左煜昕，馬靖福，劉 媛，張沛沛，栗孟飛，程宏波，陳思瑾，幸 華，楊德龍

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

穗粒數(shù)(kernel number per spike,KNS)作為小麥產(chǎn)量三大因素之一，是品種選育時重點(diǎn)考察的重要指標(biāo)[1-2]。水分是影響小麥產(chǎn)量及穩(wěn)定性的重要非生物脅迫因子，在干旱條件下，小麥穗粒數(shù)與干旱脅迫程度呈顯著負(fù)相關(guān)。隨著干旱脅迫的季節(jié)性頻發(fā)，以及農(nóng)業(yè)用水資源的日益匱乏，干旱脅迫作為主要限制因素之一，直接影響作物生長發(fā)育進(jìn)程，造成穗粒數(shù)減少，最終導(dǎo)致減產(chǎn)[3]。因此，通過遺傳學(xué)等方法提高穗粒數(shù)對小麥增產(chǎn)意義重大。

研究表明，小麥穗粒數(shù)是由微效多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，易受環(huán)境因素的影響[4]。近年來，隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，小麥穗粒數(shù)的分子數(shù)量遺傳研究取得了較大進(jìn)展。目前，研究者利用不同遺傳背景材料和遺傳圖譜，對小麥穗粒數(shù)進(jìn)行了數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait loci,QTL)定位和遺傳分析。周淼平等[5]利用小麥重組近交系(recombinant inbred lines, RILs)群體，在1B、1D、2A、2B、3B、4A、5D、6B和7A等9條染色體上檢測到11個控制穗粒數(shù)的QTL位點(diǎn)。吳秋紅等[6]利用小麥RIL群體定位了8個控制穗粒數(shù)的QTL，位于1A、3A、3D、4A和5B等5條染色體上，可解釋 4.06%～11.17%的表型變異。Lee等[7]利用小麥雙單倍體群體(double haploid lines, DH)在2A、3A和4A染色體上定位了3個控制穗粒數(shù)的主效QTL。張坤普等[8]利用小麥DH群體在2D、4D和5D染色體上檢測到與穗粒數(shù)緊密連鎖的QTL位點(diǎn)。然而，由于作圖群體材料遺傳背景、標(biāo)記類型、遺傳圖譜及環(huán)境條件的不同，導(dǎo)致小麥穗粒數(shù)定位的QTL數(shù)目、位置和遺傳效應(yīng)差異較大，難以獲得真實(shí)、穩(wěn)定的QTL位點(diǎn)和熱點(diǎn)區(qū)段，無法直接應(yīng)用于小麥育種實(shí)踐[9]。

元分析(meta-analysis)是一種可以合并不同研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析且可以對實(shí)際數(shù)據(jù)進(jìn)行全面檢驗(yàn)的方法。其中用于QTL元分析的BioMercator 4.2軟件，可將與目標(biāo)性狀相關(guān)的所有QTL位點(diǎn)映射整合在一張遺傳圖譜上，通過比對分析，挖掘出一致性真實(shí)QTL位點(diǎn)，并能進(jìn)一步縮小置信區(qū)間，獲得與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記。目前，該方法已廣泛應(yīng)用于各種作物不同性狀的整合定位研究[10]。李雪華等[11]對干旱脅迫下與玉米生理性狀和農(nóng)藝性狀相關(guān)的181個QTL整合元分析后，從中發(fā)掘出15個通用抗旱“一致性”QTL(meta quantitative trait loci, MQTL)。Goudemand等[12]利用7個DH群體對小麥葉枯病抗性相關(guān)的QTL進(jìn)行定位和元分析，最終得到115個抗病QTL和27個MQTL，并發(fā)現(xiàn)其中14個MQTL與株高和早熟性密切相關(guān)。胡雅君等[13]通過收集涉及小麥籽粒可溶性碳水化合物含量的168個QTL，構(gòu)建一致性圖譜，最終獲得16個MQTL。但迄今為止，有關(guān)小麥穗部相關(guān)性狀的QTL整合和元分析研究相對較少，尤其是關(guān)于小麥穗粒數(shù)的QTL元分析研究未見報道。為此，本研究利用生物信息學(xué)方法，將已報道的控制小麥穗粒數(shù)的QTL位點(diǎn)及其數(shù)目進(jìn)行收集整理，以小麥高密度遺傳圖譜作為參考圖譜，利用BioMercator 4.2軟件將QTL映射至該參考圖譜上，構(gòu)建小麥穗粒數(shù)QTL一致性圖譜，通過元分析發(fā)掘MQTL和候選標(biāo)記，為深入理解小麥穗部性狀的遺傳機(jī)制和精細(xì)定位提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以美國農(nóng)業(yè)部小麥公共數(shù)據(jù)庫(http://wheat.pw.usda.gov/)和已發(fā)表文獻(xiàn)中控制小麥穗粒數(shù)的QTL信息[5-8,14-26]為研究對象。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥穗粒數(shù)QTL數(shù)據(jù)收集整合

對已報道的控制小麥穗粒數(shù)QTL定位信息進(jìn)行收集，將收集到的每個QTL數(shù)據(jù)按照BioMercator 4.2軟件(http://www.mybiosoftware.com/biomercator-2-1-genetic-maps-qtl-integration.html)的要求進(jìn)行整理，包括QTL名稱、染色體位置、置信區(qū)間、連鎖系數(shù)、貢獻(xiàn)率、臨近標(biāo)記、LOD值和群體大小等，其中，QTL位置(置信區(qū)間和QTL最大可能位置)和遺傳貢獻(xiàn)率是影響QTL元分析的兩個重要參數(shù)，缺一不可。

1.2.2 小麥穗粒數(shù)QTL信息映射

根據(jù)收集到的小麥穗粒數(shù)性狀的QTL信息確定其所涉及的染色體，以Wheat composite 2004(https://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/GG3/report.cgi?class=mapdata;query=;name=Wheat,+Composite,+2004)高密度遺傳圖譜作為參考圖譜，將目標(biāo)QTL的最大可能位置和置信區(qū)間兩端坐標(biāo)按比例標(biāo)注到參考圖譜上，對比原始圖譜(即所收集的遺傳圖譜)與參考圖譜。為了獲得精確的映射結(jié)果，把不能直接映射到參考圖譜上的標(biāo)記，可先映射到Somers等[27]繪制的小麥整合圖譜(即中介圖譜)上，再利用圖譜上的公共標(biāo)記QTL映射到參考圖譜上，并將原始圖譜與參考圖譜上相關(guān)標(biāo)記載入BioMercator 4.2軟件中，建立圖譜信息庫?；趫D譜間的共有分子標(biāo)記，利用齊序函數(shù)將目標(biāo)QTL的最大可能位置和置信區(qū)間兩端坐標(biāo)按比例標(biāo)注到參考圖譜上，即映射，并將原始圖譜及參考圖譜間有爭議的標(biāo)記剔除。

1.2.3 小麥穗粒數(shù)QTL元分析

利用BioMercator 4.2軟件對小麥穗粒數(shù)QTL進(jìn)行元分析，將位于同一連鎖群相同位點(diǎn)附近的N個獨(dú)立存在的與目標(biāo)性狀相關(guān)的QTL進(jìn)行運(yùn)算，對獨(dú)立來源的同一性狀且位于同一座位或有重疊座位的QTL計算出一個MQTL，該QTL會給出5個模型(即模型1、2、3、4和N)，其中赤池信息量準(zhǔn)則(akaike-type criteria values, AIC)值最小的模型為最優(yōu)模型，即真實(shí)QTL模型，并通過高斯定理最大似然比估算該QTL存在的位置和置信區(qū)間。如果AIC值最小的為N模型，則表明用于分析的連鎖群過大，需要分為兩段來進(jìn)行元分析。如果整理數(shù)據(jù)時某一QTL置信區(qū)間未知，可通過Darvasi等[28]應(yīng)用的公式推斷95%的置信區(qū)間：

C.I=530/(N×R2)

(1)

C.I=163/(N×R2)

(2)

其中C.I指QTL 95%的置信區(qū)間，N代表作圖群體的大小，R2代表該QTL的遺傳貢獻(xiàn)率，公式(1)適用于F2群體和BC群體，公式(2)適用于RIL、DH及NIL群體。若已知置信區(qū)間，也可應(yīng)用該公式估算未知QTL的遺傳貢獻(xiàn)率。

1.2.4 基于小麥穗粒數(shù)MQTL范圍內(nèi)候選基因發(fā)掘

利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行目標(biāo)性狀QTL的整合，獲得穗粒數(shù)MQTL區(qū)域，針對這些區(qū)域內(nèi)的EST或DNA序列搜索候選基因。該法的原理為：物種內(nèi)及物種間的序列同源性，基因的功能和序列是密切相關(guān)的，當(dāng)序列的相似性超過一定的范圍時，它們可能執(zhí)行相同的功能，通過將未知功能序列和已知功能序列的對比，如果它們相似性較高，就可以推斷出序列的相應(yīng)功能。

在參考圖譜Wheat composite 2004上，由元分析所得的小麥穗粒數(shù)MQTL區(qū)域(meta-C.I)由兩端標(biāo)記界定。對MQTL區(qū)間及其鄰近區(qū)域的穗粒數(shù)相關(guān)基因位點(diǎn)進(jìn)行整理，根據(jù)MQTL區(qū)間的基因位點(diǎn)名稱，在GrainGenes(https://wheat.pw.usda.gov/)網(wǎng)站，下載目標(biāo)性狀“一致性”區(qū)段內(nèi)的相關(guān)基因序列和各種標(biāo)記的原始序列，從而確定MQTL在染色體物理圖譜上的位置。利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫(http://202.194.139.32/)中JBrowse工具檢索MQTL內(nèi)的基因信息，并獲得該區(qū)間內(nèi)所有基因的功能注釋信息。最后在NCBI網(wǎng)站上下載這些基因的序列，并利用其在線工具BLAST分析比對相關(guān)基因序列，進(jìn)而預(yù)測目標(biāo)性狀候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥穗粒數(shù)QTL信息的收集整合結(jié)果

從小麥公共數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表文獻(xiàn)中收集到來源于花培3×豫麥57、Keumkang×Olgeuru、小麥-冰草衍生系3228×京4839、川麥42×川農(nóng)16、洛旱2×濰麥8、濰麥8×煙農(nóng)19、濰麥8×濟(jì)麥20、望水白×Alondra、蘭考906×小偃21、G1816×Langdon、西農(nóng)817×中國春、燕達(dá) 1817×北農(nóng)6、揚(yáng)麥17×寧麥18、糯麥1×藁城8901、TP×Ta13等18個作圖群體，共涉及小麥穗粒數(shù)的163個QTL(表1)。利用BioMercator 4.2軟件中的QTL projection功能將收集到的數(shù)據(jù)映射至Wheat composite 2004小麥參考圖譜上。LOD值在2.01～41.13之間，各位點(diǎn)的遺傳貢獻(xiàn)率在2.20%～32.75%之間。

表1 小麥穗粒數(shù)QTL數(shù)據(jù)整合Table 1 Integration of QTL data for the kernel number per spike in wheat

2.2 小麥穗粒數(shù)QTL一致性圖譜的構(gòu)建

將原始圖譜與參考圖譜Wheat composite 2004 上相關(guān)標(biāo)記載入BioMercator 4.2軟件，利用圖譜映射程序構(gòu)建小麥穗粒數(shù)QTL一致性圖譜。結(jié)果(圖1)表明，控制小麥穗粒數(shù)的QTL覆蓋了小麥21條染色體，各染色體上分布不均，在7D染色體上最少(2個QTL)，2B染色體上最多(17個QTL)，其他染色體上分布3～12個。其中，在QTL一致性圖譜的同一連鎖群上有明顯成簇分布現(xiàn)象，存在QTL富集區(qū)域。如在2A、3A和7B連鎖群上各有2個QTL簇，在2D、3D和6B連鎖群上各有1個QTL簇。這些QTL彼此間有區(qū)間的重疊，大都出現(xiàn)在一段區(qū)間內(nèi)，如在3A連鎖群的80 cM左右有8個QTL，說明該區(qū)間很可能是控制目標(biāo)性狀的熱點(diǎn)區(qū)域并存在更為真實(shí)重要的QTL，含有大量控制小麥穗粒數(shù)的基因(圖1)。

染色體左側(cè)“點(diǎn)”至“橫線”表示QTL所在位點(diǎn)的遺傳貢獻(xiàn)率大小的連續(xù)變化；“豎線”表示QTL所在置信區(qū)間。The “dot” to “transverse line” on the left side of chromosome means the successive change in genetic contribution rate of QTL; “Vertical line” means the confidence interval of QTL.圖1 小麥穗粒數(shù)QTL一致性圖譜Fig.1 Consensus map of QTL for kernel number per spike in wheat

2.3 小麥穗粒數(shù)QTL元分析

結(jié)合小麥已定位的QTL信息，利用BioMercator 4.2軟件中元分析程序分析各連鎖群上的QTL。由于分析模型不同，以每次分析中AIC值最小的區(qū)間為最優(yōu)，確定1個真實(shí)QTL，最終共得到35個控制小麥穗粒數(shù)的MQTL(表2)，分別位于小麥的1D(2個)、2A(4個)、2D(4個)、3A(4個)、3D(3個)、4D(4個)、5A(4個)、6B(4個)、7B(4個)和7D(2個)染色體上，平均每條染色體上含有3.4個MQTL。

表2 小麥穗粒數(shù)QTL的元分析Table 2 Meta-analysis of QTL for the kernel number per spike in wheat

將35個控制小麥穗粒數(shù)的MQTL按照其所在染色體的位置依次排序?yàn)镸QTL1～MQTL35，其中有7個MQTL的置信區(qū)間小于 3 cM,分別是MQTL7(0.55 cM)、MQTL8(2.70 cM)、MQTL11(1.67 cM)、MQTL12(2.10 cM)、MQTL18(1.62 cM)、MQTL31(2.32 cM)和MQTL32(1.00 cM)。經(jīng)元分析后，這些檢測到的MQTL所存在的位置和置信區(qū)間均優(yōu)化了原QTL的位置和效應(yīng)，縮小了原置信區(qū)間，檢測出更為精確的MQTL，很大程度上減小了由于不同試驗(yàn)所得到的QTL位置差異而造成的誤差，提高了QTL定位的準(zhǔn)確度和有效性。其中，4個MQTL均分布在3A染色體的相鄰區(qū)域，并且其圖距均小于10 cM (1.67～7.55 cM)；除此之外，MQTL27(162.20～182.60 cM)與MQTL28 (166.54～188.74 cM)的置信區(qū)間有很大的重合，這表明這些區(qū)段很可能對小麥穗粒數(shù)具有重要貢獻(xiàn)。

2.4 小麥穗粒數(shù)MQTL范圍內(nèi)候選基因預(yù)測

根據(jù)QTL一致性區(qū)間內(nèi)的SSR標(biāo)記所在參考基因組中的位置，利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫所提供的基因注釋結(jié)果和基因預(yù)測，對小麥穗粒數(shù)定位區(qū)域進(jìn)行了候選基因的預(yù)測。由于較小的QTL置信區(qū)間有利于提高QTL定位的準(zhǔn)確度和有效性，根據(jù)“一致性”QTL區(qū)間兩端標(biāo)記在小麥物理圖譜中的位置，將小麥穗粒數(shù)定位結(jié)果中圖距較小較精確的MQTL位點(diǎn)進(jìn)行物理圖譜定位，統(tǒng)計MQTL區(qū)間內(nèi)所包含的基因個數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2D染色體上，與小麥穗粒數(shù)性狀緊密連鎖的兩個分子標(biāo)記在Xcfd168.2～Xwmc41.1之間(即MQTL8)，其遺傳距離為82.65～85.35 cM(≈2.57 Mb)范圍內(nèi)，共包含112個基因，單位長度內(nèi)基因個數(shù)為43.6個。

由表3可以看出，本研究共發(fā)現(xiàn)了4個與目標(biāo)性狀相關(guān)的候選基因，這些基因座位涉及信號傳導(dǎo)、滲透調(diào)節(jié)和糖代謝等多種生理生化途徑。YUC基因家族編碼類黃素單氧化酶，是IAA生物合成途徑中催化色胺的N-氧化反應(yīng)的限速酶，對生長素的合成起重要調(diào)控作用；SUS蔗糖合酶基因作為籽粒中糖積累轉(zhuǎn)運(yùn)的重要代謝基因，對籽粒產(chǎn)量有重要影響；ERF家族轉(zhuǎn)錄因子是植物中重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物各類生理過程。對目標(biāo)性狀MQTL8的置信區(qū)間進(jìn)行候選基因篩選，獲得CKX基因家族成員。研究表明，CKX作為降解細(xì)胞分裂素(cytokinins)的一種黃素酶，廣泛分布于植物各個部位，CKX對植物配子發(fā)育和作物產(chǎn)量的形成具有顯著的影響。以上候選基因均為與小麥產(chǎn)量可能相關(guān)的基因，在一定程度上對改善產(chǎn)量發(fā)揮重要作用，然而具體功能有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

表3 小麥穗粒數(shù)MQTL內(nèi)相關(guān)候選基因信息Table 3 Candidate genes within MQTLs related to the kernel number per spike in wheat

3 討 論

3.1 圖譜的選擇

元分析中最重要的就是分子標(biāo)記遺傳參考圖譜的選擇。在小麥相關(guān)性狀元分析的過程中最常用的是以11張標(biāo)準(zhǔn)圖譜整合的Wheat composite 2004，該圖譜共涉及3 741個標(biāo)記，所包含的分子標(biāo)記主要是以簡單重復(fù)序列(SSR)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)組合構(gòu)建，總長3 236 cM。該圖譜與已完成和正在繪制的QTL定位圖譜間存在較多共同標(biāo)記，但是研究發(fā)現(xiàn)，某些研究中原始圖譜的標(biāo)記仍與參考圖譜中標(biāo)記一致性較差，個別目標(biāo)性狀QTL不能直接映射到該參考圖譜上，因此，本研究使用Somers等[27]繪制的小麥整合圖譜作為中介圖譜，該圖譜與Wheat composite 2004參考圖譜存在許多共同標(biāo)記，并且標(biāo)記覆蓋面較廣，提高了目標(biāo)性狀圖譜與參考圖譜間的映射，縮短了兩標(biāo)記之間的距離，為精細(xì)定位提供良好的基礎(chǔ)，保證了QTL的整合分析。

3.2 元分析應(yīng)用

近年來，利用元分析方法對玉米、大豆等作物相關(guān)性狀QTL的遺傳改良取得了一定進(jìn)展。方永豐等[29]整合了173個與玉米持綠性相關(guān)的QTL，發(fā)掘出5個持綠MQTL區(qū)間，并在MQTL區(qū)域內(nèi)發(fā)掘出8個持綠相關(guān)候選基因；王曉麗等[30]構(gòu)建了含221個玉米產(chǎn)量及構(gòu)成因子QTL的整合圖譜，并在玉米6號染色體上確定了一個與穗數(shù)、粒重和單位籽粒產(chǎn)量均相關(guān)的MQTL。吳 瓊等[31]通過對來自10個不同群體的與大豆生育期有關(guān)的98個QTL進(jìn)行元分析，最終獲得了9個MQTL及其連鎖標(biāo)記。當(dāng)大量控制目標(biāo)性狀的基因或QTL被整合到一致性圖譜上后，控制相同和不同的目標(biāo)性狀的QTL分布特征更加明顯。但是利用元分析手段對小麥數(shù)量性狀進(jìn)行QTL整合研究的報道較少，尤其是小麥穗粒數(shù)的元分析研究還相對滯后。隨著小麥全基因組信息的完善以及物理圖譜的成功構(gòu)建，對于QTL熱點(diǎn)區(qū)域和被前人反復(fù)證實(shí)的小麥目標(biāo)性狀QTL的核心染色體區(qū)段，將是發(fā)掘小麥關(guān)鍵基因的重點(diǎn)研究部位，可為小麥克隆及分子改良育種提供大量侯選基因。

本研究整合了近年發(fā)表的163個控制小麥穗粒數(shù)的QTL，構(gòu)建了小麥穗粒數(shù)QTL一致性圖譜，具有簇集分布的特征，并通過元分析，得到了35個MQTL及其緊密連鎖標(biāo)記，其置信區(qū)間最小可縮小到0.55 cM，明顯減小了QTL的誤差，使結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。其中，本研究在3A染色體上P78/M69.3～Xbcd1431.1區(qū)間內(nèi)獲得的MQTL與葉亞瓊等[32]在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)的控制株高的MQTL享有相同的標(biāo)記區(qū)間。Tuberosa等[33]認(rèn)為，這種現(xiàn)象可能與“一因多效”或者控制不同性狀的基因緊密連鎖有關(guān)，這可為圖譜構(gòu)建以及尋找和定位同源基因提供切入點(diǎn)。本研究所發(fā)掘的MQTL是由不同作圖群體材料整合的，后續(xù)可以利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)(marker assisted selection, MAS)，對后代進(jìn)行基因型預(yù)測，進(jìn)而提高M(jìn)AS的實(shí)際效率。

3.3 相關(guān)基因發(fā)掘

隨著小麥全基因組測序的完成，各種生物信息的迅速增長，對未能精細(xì)定位的基因提供了越來越多的研究策略和思路。在MQTL區(qū)域內(nèi)可以獲得許多DNA序列，這些序列具有較完整的基因結(jié)構(gòu)，從而可以對相關(guān)基因進(jìn)行預(yù)測。同時也可以通過對蛋白序列的同源比對，以此來確定基因的功能[34]。

通過在QTL置信區(qū)間進(jìn)行候選基因預(yù)測，可以在一定程度上驗(yàn)證QTL定位的準(zhǔn)確性。在本研究中，充分利用不同的研究成果以及公共信息資源，對不同時期、不同環(huán)境條件和不同研究群體下定位的小麥穗粒數(shù)QTL進(jìn)行整合優(yōu)化，得到了MQTL。利用兩端標(biāo)記在物理圖譜中的位置，初步預(yù)測MQTL區(qū)域內(nèi)的相關(guān)基因。最終，在1個MQTL區(qū)間(MQTL8)內(nèi)初步確定4個與產(chǎn)量性狀相關(guān)的候選基因，這些基因座位涉及信號傳導(dǎo)、滲透調(diào)節(jié)和糖代謝等多種生理生化途徑。其中，通過對候選基因序列同源比對，發(fā)現(xiàn)TraesCS2D01G587100LC.1基因與TaCKX基因[35]的序列同源性較高(91%)，因此我們推斷該基因也與小麥籽粒發(fā)育可能緊密相關(guān)。研究表明，小麥CKX是由一系列同工酶組成的[35]，具有調(diào)控小麥不同時期生長發(fā)育的功能，TaCKX與水稻、玉米和大麥等作物CKX基因具有較高的同源性。目前已知TaCKX基因與許多產(chǎn)量性狀關(guān)系密切，最新研究表明該基因的等位變異與葉綠素含量也緊密相關(guān)[36]。因此，在后續(xù)研究中，可以對該基因進(jìn)行本體分析、轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析以及代謝途徑分析，進(jìn)一步為精細(xì)定位和圖位克隆奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)證明，利用元分析手段可獲得較小置信區(qū)間的MQTL，然后映射到物理圖譜上，可以將目的基因鎖定在一個較小的范圍內(nèi)。再針對目標(biāo)區(qū)段構(gòu)建回交群體，根據(jù)基因的保守性進(jìn)行目標(biāo)基因的發(fā)掘，通過這種方法可以提高基因克隆的效率。