楊豐碩，李黎明，楊青松，胡月鵬，呂秀敏，王桂蓮，陳茹，岳宏強，郭美榮

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052；2滄州市人民醫(yī)院

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，每年全球約有43萬新發(fā)病例，發(fā)病率占我國泌尿系腫瘤第一位，病死率較高[1]。膀胱癌包括移行細胞癌、鱗癌及腺癌等病理類型，其中膀胱移行細胞癌最為常見。目前膀胱癌的治療方式包括手術(shù)治療、放化療及免疫治療等，有助于延長患者的生存時間，但膀胱癌復(fù)發(fā)率較高，特別是高危非肌層浸潤性膀胱癌及肌層浸潤性膀胱癌易出現(xiàn)局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度>200個核苷酸的RNA調(diào)控因子，可通過與核酸、蛋白相互作用，影響細胞發(fā)育、分化、細胞周期調(diào)控及衰老等生物學(xué)過程[3]。近年來研究表明,LncRNAs在肺癌[4]、乳腺癌[5]等惡性腫瘤中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。LncRNA FEZF1-AS1位于人類染色體7q31.32，在胃癌等腫瘤中表達增高，通過抑制抑癌基因p21的表達，發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖和抑制凋亡的作用[6]。微小RNA(miR)是長度19～25個核苷酸的內(nèi)源非編碼RNA分子，與腫瘤、免疫、炎癥等病理生理過程有關(guān)[7]。有學(xué)者在肝癌中發(fā)現(xiàn)miR-610表達降低現(xiàn)象，miR-610能抑制肝源性生長因子的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，而在體外細胞實驗中過表達miR-610后，腫瘤細胞的增殖明顯受到抑制[8，9]。2017年1月～2019年1月，我們通過檢測膀胱癌組織中LncRNA FEZF1-AS1及miR-610的表達，分析兩者與臨床病理特征間的關(guān)系，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月～2019年1月于天津醫(yī)科大學(xué)總院就診并行手術(shù)治療的膀胱移行細胞癌患者79例。納入標準：①經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查明確診斷為尿路上皮癌；②初次診治，既往未接受過放化療及免疫治療等抗腫瘤治療；③患者或其家屬知情同意，且簽署知情同意書；④病歷資料齊全，均完成隨訪。排除標準：①合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；②嚴重肝腎功能不全；③合并免疫系統(tǒng)疾病者；④合并泌尿系統(tǒng)細菌性或結(jié)核性感染等疾病。79例膀胱癌患者中男48例、女31例，年齡28～76(43.1±6.7)歲。其中組織分化程度為高分化24例，中分化29例，低分化26例；參照國際抗癌聯(lián)盟2009年TNM分期系統(tǒng)進行腫瘤分期[10]，其中Ⅰ、Ⅱ期47例，Ⅲ、Ⅳ期32例；浸潤深度：肌層浸潤40例，非肌層浸潤39例；腫瘤數(shù)目：腫瘤單發(fā)50例，多發(fā)29例；腫瘤直徑≤3 cm 58例，直徑>3 cm 21例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。選取同期就診接受外科手術(shù)治療且術(shù)中經(jīng)膀胱鏡證實明確無膀胱腫瘤40例患者的正常膀胱黏膜組織作為對照，其中良性前列腺增生25例，膀胱結(jié)石15例。患者均知情同意。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 膀胱癌組織中LncRNA FEZF1-AS1及miR-610表達檢測方法 收集術(shù)中新鮮獲取的部分膀胱癌組織及正常膀胱黏膜組織，置于液氮中速凍，轉(zhuǎn)運至標本庫后，-80 ℃冰箱保存。各取約50 mg組織，超聲勻漿后，采用TRIzol法提取總RNA，溶于DEPC水。Narodrop測定RNA溶液的濃度及純度，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，條件：16 ℃ 30 min，40 ℃ 30 min，82 ℃ 5 min。LncRNA FEZF1-AS1正向引物：5′-TTAGGAGGCTTGTTCTGTGT-3′，反向引物：5′-GCGCAGGTACTTAAGAAAGA-3′，GAPDH為內(nèi)參，正向引物:5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCT-3′，逆向引物:5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。miR-610正向引物:5′-UGAGCUAAAUGUGUGCUGGGA-3′，反向引物:5′-CCAGCACACAUUUAGCUCAUU-3′，內(nèi)參基因U6正向引物:5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，反向引物:3′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-5′。qPCR總反應(yīng)體系20 μL，其中cDNA模板2 μL，TaqDNA聚合酶0.1 μL，正向和反向引物各1 μL、20×SYBR Green 1 μL及10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，無RNA酶水14.5 μL。反應(yīng)條件：96 ℃ 預(yù)變性5 min，96 ℃ 變性15 s，62 ℃ 退火60 s，70 ℃延伸10 s，變性退火延伸共40個循環(huán)。目的基因的表達量采用2-ΔCt法表示，目的基因LncRNA FEZF1-AS1或miR-610的表達水平相對于內(nèi)參基因GAPDH或U6的比值為 2-ΔCt，ΔCt = Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織與正常膀胱黏膜組織中LncRNA FEZF1-AS1與miR-610表達比較 膀胱癌組織與正常膀胱黏膜組織中LncRNA FEZF1-AS1相對表達量分別為4.17±0.83、1.35±0.39，miR-610相對表達量分別為0.45±0.16、1.32±0.35。膀胱癌組織LncRNA FEZF1-AS1相對表達量高于正常膀胱黏膜組織(t=20.349，P=0.000)，而miR-610相對表達量低于正常膀胱黏膜組織(t=28.020，P=0.000)。

2.2 膀胱癌組織中LncRNA FEZF1-AS1與miR-610表達與臨床病理特征的關(guān)系 膀胱癌組織中LncRNA FEZF1-AS1、miR-610表達均與腫瘤分期、組織分化程度有關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。腫瘤分期Ⅲ、Ⅳ期、低分化癌組織中LncRNA FEZF1-AS1表達分別高于腫瘤分期Ⅰ、Ⅱ期、高中分化癌組織(P均<0.05)。腫瘤分期Ⅲ、Ⅳ期、低分化癌組織中miR-610表達分別低于腫瘤分期Ⅰ、Ⅱ期、高中分化癌組織(P均<0.05)。

表1 癌組織中LncRNA FEZF1-AS1、miR-610表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 膀胱癌組織中LncRNA FEZF1-AS1與miR-610表達的關(guān)系 膀胱癌組織中LncRNA FEZF1-AS1與miR-610表達呈明顯負相關(guān)(r=-0.611，P=0.000)。

3 討論

目前膀胱癌的治療方式包括手術(shù)、化療及綜合治療等方式，但部分患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)、局部進展和遠處轉(zhuǎn)移，預(yù)后生存及生活質(zhì)量較差。膀胱癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的過程，與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)。影響膀胱癌復(fù)發(fā)和進展的因素包括腫瘤分期、腫瘤分級、復(fù)發(fā)頻率等，臨床上根據(jù)這些因素進行危險度分級，用于指導(dǎo)治療及預(yù)后，但這些指標均無法準確預(yù)測膀胱癌的生物學(xué)行為。因此有必要深入研究膀胱癌的分子機制，尋找新的腫瘤標志物。以往認為細胞內(nèi)大量的非編碼RNA是“分子垃圾”，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA雖缺乏編碼蛋白質(zhì)或肽的功能，但卻是調(diào)控細胞增殖、發(fā)育分化、凋亡及衰老的關(guān)鍵調(diào)控因子[11]。ncRNA包括miRNAs、LncRNAs、環(huán)狀RNA和內(nèi)含子RNA等，研究表明，他們均可通過調(diào)控細胞內(nèi)癌基因或抑癌基因的表達，影響細胞內(nèi)細胞信號通路的傳導(dǎo)，調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、浸潤及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[12]。

LncRNA FEZ家族鋅指結(jié)構(gòu)1-反義RNA 1(FEZF1-AS1)位于FEZF1基因的反義鏈上,長度為2 653 bp。FEZF1基因包含三個剪接變體(FEZF1-AS1-201、FEZF1-AS1-202、FEZF1-AS1-203)和7個外顯子。FEZF1第1個外顯子的mRNA有611個互補核苷酸序列，稱為FEZF1-AS1。據(jù)報道，LncRNA FEZF1-AS1在肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中存在表達失調(diào)的現(xiàn)象，其表達升高能促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程，與患者不良生存預(yù)后有關(guān)，有望成為臨床上新的腫瘤標志物[13]。本研究中膀胱癌組織中LncRNA FEZF1-AS1的相對表達量高于正常膀胱黏膜組織。目前具體機制尚不清楚，可能與腫瘤微環(huán)境中轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)表達升高有關(guān)，導(dǎo)致FEZF1-AS1基因表達增加，結(jié)果促進腫瘤細胞進展。研究表明，LncRNA FEZF1-AS1是TGF-β信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控分子，體外細胞實驗中敲除FEZF1-AS1基因表達后，TGF-β信號通路明顯受到抑制，腫瘤細胞的增殖能力明顯下降[14]。此外，膀胱癌癌組織中低分化、腫瘤分期Ⅲ、Ⅳ期癌組織LncRNA FEZF1-AS1表達升高。表明癌組織中LncRNA FEZF1-AS1表達可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其原因一方面是LncRNA FEZF1-AS1可結(jié)合并增加丙酮酸激酶2(PKM2)蛋白的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細胞核PKM2水平增加，PKM2表達上調(diào)進一步激活STAT3信號傳導(dǎo)，促進腫瘤細胞的惡性增殖，導(dǎo)致腫瘤分期升高[15]。另一方面，LncRNA FEZF1-AS1能激活Wnt信號通路，促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，E-鈣黏素表達降低，而Vimentin等間質(zhì)性標志表達升高，促進腫瘤細胞的惡性進展，導(dǎo)致腫瘤分級升高[16]。

miRNA在諸多腫瘤如肝癌、肺癌等惡性腫瘤中均存在異常表達上調(diào)或下調(diào)的現(xiàn)象，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷等有重要意義[17]。越來越多的證據(jù)表明，miR-610表達下調(diào)影響黑色素瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，miR-610具有腫瘤抑制因子作用，其可通過靶向抑制LRP6的表達調(diào)節(jié)黑素瘤的增殖及凋亡，可能是新的潛在治療靶標和預(yù)后標志物[18]。本研究中，膀胱癌癌組織中miR-610的相對表達量低于正常膀胱組織，表明癌組織中miR-610表達下調(diào)。其表達下調(diào)的機制可能是LncRNA ZEB1-AS1對miR-610表達調(diào)控作用有關(guān)。研究表明，LncRNA ZEB1-AS1能作為分子海綿抑制miR-610表達，從而發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[19]。本研究中，低分化、腫瘤分期Ⅲ、Ⅳ期癌組織miR-610表達明顯降低。表明癌組織中miR-610表達亦參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。其機制可能是miR-610作為抗腫瘤miRNA起作用，miR-610直接結(jié)合周期素D2(CCND2)和AKT3 mRNA的3′端非翻譯區(qū)，并在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制兩者的表達，腫瘤發(fā)生時miR-610表達下降，導(dǎo)致CCND2和AKT3表達增加，最終導(dǎo)致腫瘤的惡性進展，腫瘤分期分級增高[20]。

本研究進一步結(jié)果顯示，膀胱癌組織中LncRNA FEZF1-AS1與miR-610表達呈明顯負相關(guān)。目前相互調(diào)控的機制尚不清楚，可能是LncRNA FEZF1-AS1表達升高后，LncRNA FEZF1-AS1在腫瘤細胞中起到競爭性內(nèi)源RNA的作用，抑制miR-610的表達及其生物學(xué)功能，導(dǎo)致Akt3表達上調(diào)，促進腫瘤細胞的惡性增殖，即LncRNA FEZF1-AS1通過調(diào)節(jié)miR-610/Akt3軸促進腫瘤細胞增殖，提示LncRNA FEZF1-AS1可作為MM中癌癥治療的潛在靶標，但其二者具體作用機制有待進一步深入研究[21]。

綜上所述，膀胱癌癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1表達上調(diào)，而miR-610表達下調(diào)，兩者均與腫瘤分期、腫瘤分級有關(guān)，LncRNA FEZF1-AS1可能通過調(diào)控miR-610表達參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，有望成為膀胱癌診斷、治療及評估預(yù)后的新的腫瘤標志物。