò)程中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的鑒定是構(gòu)建 pBI12135S∷siRNA1-siRNA2表達(dá)載體是否成功的關(guān)鍵。

根據(jù)重組質(zhì)粒pBI12135S∷siRNA1-siRNA2與空載pBI121載體質(zhì)粒分子量大小不同，其在1%瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同，通過(guò)質(zhì)粒快提試驗(yàn)鑒定陽(yáng)性菌;利用限制性?xún)?nèi)切酶酶切，膠回收，不同退火溫度處理后，在瓊脂糖凝膠電泳下檢測(cè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，根據(jù)DNA條帶的位置驗(yàn)證發(fā)夾結(jié)構(gòu)正確性，最終，成功構(gòu)建植物SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體。

3.3 RNA干擾技術(shù)的意義與前景

RNA沉默技術(shù)是分析基因功能的有效途徑之一。通過(guò)RNA干擾能特異性阻斷目的基因的表達(dá)，獲得缺失特定功能的RNAi突變體，進(jìn)而對(duì)目的基因的功能進(jìn)行分析[15]。RNAi技術(shù)為分析目的基因的功能提供了一種快速、高效的途徑。

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