李克，潘麗紅，羅小虎，王莉，王韌，邢家溧，杜志紅，孫冬玲，陳正行，*

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；4.寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江寧波315048；5.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；6.無錫愛邦輻照技術(shù)有限公司，江蘇無錫214151）

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物，在農(nóng)作物收獲過程中廣泛存在。由于其對動物和人體的嚴重危害，真菌毒素在谷物中的污染已成為全球飼料和食品安全問題關(guān)注焦點[1-4]。在眾多真菌毒素中，由Aspergillus 和Penicillium 分泌的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和Fusarium 分泌的赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）在植物來源食品真菌毒素污染中占重要比重，如大麥、玉米、燕麥、小麥等[5-6]。ZEN 可導(dǎo)致雌激素效應(yīng)，擾亂動物的生殖系統(tǒng)[7]。OTA 已被國際腫瘤研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer ，IARC）認定為潛在致癌物[8]。中國和歐盟對ZEN 和OTA 在人可直接消費谷物中的限量分別為 50、60 、5、75 μg/kg，以保障食品安全[9-10]。

近年來，相繼有研究報道了真菌毒素在谷物和谷物制品中的共污染現(xiàn)象，其中ZEN 和OTA 的共污染占有較大比重，引起研究者的重視，對其聯(lián)合毒性和相互作用機制進行了探討[11-14]。研究表明，與ZEN 和OTA 單一毒性相比，二者聯(lián)合毒性呈顯著拮抗效應(yīng)。Halabi 等基于動物學(xué)實驗，從病理學(xué)角度闡明了ZEN和OTA 的單一和聯(lián)合毒性，混和毒素在大部分指標上呈現(xiàn)出拮抗效應(yīng)[15]。Wang 等采用HepG2 細胞研究了ZEN 和OTA 的聯(lián)合毒性，結(jié)果顯示出二者的拮抗效應(yīng)與時間和濃度相關(guān)[16]。為應(yīng)對ZEN 和OTA 在谷物中的共污染，亟需一種快速、高靈敏度和準確度的同時檢測方法。

在過去十年中，免疫膠體金技術(shù)（immune colloidal gold technique，ICGT）[17-18]，超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）[19-20]和高效液相串聯(lián)離子阱質(zhì)譜法（high perfor mance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry，HPLC-ITMS）已被用于 ZEN 和 OTA 的同時檢測。然而，ICGT 技術(shù)受限于定量和靈敏度問題，UHPLCESI-MS/MS 和HPLC-ITMS 具有高選擇性和靈敏度的同時，也面臨相對復(fù)雜繁瑣的操作步驟和昂貴的儀器設(shè)備問題[21]。相比之下，高效液相色譜法（high performanceliquidchromatography，HPLC）具有實驗室真菌毒素檢測的實際可行性[22]。近年來，也有研究者報道了HPLC在不同基質(zhì)中真菌毒素同時檢測中的應(yīng)用。H E OK 等采用HPLC 柱后衍生對干辣椒和辣椒粉中的黃曲霉毒素、ZEN 和OTA 進行了檢測，取得良好的分離效果和定量結(jié)果，定量限（quantification limit ，LOQ）分別為13.25 μg/kg 和 0.45 μg/kg[23]。Rahmani 等也對黃曲霉毒素、ZEN 和OTA 在谷物中的同時檢測做了大量方法學(xué)研究，盡管該方法具有更低的定量限，然而卻需要更長的洗脫時間[24-26]。杜晶晶等將兩種免疫親和柱串聯(lián)實現(xiàn)了ZEN 和OTA 在糧食中的同時檢測，但存在成本高昂的缺陷[27]。黎睿等開發(fā)了同時檢測糧食中8 種常見真菌毒素的高效液相檢測方法，但從色譜圖中可知，部分毒素保留值過于接近，實際應(yīng)用過程中可能出現(xiàn)分離效果不理想的問題[28]。李軍等的方法則同時存在保留值過于接近和洗脫時間長的問題[29]。王向紅等報道的方法在未采用凈化柱的條件下，實現(xiàn)ZEN 和OTA 的同時檢測，然而樣品前處理較復(fù)雜，耗時長，檢出限較高，分別為 13 μg/kg 和 1.25 μg/kg 且線性范圍過窄，在實際污染谷物樣品檢測中應(yīng)用可能受限[30]。

對于谷物中真菌毒素的痕量分析，樣品制備過程必不可少，本研究嘗試了不同比例的甲醇、乙腈和水的混合液作為提取溶劑以實現(xiàn)回收率的最大化；選擇多功能凈化柱和固相萃取柱用于萃取液的凈化，篩選適宜的凈化柱，并對HPLC 檢測條件進行了優(yōu)化。旨在建立一種靈敏、快速的HPLC 同時檢測玉米、小麥和稻米中ZEN 和OTA 的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

ZEN 和OTA 標準品、乙酸（色譜純）：純度≥99.8%，百靈威科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：美國Fisher Scientific 公司；試驗用超純水（電阻≥18.2 MΩ/cm）：Millipore-QSP 超純水儀制備；氮氣、氧氣（純度≥99.8 %）：無錫新南化學(xué)氣體有限公司；其他試劑（分析純）：上海國藥化學(xué)試劑有限公司；無毒素小麥、玉米和稻米：Romer labs。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

HPLC 1260 型帶熒光檢測器、ZORBAX SB C18 型色譜柱：美國安捷倫公司；MD200-1 型氮吹儀：杭州奧盛儀器有限公司。Mycosep 226、227 多功能凈化柱：Romer labs 公司；Oasis PRiME HLB 60 mg/3 mL 固相萃取柱：Waters 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 ZEN 和OTA 標準儲備液和工作液的配制

將ZEN 溶于甲醇溶液，OTA 溶于乙腈溶液，分別配備成20 μg/mL 的標準儲備液，-20 ℃保藏。取一定量ZEN 和OTA 標準儲備液，分別加入甲醇，配置成10 μg/mL 的標準工作液，4 ℃保藏；分別取一定量ZEN和OTA 標準工作液，混合后用甲醇稀釋為兩者濃度分別為 10 μg/kg～2 000 μg/kg 和 0.2 μg/kg～200 μg/kg 的毒素混合工作液，4 ℃保藏。

1.2.2 樣品制備與ZEN 和OTA 的同時提取

未污染的玉米和小麥經(jīng)磨粉過30 目篩后，分別定量加入ZEN 和OTA 標準工作液，使加標后的樣品中所含兩種毒素終濃度分別為 20、200、2 000 μg/kg 和 0.5、20、200 μg/kg，隨后所有樣品室溫放置過夜后待測。

4 種不同的提取溶劑，包括甲醇/水（80/20，體積比）、乙腈/水（80/20，體積比）、乙腈/水（84/16，體積比）、乙腈/水/1%乙酸（79/20/1，體積比），被用于樣品中混和毒素的同時提取。不同提取時間和溫度也被用于搖床振蕩提取過程。

優(yōu)化后的樣品提取凈化方法：稱取25 g 樣品至250 mL 錐形瓶，加入 100 mL 乙腈/水（80/20，體積比），放入空氣恒溫振蕩搖床，200 r/min，30 ℃下振蕩30 min，玉米樣品另需加入4 g NaCl。振蕩結(jié)束，取過濾后的提取液5 mL 直接過Oasis PRiME HLB 凈化柱，隨后用1 mL 乙腈分兩次洗脫。收集洗脫液至離心管，50 ℃下輕柔氮吹至干，流動相復(fù)溶，過0.22 μm 針孔濾膜后用于上樣檢測。

1.2.3 HPLC 檢測條件

高效液相色譜儀帶G1312B 熒光檢測器，Agilent 1260 型。色譜柱：ZORBAX SB-aq 色譜柱（4.6×150 mm，填料直徑5 μm）。流動相組成為2%乙酸/乙腈/甲醇（60/30/10，體積比），熒光檢測器激發(fā)波長為325 nm，發(fā)射波長 455 nm，柱溫 30 ℃，進樣量 50 μL，流速1 mL/min，洗脫時間為25 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC條件優(yōu)化

以分離效果和色譜峰形為指標，本研究對流動相、柱溫、流速和檢測波長進行優(yōu)化。不同比例的2%的乙酸（體積比）、乙腈和甲醇被用作流動相進行樣品的洗脫。結(jié)果表明，當(dāng)三者比例為60/30/10（體積比）時，分離效果最佳，色譜峰形最好。乙腈含量過高或過低均會導(dǎo)致色譜峰重疊或洗脫時間較長的問題。

當(dāng)柱溫從25 ℃升到35 ℃，樣品洗脫明顯加快，峰間距逐漸縮短。25 ℃時，樣品洗脫時間大于30 min；35 ℃時，ZEN 和OTA 色譜峰間距過窄，在濃度分別為1 000 μg/kg 和 200 μg/kg 時存在粘連；30 ℃時，二者色譜峰具有合理的峰間距，且可在25 min 內(nèi)完成洗脫過程。因此，選擇30 ℃為色譜檢測的柱溫。

在上述流動相和柱溫條件下，將洗脫流速從0.9 mL/min 升至1.1 mL/min，洗脫時間進一步縮短，峰形更尖銳，然而檢出峰面積卻呈下降趨勢。因此，選擇1.0 mL/min 為最佳流速，此時色譜峰形良好、洗脫時間合理且峰面積處于可接受范圍內(nèi)。

此外，由于ZEN 和OTA 色譜保留值較為接近，采用分段設(shè)置檢測波長的方法，可能導(dǎo)致樣品檢出時間過短的問題。因此，本研究參考已有研究[30]，采用相同波長下檢測兩種毒素的方法，經(jīng)測試，在激發(fā)波長325 nm 和發(fā)射波長 455 nm 時，ZEN 和 OTA 均具有較高的響應(yīng)值。

優(yōu)化后的最佳HPLC 檢測條件為：2%乙酸/乙腈/甲醇（60/30/10，體積比）為流動相，柱溫 30 ℃，流速1.0 mL/min，激發(fā)波長325 nm，發(fā)射波長455 nm，具體檢測結(jié)果如圖1 所示。

2.2 樣品提取

以回收率為指標，對谷物樣品中加標毒素提取條件進行優(yōu)化，包括提取溶劑、溫度和時間。同溶劑對加標玉米樣品中ZEN 和OTA 的提取效果見表1。

如表1 所示，4 種不同的提取溶劑被用于加標玉米中 ZEN（200 μg/kg）和 OTA（20 μg/kg）的同時提取。結(jié)果表明，不同提取溶劑所得毒素回收率有顯著差異（p＜0.05），當(dāng)使用乙腈/水（80/20，體積比）作為提取溶劑時，所得回收率最高，ZEN 和OTA 回收率分別為92.1%和101%，其次為乙腈/水（84/16，體積比）。乙腈/水/乙酸（79/20/1，體積比）盡管對ZEN 有較高回收率，但OTA 回收效果較差。甲醇/水（80/20，體積比）對兩種毒素的回收效果最差，與文獻報道有較大差異，推測可能是由于其在樣本制備階段采用均質(zhì)提取[25]。此外，甲醇/水（80/20，體積比）所得提取液中雜質(zhì)含量最高，可能會對后續(xù)凈化步驟有所干擾。

圖1 ZEN 和OTA 的標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of ZON and OTA in the reference standard solutions

表1 不同溶劑對加標玉米樣品中ZEN 和OTA 的提取效果Table 1 Recoveries（Rec）of ZON and OTA in spiked corn samples extracted by different solvents

不同提取條件下加標玉米樣品中ZEN 和OTA 的提取效果見表2。

提取溫度和時間的優(yōu)化結(jié)果如表2 所示，采用乙腈/水（80/20，體積比）作為提取溶劑，當(dāng)搖床溫度為30 ℃，振蕩 30 min 時，ZEN 和 OTA 回收率最高，分別達到101.2%和92.3%。更長的提取時間和較低提取溫度均會影響二者回收率，尤其是OTA。

表2 不同提取條件下加標玉米樣品中ZEN 和OTA 的提取效果Table 2 Recoveries（Rec）of ZON and OTA in spiked corn samples under different extraction conditions

2.3 提取液的凈化

3 種凈化柱被用于上述提取液的凈化，包括Mycosep226、Mycosep227 和 Oasis PRiME HLB，其中 Oasis PRiME HLB 是Waters 新型反相固相萃取吸附劑，相較于其他Oasis 固相萃取柱產(chǎn)品系列，具有操作更簡單、除雜更徹底的優(yōu)點。經(jīng)Mycosep226 和Mycosep227 凈化后的提取液中，ZEN 和OTA 兩者之一或兩者均存在回收率較低的問題，而采用Oasis PRiME HLB 凈化后，提取液中絕大部分雜質(zhì)被去除，且ZEN 和OTA 檢測效果良好，如圖2 所示。

圖2 空白玉米樣品和 ZEN（200 μg/kg）、OTA（20 μg/kg）加標玉米樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank corn sample and of a sample spiked with 200 μg/kg ZON and 20 μg/kg OTA

2.4 方法驗證

檢測方法的檢測限（limit of detection，LOD）、LOQ和相關(guān)系數(shù)見表3。

如表3 所示，本方法對于ZEN 和OTA 具有良好的線性，相關(guān)性系數(shù)R2值均大于0.99，線性范圍分別為 10 μg/kg～2 000 μg/kg 和 0.2 μg/kg～200 μg/kg，ZEN和 OTA 的檢出限（LOD）分別為 3.7 μg/kg 和 0.11 μg/kg，LOQ 分別為 12.25 μg/kg 和 0.38 μg/kg，LOD 和 LOQ 分別以3 倍和10 倍信噪比估計，與HEOK 等的結(jié)果相近[23]。

表3 檢測方法的LOD、LOQ 和相關(guān)系數(shù)Table 3 LOD，LOQ and correlation coefficients for method validation

加標玉米樣品中ZEN 和OTA 檢測的準確度和精密度見表4。

表4 加標玉米樣品中ZEN 和OTA 檢測的準確度和精密度Table 4 Accuracy and precision for mycotoxin determination in spiked corn samples

如表4 所示，加標玉米樣品的檢測分別在不同的3 d 重復(fù)3 次。兩種毒素的準確度為83.1%～101.3%，日內(nèi)精密度（relative standard deviation-within-day precision，RSDr）和日間精密度（relative standard deviationinter-day precision，RSDR）均小于 9.3%。

加標玉米和小麥中ZEN 和OTA 的檢測效果見表5。

表5 加標玉米和小麥中ZEN 和OTA 的檢測效果Table 5 Mean recoveries（Rec），standard deviation（SD）and relative standard deviation（RSD）for the simultaneous determination of ZON and OTA in corn and wheat

檢測結(jié)果如表5 所示，本方法對兩種加標谷物中的毒素均具有良好回收率和精密度，與Rahmani 等的結(jié)論相似，不同基質(zhì)未影響毒素回收率[26]。因此，本研究所開發(fā)的檢測方法可用于谷物中ZEN 和OTA 的同時檢測。

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種可以靈敏、快速地同時檢測玉米和小麥中ZEN 和OTA 的HPLC 檢測方法。該方法具有經(jīng)濟、設(shè)備要求合理的特點，對于玉米和小麥等常見的谷物均具有良好的回收率和精密度，日內(nèi)精密度與日間精密度均小于9.3%，具有實際應(yīng)用于實驗室日常檢測的可行性，有利于推動谷物質(zhì)量安全建設(shè)。