剌曉琴,金曉弟,張立超,李卓玉,,*

(1.山西大學 生物技術(shù)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學 生命科學學院,山西 太原 030006; 3.山西大學 生物醫(yī)學研究院,山西 太原 030006)

0 引言

黃連素,又稱為小檗堿,是一種異喹啉類的植物性生物堿，作為黃連的主要活性成分,長期以來被用作非處方口服藥物治療腸道感染和腹瀉[1]，又因其抗菌、抗高血脂、抗糖尿病、抗炎和抗氧化等多種功效的顯現(xiàn)而被開發(fā)為臨床藥物[2-3]。隨著研究的深入,小檗堿的抗腫瘤作用也逐漸得到認可,尤其是作為臨床腫瘤治療的輔助藥物。Pandey等發(fā)現(xiàn)黃連素通過靶向胃癌細胞中的Survivin和STAT3增強了5-Fu的化療敏感性[4];Yu等發(fā)現(xiàn)黃連素通過抑制NF-κB的表達增強了腸癌細胞對伊立替康的敏感性[5];Palmieri等也證實了黃連素在增強喉癌細胞HEP2對5-Fu和順鉑敏感性方面具有一定作用[6]。腫瘤在化療過程中對藥物敏感性的減弱及其在治療過程中所產(chǎn)生的副作用是癌癥治療中急需解決的問題,而黃連素增強化療敏感性的分子機制一直沒有得到深入的研究,因此探討黃連素增強化療敏感性的機制將有助于其在腫瘤臨床的應(yīng)用。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的應(yīng)激蛋白,在腫瘤缺氧、缺糖以及酸性微環(huán)境的刺激下,結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食道癌、腦癌、前列腺癌和黑素瘤等多種類型的腫瘤中會發(fā)生GRP78的高表達[7-9]。不僅胞內(nèi)高水平的GRP78會促進腫瘤細胞抵抗凋亡,逃逸免疫,形成耐藥性[10-11],同時過表達的GRP78在逃過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收系統(tǒng)的監(jiān)視而被分泌到胞外后也能促進腫瘤生長進程[12]。研究表明,腫瘤分泌型GRP78能夠激活內(nèi)皮細胞中的ERK和Akt信號,幫助血管內(nèi)皮細胞抵御硼替佐米的凋亡誘導作用[13];還能夠通過骨髓間充質(zhì)干細胞表面的TGF-β1受體,激活細胞內(nèi)TGF-β/Smad信號,促使骨髓間充質(zhì)干細胞向腫瘤相關(guān)成纖維細胞分化[14];也能夠誘導巨噬細胞向具有M2型特征的腫瘤相關(guān)巨噬細胞方向極化[15]。由此可見,腫瘤分泌型GRP78對腫瘤微環(huán)境具有強大的改造功能。因此,如果能夠干預腫瘤細胞中GRP78的分泌,阻斷其對微環(huán)境的影響,將有助于增強化療藥物的抗腫瘤作用。

本文旨在闡明黃連素抑制GRP78分泌的分子機制,為以GRP78為靶向的腫瘤治療提供一定的理論基礎(chǔ),也為基于腫瘤微環(huán)境的藥物開發(fā)提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體

藥品:黃連素(純度質(zhì)量分數(shù)為98%)購于中國百靈威科技有限公司;5-氟脲嘧啶(5-Fu,純度質(zhì)量分數(shù)≥99%)和MTT購于美國Sigma公司;結(jié)晶紫和三磷酸腺苷溶液購于中國索萊寶公司。

培養(yǎng)基和血清:RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國GIBCO公司。

試劑盒:外泌體提取試劑盒購于美國Thermo Fisher公司;ATP酶活性測定試劑盒購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

抗體:Caspase-7(WB: 1∶1 000)抗體購于美國CST公司;GRP78(WB: 1∶1 000)抗體購于中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;GAPDH(WB: 1∶5 000)、CD63(WB: 1∶1 000)抗體購于英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細胞系DLD1、HCT-116培養(yǎng)于37℃,體積分數(shù)為5% CO2,濕度飽和的恒溫培養(yǎng)箱中。所用培養(yǎng)基中均含有體積分數(shù)為10%胎牛血清和體積分數(shù)為1%青鏈霉素。

1.3 rGRP78蛋白的誘導表達和純化

為了模擬分泌型GRP78,我們構(gòu)建了原核表達的重組GRP78(rGRP78),具體的蛋白體外表達與純化步驟詳見參考文獻[16]。

1.4 納米粒子示蹤技術(shù)(NTA)

使用德國ZetaView PMX 110納米顆粒跟蹤分析儀可實時直接通過光學顯微鏡收集觀測納米顆粒的散射光信號,然后對其在溶液中的布朗運動進行拍攝,最后對每個布朗運動的粒子進行追蹤及分析,快速準確地計算出外泌體的流體力學半徑及濃度。具體操作步驟為:收集無血清條件培養(yǎng)基,并在4℃下4 000 r/min離心30 min,然后將上清液在PBS中稀釋至250倍。設(shè)置儀器參數(shù)并將測試樣品加入比色杯中測量。每種樣品溶液的體積達到1.5～2 mL。樣品的測量時間為1 min。

1.5 分子對接

從中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫(http:∥tcm.cmu.edu.tw)中檢索黃連素的化合物結(jié)構(gòu),應(yīng)用Chemdraw軟件畫出黃連素分子結(jié)構(gòu),并用Cherm3D進行能量優(yōu)化,最終利用AutoDockTools軟件將文件轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。從PDB數(shù)據(jù)庫中調(diào)取GRP78不同結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),并去除其配體分子、水分子及無關(guān)緊要的金屬離子等。在Linux終端下運行Autodock 4.2 軟件,依次加載GRP78蛋白的不同結(jié)構(gòu)域和能量優(yōu)化后的黃連素,用Autogrid計算格點能量,對接運算采用拉馬克遺傳算法,各化合物與蛋白之間的結(jié)合情況用半經(jīng)驗的自由能評價方法評價。參數(shù)設(shè)置過程中,將參數(shù)“能量最大評價次數(shù)”確定為2 500 000,運行次數(shù)確定為100,其他參數(shù)采用軟件的默認設(shè)置,最終獲得對接結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結(jié)果中的數(shù)據(jù)均為3次獨立試驗所得結(jié)果的均值±標準差(Mean±SD),使用單因素方差分析(ANOVA)檢驗各組之間的差異,并使用Student’st比較兩組之間差異的顯著性,P<0.05,P<0.01被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 分泌型GRP78阻斷了黃連素對5-Fu的化療增敏作用

5-Fu是臨床上常用的癌癥化療藥物[17]。我們利用MTT、克隆形成實驗評估了黃連素在5-Fu抗腫瘤中的作用。結(jié)果表明雖然黃連素在低濃度下對HCT-116和DLD1細胞沒有明顯的作用,但是在與5-Fu聯(lián)合用藥后,以濃度依賴的方式顯著抑制了結(jié)腸癌細胞的存活(圖1A和1B)。進一步的克隆形成及western blot結(jié)果表明,黃連素和5-Fu聯(lián)合用藥明顯抑制了結(jié)腸癌細胞的克隆形成能力,促進了凋亡相關(guān)蛋白Caspase-7的激活(圖2A和2B)。這些數(shù)據(jù)表明黃連素可以增強5-Fu的抗腫瘤作用。但在培養(yǎng)基中添加rGRP78蛋白后,黃連素對5-Fu的增敏作用減弱(圖1A,1B,2A和2B),表明分泌型GRP78能夠阻斷黃連素的化療增敏作用。

2.2 黃連素抑制了HCT-116和DLD1細胞中GRP78外泌體的分泌

腸癌細胞經(jīng)不同濃度的黃連素處理24 h后,收集其培養(yǎng)基檢測了GRP78的分泌量。結(jié)果顯示,黃連素以濃度依賴的方式抑制了HCT-116和DLD1細胞中GRP78的分泌(圖3A和3B)。腸癌細胞中GRP78主要以外泌體的形式被分泌到胞外[12],因此為了檢測黃連素是否抑制了GRP78進入外泌體,我們將培養(yǎng)基中的外泌體分離,并通過Western blot檢測了外泌體中GRP78的變化情況。結(jié)果表明：黃連素處理后外泌體中GRP78的量明顯受到了抑制,但是作為外泌體中特異性標記物的CD63并沒有受到黃連素作用的影響,表明黃連素對GRP78的作用是特異的(圖3C和3D)。GRP78分泌量的減少可由外泌體數(shù)目的減少引起,也可能是由GRP78進入外泌體的數(shù)量減少而導致,進一步利用NTA即使檢測黃連素處理前后外泌體的粒徑和數(shù)目,結(jié)果顯示:黃連素的處理沒有影響外泌體的大小和濃度(圖3E)。這些結(jié)果表明黃連素很可能抑制了GRP78被分選入外泌體而阻斷其分泌。

(A、B) 利用MTT實驗檢測經(jīng)不同濃度的黃連素和5-Fu單獨處理、二者聯(lián)合處理或者40 nmol/L rGRP78同時處理24 h后，HCT-116和DLD1細胞的存活率，*P<0.05,**P<0.01。圖1 分泌型GRP78對黃連素與5-Fu協(xié)同效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用(A, B) MTT assays were used to detect the cell viability.HCT-116 and DLD1 cells were treated with different doses of berberine or 5-Fu alone,or in combination in the presence or abscence of rGRP78 (40 nmol/L) for 24 h, *P<0.05,**P<0.01Fig.1 Secreted GRP78 reversed the synergistic effect of berberine and 5-Fu

(A) 利用克隆形成實驗檢測經(jīng)黃連素、5-Fu單獨處理或者二者聯(lián)合處理以及40 nmol/L rGRP78同時處理7 d后，HCT-16和DLD1細胞的克隆形成能力。 (B) HCT-116和DLD1細胞如A所述處理24 h后，利用western blot檢測細胞中Caspase-7的變化。圖2 分泌型GRP78阻斷了黃連素對5-Fu的化療增敏作用(A) Colony forming experiments were performed for HCT-116 and DLD1 cells treated with5 μmol/L (10 μmol/L) berberine or 20 μmol/L (100 μmol/L) 5-Fu alone,or in combination in the presence or absence of 40 nmol/L rGRP78 for 7 days.(B) Western blot was used to detect the level of Caspase-7 in HCT-116 andDLD1 cells treated as described in A for 24 hFig.2 Secreted GRP78 blocked the chemotherapeutic sensitization of berberine on 5-Fu

2.3 黃連素分子和GRP78的ATP酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生了相互作用

基于上述結(jié)果推測:黃連素增強5-Fu的抗腫瘤效應(yīng)可能是通過與腫瘤細胞中GRP78發(fā)生了直接的相互作用,影響了其被分選進入外泌體。為了證明這一推測,利用分子對接技術(shù)進行虛擬對接分析,結(jié)果顯示黃連素能夠與GRP78相互結(jié)合(圖4A)。為了進一步確認這一現(xiàn)象,黃連素-Fe3O4磁珠與rGRP78和經(jīng)黃連素處理后的細胞裂解液孵育后進行pulldown實驗,隨后用GRP78抗體通過免疫印跡檢測。結(jié)果表明：黃連素不僅與體外純化的rGRP78結(jié)合,也能與內(nèi)源性的GRP78結(jié)合(圖4B和4C)。

已知GRP78的N端含有ATP酶結(jié)構(gòu)域,能夠?qū)TP水解成ADP,在C端有底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域,能夠特異性結(jié)合有七肽序列的多肽[18-19]。因此,針對GRP78的兩個特異性結(jié)構(gòu)域構(gòu)建GRP78的兩個截短體GFP-GRP78-N280和GFP-GRP78-C(400-654)(圖4D)后將其轉(zhuǎn)入細胞,利用黃連素-Fe3O4進行pulldown實驗來進一步檢測黃連素與GRP78結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明：含有ATP結(jié)合位點的GFP-GRP78-N280和完整的GRP78蛋白能夠與黃連素發(fā)生相互作用,而含有多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的GFP-GRP78-C(400-654)截短體不能與黃連素結(jié)合(圖4E)。

上述結(jié)果表明,黃連素與GRP78的結(jié)合位點位于GRP78的ATP酶結(jié)構(gòu)域,所以推測:黃連素可能與ATP競爭性地結(jié)合GRP78。再利用rGRP78與黃連素-Fe3O4去確定黃連素是否可以競爭性地抑制ATP結(jié)合到GRP78。結(jié)果表明隨著ATP濃度的增加,黃連素與GRP78的結(jié)合逐漸減少(圖4F)。由此可見，黃連素確實以競爭性結(jié)合的方式與GRP78存在相互作用,且該相互作用為非共價結(jié)合。這些結(jié)果進一步表明黃連素與GRP78的ATP酶催化結(jié)構(gòu)域存在相互作用。

(A、B) 利用western blot檢測經(jīng)黃連素處理后，HCT-116和DLD1細胞培養(yǎng)基中GRP78的變化。(C、D) 利用western blot檢測黃連素處理后，HCT-116和DLD1細胞外泌體中GRP78蛋白的變化。(E) NTA技術(shù)檢測5 μmol/L黃連素處理后HCT-116細胞外泌體中大小和數(shù)目的變化。圖3 黃連素抑制了GRP78以外泌體的形式分泌(A, B) Western blot of GRP78 levels in the culture supernatants of HCT-116 and DLD1 cells treated with berberine.(C, D) GRP78 protein levels were analyzed by western blot in exosomes of HCT-116 and DLD1 cells treated with berberine.(E) NTA was used to detect the size and number of exosomes in HCT-116 cells treated with 5 μmol/L berberine.Fig.3 Berberine inhibited the secretion of GRP78 via exosomes

2.4 黃連素抑制GRP78的ATP酶活性并通過構(gòu)象轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)GRP78的功能

由于ATP的結(jié)合和水解對于維持GRP78蛋白的活性是必需的[20],因此我們檢測了黃連素對rGRP78的ATP酶活性的影響。結(jié)果顯示隨著黃連素濃度的升高,GRP78的ATP酶活性隨之減弱(圖5A),表明黃連素與GRP78結(jié)合后可以抑制其ATP酶活性。研究表明,在哺乳動物細胞中,GRP78以可相互轉(zhuǎn)化的寡聚體和單體形式存在[21],單體形式是可以與未折疊蛋白質(zhì)結(jié)合的活性形式。以寡聚體形式存在的GRP78為失活狀態(tài),但與ATP結(jié)合后可轉(zhuǎn)化為有活性的單體形式[22]。我們的研究結(jié)果也顯示隨著ATP劑量的增加,可以有效地將HCT-116細胞內(nèi)二聚體GRP78轉(zhuǎn)化為單體(圖5B),而黃連素的加入則誘導了胞內(nèi)GRP78由活性的單體形式轉(zhuǎn)化為無活性的二聚體形式(圖5C和5D)。為了進一步驗證黃連素與ATP之間對于GRP78的競爭性作用,將ATP和黃連素與HCT-116細胞共同孵育,結(jié)果顯示：ATP可促進GRP78單體的形成,而黃連素的加入會消除ATP的作用,使得GRP78轉(zhuǎn)化為失活的二聚體形式(圖5E)。這些結(jié)果表明,黃連素可以通過與ATP競爭性的結(jié)合抑制GRP78的ATP酶活性,進而引起其構(gòu)象的改變。

3 討論

黃連素用于抗腫瘤主要是與各種抗癌藥物聯(lián)合使用起到增效減毒的作用。Pan等發(fā)現(xiàn)黃連素通過抑制AMPK-HIF-1α來逆轉(zhuǎn)乳腺癌對多柔比星的化療耐藥性[23];Zhang等發(fā)現(xiàn)黃連素通過增加ROS水平逆轉(zhuǎn)HER2陽性乳腺癌細胞對拉帕替尼的耐藥性[24];Wen等也發(fā)現(xiàn)黃連素能夠通過上調(diào)P21的表達來增強乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性[25]。從上述研究可以看出,黃連素在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方面具有重要作用,但對于相應(yīng)機制的研究還停留在相對粗淺的階段，首先,對黃連素的具體作用靶點以及作用機制沒有明確的結(jié)論;其次,對黃連素逆轉(zhuǎn)耐藥的機制探討,主要聚焦在腫瘤細胞本身,而忽視了實體腫瘤的重要組成部分-腫瘤微環(huán)境的作用。本研究發(fā)現(xiàn)GRP78能夠作為黃連素的作用靶點，它與GRP78的ATP酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生直接的相互作用,而這種作用通過特異性抑制GRP78的ATP酶活性而實現(xiàn)。GRP78蛋白質(zhì)以多種形式存在,單體形式反映了GRP78的最大活性,而各種二聚體或低聚物顯示了較低活性或無活性的GRP78[20]。我們的結(jié)果顯示黃連素可以使GRP78從活性的單體形式轉(zhuǎn)化到無活性的二聚體或寡聚形式。這些結(jié)果表明黃連素可能是參與了細胞中GRP78功能的調(diào)節(jié)，而GRP78功能的喪失便使其無法進入分選途徑而分泌到胞外發(fā)揮促腫瘤作用。

(A) 黃連素與GRP78相互作用的分子對接結(jié)果。(B、C) 利用競爭性結(jié)合實驗檢測berberine與GRP78的相互作用。將rGRP78和HCT-116細胞裂解液分別與berberine-Fe3O4耦合磁珠在4℃下孵育過夜，使用GRP78抗體通過免疫印跡確認二者的相互作用。(D) GRP78全長及其截短體的示意圖。(E) 黃連素與GRP78相互作用結(jié)構(gòu)域的確認。GFP-GRP78、GFP-GRP78-N280和GFP-GRP78-C(400-654)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT-116細胞48 h后，將細胞裂解液與berberine-Fe3O4耦合磁珠在4℃下孵育過夜，使用GFP抗體(上圖)和考馬斯藍染色(下圖)分析二者的相互作用。(F) rGRP78與berberine-Fe3O4耦合的磁珠在4℃孵育過夜，將ATP(0.5或1 μmol/L)加入到反應(yīng)體系中并在25℃下溫育30 min。使用GRP78抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析二者的相互作用。圖4 黃連素能夠與GRP78相互作用(A) Molecular docking results of the interaction between berberine and GRP78.(B, C) rGRP78 protein and the lysate of HCT-116 cells wereincubated with berberine-Fe3O4 beads overnight at 4℃, respectively.The interaction between GRP78 and berberine was confirmed by immunoblotting using GRP78 antibody.(D) Schematic representation of the full length of GRP78 and its truncation.(E) GFP-GRP78, GFP-GRP78-N280 and GFP-GRP78-C (400-654) plasmids were transfected into HCT-116 cells for 72 h,and the cell lysate was incubated with berberine-Fe3O4 beads overnight at 4℃.The interaction was analyzed using GFP antibody (top panel) and Coomassie blue staining (bottom panel).(F) rGRP78 and berberine-Fe3O4 beads were incubated overnight at 4℃. ATP (0.5 or 1 μmol/L) was added to thereaction solution and incubated for 30 min at 25℃. The interaction was analyzed by western blot using GRP78 antibody.Fig.4 Berberine interacted with GRP78

(A) 不同濃度的黃連素與rGRP78共孵育后，檢測黃連素對rGRP78的ATP酶活性的影響， *P<0.05，**P<0.01。(B) ATP對GRP78構(gòu)象的影響。將不同劑量的ATP (1,10或30 μmol/L)與HCT-116細胞于25℃下在25 μL反應(yīng)混合物中(20 mmol/L HEPES (pH 7.0))孵育30 min后，使用非變性凝膠電泳進行GRP78的構(gòu)象變化分析。(C、D) 黃連素對HCT-116和DLD1細胞中GRP78構(gòu)象的影響。(E) 將ATP(10 μmol/L)和不同劑量的黃連素(1，5或10 μmol/L)一起溫育。蛋白質(zhì)在非變性凝膠上分離，隨后通過免疫印跡進行檢測。M，單體；D，二聚體。圖5 黃連素對GRP78的ATP酶活性和構(gòu)象的影響(A) ATPase activity of rGRP78 was examined, *P<0.05, **P<0.01.(B) ATP concentrations on the conversion of the GRP78 dimer to a monomer in HCT-116 cells.Different doses of ATP (1, 10 or 30 μmol/L) with HCT-116cells were incubated for 30 min at 25℃ in a 25 μL reaction mixture [20 mmol/L HEPES (pH 7.0)].The analysis for conformational changes was performed using non-denaturing gel electrophoresis.(C, D) Effect of berberine on the conformation of GRP78 in HCT-116 and DLD1 cells.(E) ATP (10 μmol/L) was incubated with different doses of berberine (1, 5 or 10 μmol/L).Proteins were separated on non-denaturing gels and subsequently detected by immunoblotting. M, monomer; D, dimer.Fig.5 Effects of berberine on ATPase activity and conformation change of GRP78

GRP78在多種腫瘤中的過度表達使其在腫瘤中的定位發(fā)生了變化。研究表明在細胞膜、胞質(zhì)、腫瘤分泌物等都發(fā)現(xiàn)有GRP78的存在,而其定位的異常對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了明顯的促進作用[26-27]。因此,GRP78抑制劑的尋找可能是腫瘤治療的趨勢。目前臨床藥物主要是針對實體瘤發(fā)揮抗腫瘤作用,有一些報道已經(jīng)顯示Isthmin可作為細胞表面GRP78的抑制劑[28-29],HA15和HK40A可作為胞內(nèi)GRP78的抑制劑[30-31],但針對腫瘤分泌型GRP78的抑制劑卻鮮有報道。已有研究表明GRP78可作為胃癌的血清診斷指標[32],而且它有強大的改造腫瘤微環(huán)境的功能[33],所以分泌型GRP78抑制劑的篩選也就成為腫瘤治療中亟待解決的任務(wù)。本研究首次發(fā)現(xiàn)了黃連素可以作為分泌型GRP78的抑制劑,阻斷其被進入外泌體進而被分泌到胞外,從而達到改善腫瘤微環(huán)境的目的。因此,黃連素可以用作輔助藥物與靶向腫瘤的抗癌藥物相結(jié)合以治療腫瘤。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)使用外源純化的rGRP78蛋白模擬腫瘤分泌型GRP78可以逆轉(zhuǎn)黃連素在5-Fu抗腫瘤中的協(xié)同效應(yīng),表明黃連素可能是通過抑制GRP78分泌發(fā)揮化療增敏作用。進一步的機制研究證實了黃連素增強5-Fu的抗腫瘤效應(yīng)是通過與腫瘤細胞中GRP78發(fā)生了直接的相互作用,抑制了GRP78的ATP酶活性,導致了GRP78活性的喪失,進而影響了GRP78被分選進入外泌體,從而使腫瘤細胞失去了通過分泌型GRP78調(diào)控微環(huán)境的能力,增強了腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。這表明GRP78是導致腫瘤細胞對化療藥物不敏感的重要原因,而黃連素能夠通過直接靶向GRP78發(fā)揮逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用。