吳紅艷，彭呈軍，鄧后勤，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.慈利縣九九農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，湖南張家界427200）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver），屬杜仲科，具有抗氧化、降血壓[1]、強(qiáng)筋健骨[2]、改善糖代謝、補(bǔ)肝腎[3-4]等功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉與杜仲皮具有相似的功能成分和藥理作用[5]，含有蘆丁[6]、綠原酸、杜仲膠[7]、桃葉珊瑚苷[8]、槲皮素、京尼平苷酸、山奈酚等化學(xué)成分，綠原酸和黃酮類化合物是杜仲葉的主要活性成分。綠原酸具有較強(qiáng)的抗衰老、清除自由基、殺菌、抗病毒、抗癌、降血脂、保護(hù)心血管等作用[9-14]。因此，杜仲葉綠原酸的提取開(kāi)發(fā)成為研究者關(guān)注的重點(diǎn)[15]。

綠原酸屬于半水合物，為針狀結(jié)晶水，是由咖啡酸和奎尼酸形成的酯。國(guó)內(nèi)對(duì)于杜仲葉綠原酸提取方法的研究較多，主要有超聲波輔助提取法[16]、水提取法[17]、微波輔助提取法[18]、酶提取法[19-20]等，而國(guó)外相關(guān)的研究較為缺乏。在從植物提取過(guò)程中，一般采用極性較強(qiáng)的水[21]、乙醇[22-23]、甲醇、丙酮等提取溶劑。

單因素試驗(yàn)效率高，但只能確定大致的參數(shù)范圍，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可尋找最佳因素水平組合，但是不能給出明確的回歸方程，無(wú)法找到最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，因此，傳統(tǒng)的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)已經(jīng)不能滿足提取工藝優(yōu)化要求[24]，基于響應(yīng)面分析方法不僅能夠縮短試驗(yàn)優(yōu)化時(shí)間，而且能夠快速建模，因此，本文在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法分析提取時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、超聲功率對(duì)杜仲葉中綠原酸提取得率的影響，以期為杜仲葉綠原酸的提取工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉8 號(hào)：湖南省慈利縣九九農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司；綠原酸對(duì)照品（純度≥99%）：成都曼思特生物科技有限公司。

甲醇（色譜純）、乙酸（優(yōu)級(jí)純）、乙腈（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1100 型高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；DTY-A220 型電子天平：美國(guó)康州HZ 電子科技有限公司；TF-FD-1L 型冷凍干燥機(jī)：上海拓紛機(jī)械設(shè)備有限公司；KM-300DE 型中文液晶超聲波清洗器：昆山美美超聲儀器有限公司；LH-08B 型中藥粉碎機(jī)：浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠制造。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

杜仲葉清洗后于零下80 ℃冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，用中藥粉碎機(jī)將干燥后的杜總?cè)~粉碎后過(guò)60目篩，篩過(guò)的葉粉在4 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.3.2 綠原酸的提取

稱取0.5 g～2.0 g 粉碎均勻的試樣（精確到0.001 g）于25 mL 比色管中，加入20 mL 一定體積分?jǐn)?shù)的甲醇，在一定的超聲功率下提取一定的時(shí)間后，用一定體積分?jǐn)?shù)的甲醇定容到 25 mL，混勻，過(guò) 0.22 μm 濾膜，濾液供液相色譜分析。試樣中綠原酸的提取得率按下面公式計(jì)算：

式中：X 表示試樣中綠原酸含量，%；c 表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得進(jìn)樣液中綠原酸的濃度，μg/mL；V 表示試樣定容體積，mL；m 表示試樣質(zhì)量，g。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g 于10.0 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，混勻，制得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，準(zhǔn)確量取1.00 mL 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10.0 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，混勻，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)使用液并在容量瓶中定容的濃度分別為 2.00、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸曲線方程為Y=13.206 6x-11.983，R2=0.999 6，其中 Y 為綠原酸峰面積（mAU·S），x 為進(jìn)樣量（μg/mL），結(jié)果表明綠原酸在 2 μg/mL～80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 考察提取時(shí)間

準(zhǔn)確稱取0.5 g 杜仲葉粉末于25 mL 試管中，在甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，溫度60 ℃，超聲功率180 W 的條件下，分別提取 15、30、45、60、75 min，然后過(guò)濾，稀釋相同倍數(shù)，待測(cè)。

1.3.4.2 考察甲醇體積分?jǐn)?shù)

準(zhǔn)確稱取0.5 g 杜仲葉粉末于25 ml 試管中，設(shè)置溫度60 ℃，超聲功率180 W，加入體積分?jǐn)?shù)為40 %、50%、60%、70%、80%的甲醇20 mL 于試管中超聲提取45 min。過(guò)濾，稀釋相同倍數(shù)，待測(cè)。

1.3.4.3 考察超聲功率

準(zhǔn)確稱取0.5 g 杜仲葉粉末于25 mL 試管中，設(shè)置溫度60 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，在超聲功率分別為150、180、210、240、270 W 的條件下提取 45 min。過(guò)濾，稀釋相同倍數(shù)，待測(cè)。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流速 1.0 mL/min，流動(dòng)相：0.5%乙酸溶液+乙腈=9+1，檢測(cè)波長(zhǎng) 327 nm，進(jìn)樣量 20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 10（32-bit）軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，采用OriginPro 8.5 軟件繪制試驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響

在溫度60 ℃，提取功率180 W，甲醇體積分?jǐn)?shù)50%的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction yield of chlorogenic acid

從圖1 可以看出，在超聲波輔助提取的作用下，綠原酸的提取得率隨時(shí)間變長(zhǎng)而逐步增加，在60 min 時(shí)達(dá)到最大值，隨后減小。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間的延長(zhǎng)，可能導(dǎo)致綠原酸的結(jié)構(gòu)被破壞[25]以及雜質(zhì)的溶出。因此，選擇最佳提取時(shí)間為60 min。

2.1.2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取得率的影響

在溫度60 ℃，提取功率180 W，提取時(shí)間45 min條件下，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取得率的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取得率的影響Fig.2 Effect of methyl alcohol mass fraction on extraction yield of chlorogenic acid

從圖2 可以看出，綠原酸提取得率在甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%左右最高。由于綠原酸結(jié)構(gòu)特殊，含有很多極性不同的化學(xué)鍵，往往通過(guò)分子內(nèi)酯基遷移或水解而產(chǎn)生異構(gòu)化，彼此最適合的溶劑極性各不相同。因此，綠原酸的提取得率會(huì)隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增大后減小。李輝等[26]比較了水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等不同極性的溶劑對(duì)杜仲葉綠原酸提取率的影響，發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑時(shí)，綠原酸提取率最高，丙酮為提取劑時(shí)提取率最低，用水提取時(shí)，植物中的蛋白質(zhì)、淀粉等也會(huì)被提取出來(lái)，導(dǎo)致綠原酸提取率較低。

2.1.3 超聲功率對(duì)提取得率的影響

在溫度60 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取45 min 的條件下，考察超聲功率對(duì)提取得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲功率對(duì)提取得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound power on extraction yield of chlorogenic acid

從圖3 可以看出，綠原酸的含量與超聲功率呈正相關(guān)，隨著超聲功率的增大，綠原酸的含量逐漸增大，在功率較低的條件下，其增大不是很明顯，在240 W 時(shí)達(dá)到最大值。因此，選擇240 W 為最佳超聲提取功率。

2.1.4 提取溫度對(duì)提取得率的影響

在甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取功率180W，提取45min條件下，考察溫度對(duì)提取得率的影響，由于超聲清洗儀器在低于40 ℃溫度不穩(wěn)定，故只選擇4 個(gè)因素水平，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 提取溫度對(duì)提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of chlorogenic acid

從圖4 可以看出，綠原酸的提取得率與提取溫度呈負(fù)相關(guān)，隨著提取溫度的升高，綠原酸的提取得率逐漸降低，這是因?yàn)榫G原酸為熱敏性物質(zhì)，本身不穩(wěn)定，在高溫條件下，其分子結(jié)構(gòu)中的酯鍵、不因素飽和雙鍵等不穩(wěn)定部分發(fā)生斷裂，失去活性，從而降低得率[27]，所以適宜的提取溫度為40 ℃，而曾橋等[28]研究了杜仲葉茯磚茶中綠原酸最佳提取溫度為60 ℃，這是因?yàn)閮烧卟捎玫脑囼?yàn)原料不同，茯磚茶在加工過(guò)程中會(huì)經(jīng)過(guò)汽蒸渥堆、干燥等高溫處理過(guò)程，因此茯磚茶中綠原酸的最佳提取溫度會(huì)相對(duì)偏高。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化杜仲葉中綠原酸的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

選取提取時(shí)間（A）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲功率（C）對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。具體設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

為優(yōu)化超聲輔助提取杜仲葉中綠原酸的工藝條件，采用經(jīng)典的三因素三水平Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，精密稱取0.5 g 左右的杜仲葉粉末于比色管中，由于超聲清洗儀在低于40 ℃時(shí)溫度不穩(wěn)定，所以選取提取時(shí)間（A）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲功率（C）對(duì)杜仲葉中綠原酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。具體結(jié)果表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design

2.2.2 模型評(píng)價(jià)

利用Design-Expert 軟件對(duì)表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到的數(shù)學(xué)模型為：

Y=23.29+0.32A+0.34B+0.26C+0.17AB+0.22AC-0.078BC-0.013A2+0.037B2+0.76C2

模型方差分析結(jié)果和各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果列于表3。

表3 回歸模型各項(xiàng)方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

從表3 可以看出，模型的F=27.15、P=0.000 1＜0.05，說(shuō)明本試驗(yàn)所采用的二次模型是很顯著的。PA、PB、PC、PAB、PAC、PC2均小于 0.05，說(shuō)明提取時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、時(shí)間與甲醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用、時(shí)間與超聲功率的交互作用及超聲功率的二次項(xiàng)具有顯著影響，而甲醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率的交互作用、甲醇體積分?jǐn)?shù)的二次項(xiàng)和提取時(shí)間的二次項(xiàng)的顯著性較差，失擬項(xiàng)不顯著表明試驗(yàn)誤差小，決定因素R2=0.972 1，也說(shuō)明模型能夠很好地反應(yīng)響應(yīng)值的變化，擬合度好。同時(shí)，各因素的效應(yīng)關(guān)系為甲醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞超聲功率。

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面優(yōu)化綠原酸提取，得出3D 模型圖，見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，當(dāng)提取時(shí)間和超聲功率都固定時(shí)，綠原酸含量隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的變化幅度較大，而綠原酸含量隨著提取時(shí)間以及超聲功率的變化幅度較小，所以，甲醇體積分?jǐn)?shù)的影響較為顯著。通過(guò)最優(yōu)化分析，最佳的提取條件為提取時(shí)間75 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲功率270 W，提取溫度40 ℃，預(yù)測(cè)值為2.532%，在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，綠原酸的含量為2.529%，與預(yù)測(cè)值基本相符，證實(shí)了該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

圖5 各兩因素的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the pairwise interactive effects of three factors on extraction yield of chlorogenic acid

2.2.4 試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

在得出最佳提取條件的情況下，做3 次平行試驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖4 所示。

表4 最佳工藝條件及其驗(yàn)證響應(yīng)面Table 4 Results of validation experiments under optimized extraction conditions

經(jīng)過(guò)3 次平行試驗(yàn)，綠原酸實(shí)際含量為2.529%，與2.532%相比，相差0.003%，說(shuō)明此方程與實(shí)際情況擬合良好，建立的模型可靠。

3 結(jié)論與討論

與傳統(tǒng)的提取溶劑不同的是，本文采用一定體積分?jǐn)?shù)的甲醇作為提取溶劑，將甲醇與水結(jié)合作為提取劑，從提取效率和節(jié)約成本上來(lái)說(shuō)很有意義。通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助提取杜仲葉中的綠原酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳提取條件為：提取時(shí)間75 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲功率270 W，提取溫度40 ℃，在此條件下，綠原酸的含量達(dá)到2.529%，與預(yù)測(cè)值相符。

王柏強(qiáng)等[29]利用纖維素酶來(lái)提取杜仲葉綠原酸，考察酶解時(shí)間、溫度、pH 值等因素對(duì)杜仲葉綠原酸提取率的影響，正交試驗(yàn)優(yōu)選出最佳提取條件下綠原酸提取得率為2.37%。鄧愛(ài)華[30]通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉中綠原酸提取工藝，最佳提取參數(shù)為：40%的乙醇，料液比 1 ∶11（mg/mL），提取溫度61.4 ℃，提取率為 0.872 8%。魏銳[31]以水為提取劑提取杜仲葉綠原酸，響應(yīng)面工程數(shù)學(xué)法優(yōu)化提取工藝，在最佳提取工藝條件下，杜仲葉綠原酸提取得率為1.67%。與上述文獻(xiàn)相比，本研究杜仲葉綠原酸提取得率最高為2.529%，這當(dāng)然是假設(shè)以上研究的杜仲葉綠原量相同的情況下的比較結(jié)果；相較于其他3 種提取溶劑，一定體積分?jǐn)?shù)的甲醇更適合作為杜仲葉綠原酸的提取溶劑，這為杜仲葉綠原酸提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。