莫 嬋，覃曉霞，謝明秋，龐光福，黃鎖義

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院 科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心和廣西高校右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 百色 533000)

山風(fēng)(Blumeaaromatica(Wall.) DC.)是一種多年生草本植物，菊科艾香屬，學(xué)名為馥芳艾納香，別名香艾等[1]。山風(fēng)為廣西壯族的道地藥材，全草藥用，味辛、微苦，性溫，氣香，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛、通經(jīng)活絡(luò)的效用，民間主要用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)疹、濕疹、皮膚瘙癢、外傷出血等癥[1-3]。黃健軍等研究表明，山風(fēng)、山芝麻的正丁醇提取物與云南白藥牙膏在對抗二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹、局部創(chuàng)面出血時(shí)間方面作用相當(dāng)，具有良好的消腫止血作用[4]。山風(fēng)中含有黃酮、蒽醌、酚類等化合物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有一定的抗炎、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、保肝、抗骨質(zhì)疏松以及保護(hù)心腦血管等多種保健作用，對病毒、細(xì)菌都有較好的抑制活性[6-8]。目前，國內(nèi)有關(guān)壯藥山風(fēng)的化學(xué)研究鮮有報(bào)道[1,5,9-11]，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)壯藥山風(fēng)中總黃酮提取工藝的報(bào)道。為了更好的開發(fā)和利用山風(fēng)，本試驗(yàn)對廣西壯藥山風(fēng)中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取研究，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化山風(fēng)黃酮的提取工藝，為山風(fēng)的藥用及功能性食品開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

FA1204B型電子天平(上海天美天平儀器有限公司)、KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司)、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、N4S型紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)、TDL80-2B臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)、DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)、TH-UP-10實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)(山東滕海分析儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 材料

山風(fēng)，購于廣西百色市，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室周世友副教授鑒定為菊科艾香屬的藥材山風(fēng)(B.aromatica(Wall.) DC.) 全草；蘆丁對照品(上海金穗生物科技有限公司，批號: 20151022，含量≥98%)；95%乙醇、無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對照品溶液制備

精密稱取密封保存的干燥蘆丁對照品14.5 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液至50 mL定容制得質(zhì)量濃度0.29 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取蘆丁對照品溶液(0.29 mg·mL-1)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL具塞比色管中，加濃度30%乙醇至5 mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液4.00 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的試劑作為空白，在400～800 nm處進(jìn)行全波長掃描，確定最大吸收波長為511 nm，于波長511 nm處測吸光度(A)值,平行3次。分別以吸光度值、蘆丁濃度(mg·mL-1)為縱、橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y = 12.755X + 0.018 (mg·mL-1)，r = 0.9993，表明蘆丁在29.00～145.00 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

1.3.3 供試品溶液制備

取壯藥山風(fēng)于60℃恒溫干燥箱干燥，粉碎過60目篩，密封保存于陰涼干燥處待用。精密稱取山風(fēng)粉末3.000 g，分別置于圓底燒瓶中，用一定濃度的乙醇溶液超聲處理一定時(shí)間，放冷，混勻，過濾及濃縮后移入50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，搖勻，得供試品溶液。取適量供試品溶液離心，精確吸取離心上清液0.2 mL于試管中，然后依照1.3.2方法于511 nm波長測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。計(jì)算公式如下：

式(1)

式(1)中：Y=12.755X+0.018 (mg·mL-1)，A指提取液的吸光度值，V指稀釋倍數(shù)，W指提取所用的山風(fēng)的質(zhì)量(g)[12]。

1.3.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液4.00 mL，按2.3項(xiàng)方法制備供試液，準(zhǔn)確吸取供試液0.2 mL，置于10 mL具塞比色管中，按1.3.2項(xiàng)顯色，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液作空白，連續(xù)測定其吸光度6次，RSD = 0.09%(n = 6)，表明儀器精密度良好。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液4.00 mL，按1.3.2項(xiàng)顯色，分別在0，15，30，60，90，120 min測定其吸光度，RSD = 1.44%(n = 6)，結(jié)果表明，供試品溶液在2 h之內(nèi)較穩(wěn)定，滿足試驗(yàn)要求。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取6份山風(fēng)粉末，每份精確至3.000 g，按1.3.3項(xiàng)制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液，操作同1.3.2項(xiàng)，分別測定其吸光度值，RSD = 3.52%(n = 6)，表明該分析方法重復(fù)性良好。

1.3.7 優(yōu)化總黃酮提取條件的正交試驗(yàn)

按照1.3.3項(xiàng)提取山風(fēng)中的總黃酮，以總黃酮含量作為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)分別考察各因素對黃酮類化合物得率的影響，從中優(yōu)選出3個(gè)水平，設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)的正交試驗(yàn)，優(yōu)選壯藥山風(fēng)黃酮類化合物最佳提取工藝參數(shù)。單因素試驗(yàn)因素及水平見表1，L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2003軟件和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

表1 單因素試驗(yàn)考察的因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 影響山風(fēng)中總黃酮提取率的單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對山風(fēng)黃酮類化合物提取效果的影響

從圖1可以看出，提取溫度在40～70℃之間總黃酮提取率逐步上升，70℃時(shí)達(dá)峰值，其原因可能為溫度升高，分子運(yùn)動增強(qiáng)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致黃酮類化合物質(zhì)析出量增高；但隨溫度的增高，黃酮受到氧化[13]，使其化學(xué)結(jié)構(gòu)改變，再者乙醇揮發(fā)速度加快，溶解在乙醇中的黃酮類物質(zhì)較少，從而測得黃酮含量有所下降。故取60、70、80℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 乙醇濃度對山風(fēng)黃酮類化合物提取效果的影響

從圖2可以看出，隨著乙醇含量升高，山風(fēng)提取液中黃酮類化合物的含量呈先上升后下降的曲線變化。乙醇濃度為50%～60%之間時(shí)黃酮類化合物的含量上升緩慢，提高乙醇濃度可以提高乙醇對山風(fēng)的滲透性，從而提高黃酮提取率。乙醇濃度為60%～90%之間時(shí)黃酮類化合物含量急劇下降，在60%時(shí)產(chǎn)生峰值。結(jié)果表明，乙醇適宜濃度在60%左右，因?yàn)樯斤L(fēng)中含有的黃酮類化合物易溶于乙醇等有機(jī)溶劑難溶于水，所以當(dāng)乙醇濃度增加時(shí)溶解于乙醇的黃酮類物質(zhì)增加，乙醇和水達(dá)到一定比例時(shí)黃酮提取率最高。由于乙醇濃度過高時(shí)沸點(diǎn)下降、揮發(fā)嚴(yán)重，同時(shí)一些醇溶性物質(zhì)、色素、脂溶性強(qiáng)的物質(zhì)溶出量增加，競爭性抑制黃酮類物質(zhì)與乙醇結(jié)合，從而測得黃酮含量有所下降[14]。故選取乙醇濃度50%、60%、70%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 料液比對山風(fēng)黃酮類化合物提取效果的影響

由圖3可知，隨著料液比增大，黃酮類化合物析出量在1∶10～1∶40 g·mL-1之間上升，料液比為1∶40 g·mL-1時(shí)黃酮類物質(zhì)基本從組織細(xì)胞內(nèi)溶解在溶劑中，料液比1∶50 g·mL-1明顯比1∶40 g·mL-1析出黃酮類化合物少，出于試驗(yàn)成本和提取率的考慮，故選取1∶30、1∶40、1∶50 g·mL-1為較佳料液比參與正交試驗(yàn)。

2.1.4 提取時(shí)間對山風(fēng)黃酮類化合物提取效果的影響

圖4 提取時(shí)間對山風(fēng)黃酮類化合物提取效果的影響Fig. 4 Effects of time on flavonoids extraction from B. aromatica

從圖4可以看出，提取時(shí)間20～40 min時(shí)黃酮提取率緩慢上升，提取時(shí)間超過60 min黃酮提取率緩慢下降，40～60 min之間提取率差別極小，提取時(shí)間繼續(xù)增加對提取效果影響不大。這可能是因?yàn)辄S酮類化合物析出需要與乙醇接觸一定的時(shí)間，超過60 min后由于乙醇更易揮發(fā)，黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)容易改變，且超聲時(shí)間過長，有些粗提取物雜質(zhì)溶解于溶劑中、黃酮糖苷類的水解、黃酮類物質(zhì)被氧化等原因[15]，提取率下降。出于實(shí)驗(yàn)成本和提取率考慮，取20、40、60 min作為較佳提取時(shí)間參與正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化山風(fēng)總黃酮提取結(jié)果及分析

按照1.2.3的方法提取山風(fēng)中黃酮類化合物，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

注:F0.01(2，2) = 99，**表示P< 0.01差異極顯著；F0.05(2，2) = 19.0，*表示P< 0.05差異顯著。

從表3可知，R值與該因素的水平變化對試驗(yàn)結(jié)果的影響呈正相關(guān)關(guān)系。因此，4個(gè)考察因素對黃酮提取率的影響因素順序由大到小為提取溫度>料液比>提取時(shí)間>乙醇濃度，最佳組合為A3B2C2D1，即提取溫度為80℃、乙醇濃度為60%、料液比為1∶40 g·mL-1、提取時(shí)間為20 min為山風(fēng)中黃酮類化合物的最佳提取條件。表4提示，A、C因素對山風(fēng)總黃酮的提取有顯著影響意義，B、D兩因素?zé)o顯著影響意義。由F值的大小可知，方差分析結(jié)果和極差分析結(jié)果相同。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

因A3B2C2D1未包括在所設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中，故在正交試驗(yàn)所得的最佳提取工藝條件A3B2C2D1平行操作三次，測定吸光度并計(jì)算黃酮含量(表5)。

表5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

如結(jié)果所示，參照最佳工藝條件提取，提取物中的總黃酮含量均較高，所以該工藝條件合理，具有較好的穩(wěn)定性。

3 討論

近年來，超聲波技術(shù)應(yīng)用于提取各種天然活性物質(zhì)日益普遍，與傳統(tǒng)加熱回流提取方法相比較，具有省時(shí)、節(jié)能等優(yōu)勢[16]。超聲波輔助提取工藝即利用超聲波具有的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等，破壞植物細(xì)胞壁，增加細(xì)胞膜及細(xì)胞壁通透性，提高溶劑穿透力，優(yōu)化物質(zhì)中有效成分提取的工藝技術(shù)[17]。本試驗(yàn)通過采取超聲波輔助乙醇加熱回流提取壯藥山風(fēng)中的黃酮類化合物，提高了試驗(yàn)效率。黃酮類化合物成分定量方法有多種，主要有紫外分光光度法、比色法、高效液相色譜法等。本試驗(yàn)采用的紫外分光度法具有準(zhǔn)確性高、操作簡便、方法易掌握等特點(diǎn)，用于測定山風(fēng)提取液中總黃酮含量具有誤差小、效率高、可行性強(qiáng)等優(yōu)勢。

艾納香屬藥用植物具有重要的藥用價(jià)值，在民間均以水煎服用，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女功能性子宮出血、產(chǎn)后出血、產(chǎn)后祛風(fēng)除濕、殺菌止癢等癥有獨(dú)特療效[18]，在少數(shù)民族地區(qū)得到廣泛使用，可見其藥用價(jià)值不可忽視，極具開發(fā)利用潛力。菊科艾納香屬植物名稱上易混淆，其功效、主治各有不同，因此有效地鑒別顯得極其重要。宋志軍等人通過測定馥芳香艾納素的含量鑒定方法有助于鑒別壯藥山風(fēng)真?zhèn)蝃19]。本研究以壯藥山風(fēng)為原料，乙醇為提取溶劑，輔以超聲波回流提取，經(jīng)過單因素試驗(yàn)篩選出較佳提取因素水平，采用正交試驗(yàn)對壯藥山風(fēng)總黃酮的提取工藝優(yōu)化。結(jié)果表明：影響壯藥山風(fēng)總黃酮提取量的因素主次順序?yàn)椋禾崛囟?料液比>提取時(shí)間>乙醇濃度，最佳組合為A3B2C2D1，即最佳提取條件為提取溫度為80℃、乙醇濃度為60%、料液比為1∶40 g·mL-1、提取時(shí)間為20 min。在優(yōu)化的工藝條件下，進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，總黃酮的提取率平均為24.72 mg·g-1。本次試驗(yàn)為進(jìn)一步開發(fā)壯藥山風(fēng)的藥用及功能性食品利用價(jià)值提供理論參考。