敖莉絲 王偉 任董董 李慧靜 黃嘉琪 紀春艷

摘? 要：由可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）引致的潰瘍病是目前威脅南洋楹健康生產(chǎn)和品質(zhì)的重要病害?？焖?、準確檢測病原菌是進行病害有效防控的基礎(chǔ)。本研究用南洋楹潰瘍病菌翻譯延伸因子（EF 1-α）編碼基因上保守靶基因區(qū)域的序列設(shè)計特異性引物EF-AF/AR。利用EF 1-α編碼基因通用引物EF-688F/986R和特異性引物EF-AF/AR組合進行巢式PCR擴增，獲得264 bp的單一條帶，靈敏度檢測最低限度為1 fg/?L。利用建立的巢式PCR方法對林間疑似潰瘍病的病樣進行檢測，能夠特異性地檢測到L. theobromae。本研究建立的巢式PCR檢測方法準確、特異且靈敏性高，可為南洋楹潰瘍病的早期診斷和及時防控提供基礎(chǔ)的理論和實踐依據(jù)。

關(guān)鍵詞：南洋楹潰瘍病;可可毛色二孢;巢式PCR

中圖分類號：S432.4????? 文獻標識碼：A

Abstract： A rapid nested-PCR detection system for Falcataria moluccana stem canker disease was established. The outer pair of primers EF-688F/986R and the inner pair of primers EF-AF/AR were designed based on the EF 1-α gene sequences of Lasiodiplodia theobromae. The established specific nested-PCR could amplified a single product of 264 bp with annealing temperature of 63?℃， reaction cycles of 37. The lowest detectable concentration was 1 fg/?L. L. theobromae could be specifically detected by nested-PCR from the diseased plant samples. The establishment of rapid， sensitive nested-PCR detection system of L. theobromae might have significance in early diagnosis， and disease control of F. moluccana stem canker.

Keywords： Falcataria moluccana stem canker; Lasiodiplodia theobromae; nested-PCR

南洋楹（Falcataria moluccana）是世界著名的熱帶速生樹種，樹形美觀，木質(zhì)纖維豐富，韌性強，材質(zhì)輕，經(jīng)營周期短，是家具、造紙制漿等的優(yōu)良原料。此外，其用途十分廣泛，經(jīng)濟效益和景觀價值高。南洋楹原產(chǎn)地為馬來西亞馬六甲和印尼馬魯古群島，我國于1940年前后引種該樹種。目前，在廣東、廣西、海南和福建等地廣泛種植[1]。有關(guān)南洋楹病害的相關(guān)研究報道較少。Colletotrichum truncatum和C. capsiciaa能夠侵染南洋楹1年生的小樹，引起炭疽病[2]。由Urom?ycladium tepperianum引起的瘤銹病對馬來西亞、印尼等地的南洋楹健康生產(chǎn)造成威脅，病樹的枝葉形成眾多癭瘤，樹冠大量落葉落枝，植株生長受阻[3]。南洋楹叢枝病由類菌原體（MLO）引起，既為害幼樹，也為害老樹，病樹腋芽或側(cè)芽大量萌發(fā)，節(jié)間縮短，叢枝狀，發(fā)病后期，枝條干枯，植株死亡[4]。廣東已建成我國最大的南洋楹用材林基地，隨著廣東省內(nèi)南洋楹無性系的大面積推廣種植，南洋楹病害的發(fā)生有所增加。近年，由可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）引起的潰瘍病在廣東博羅等地的南洋楹種植區(qū)普遍發(fā)生，嚴重影響南洋楹的健康生產(chǎn)和品質(zhì)?？煽擅咧饕獮楹?～2年生的南洋楹幼樹，早期癥狀不明顯，有的葉黃;隨著病原菌侵染、擴展，病樹莖干呈現(xiàn)典型的黑褐色凹陷、潰瘍大病斑，病樹明顯生長不良，頂枯，嚴重時整株死亡[5]。

準確、快速的檢測病原菌是制定病害有效防控措施的重要基礎(chǔ)。南洋楹潰瘍病早期林間自然發(fā)病不易被發(fā)現(xiàn)，待其典型癥狀出現(xiàn)后，再采取防治措施往往為時已晚。采用常規(guī)組織分離、培養(yǎng)及病原菌形態(tài)鑒定的方法較費時，且對潰瘍病早期不顯癥病樣難以診斷。隨著潰瘍病為害的蔓延加重，南洋楹生產(chǎn)一線亟需快速的潰瘍病菌檢測體系的建立及應(yīng)用，但有關(guān)南洋楹病害的分子檢測尚未見相關(guān)報道。本研究基于真菌翻譯延伸因子（elongation factor 1-α， EF1-α）序列建立南洋楹潰瘍病菌的靈敏、特異的快速分子檢測體系，及時檢測南洋楹潰瘍病的發(fā)生及發(fā)展，為南洋楹的健康生產(chǎn)及病害防控提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)和材料。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試菌株：南洋楹潰瘍病菌可可毛色二孢菌株BL1331和HD1332，由華南農(nóng)業(yè)大學植物病理生理學研究室分離、純化并保存。

1.2? 方法

1.2.1? 供試菌株的致病力測定? 將保存在?80?℃冰箱里的南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331和HD1332接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar， PDA）上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。選取生長良好、樹干筆直的健康南洋楹1年生小樹（無性系T18）為接種植株。在植株主干距地面50 cm以上部位選取3個點作為接種點（2點之間相距不少于30?cm），無菌水清潔樹皮表面，用滅菌的打孔器在樹干上打取接種孔（d=9 mm），去掉表皮。從PDA上培養(yǎng)3 d的供試菌株菌落的邊緣打取菌餅（d=9?mm）貼在接種孔上（帶有菌絲的一面向內(nèi)），每個菌株接種4棵樹，每棵樹接種3個點，以接種無菌PDA培養(yǎng)基塊為對照，接種后用無菌濕潤棉外加保鮮膜包裹保濕。接種7?d后定期觀察記錄發(fā)病情況。

1.2.2? 真菌基因組DNA提取? 將供試菌株在PDA上培養(yǎng)2?d后，切取菌落邊緣菌絲塊轉(zhuǎn)接于PDB培養(yǎng)液中，28?℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3～5 d，真空抽濾收集菌絲體，置于研缽液氮研磨。采用OMEGA Fungal DNA Kit提取真菌菌絲DNA，?20?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 特異性引物設(shè)計? 利用通用引物EF- 688F/986R（EF-688F：5-CGGTCACTTGATCTAC- ?AAGTGC-3和EF-986R：5-TACTTGAAGG?AA?C- CCTTACC-3）對供試菌株BL1331進行擴增并測序，將測序結(jié)果與GenBank中其他相關(guān)真菌的EF 1-α基因序列進行比較分析，依據(jù)差異性位點設(shè)計特異性引物EF-AF/AR（EF-AF：5-GAG?AA?GTTC-GAGAAGGTCCGTGCAC-3和EF-AR：5- CGTTA-GCCATTGCTCGTACGACGAT-3），預(yù)期擴增片段的大小為264 bp。引物由華大基因有限公司合成。

1.2.4? 特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化? 以供試菌株BL1331基因組DNA為模板，將反應(yīng)溫度依次設(shè)為55、59、63、67和71?℃進行梯度實驗，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35個循環(huán)，以確定特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)的最佳退火溫度。

1.2.5? 特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化? 以供試菌株BL1331基因組DNA為模板，將反應(yīng)循環(huán)數(shù)依次設(shè)為22、27、32、37和42個循環(huán)數(shù)進行梯度實驗，退火溫度為63?℃，以確定特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)。

1.2.6? 巢式PCR反應(yīng)體系建立? 特異性引物EF-AF/AR與通用引物EF-688F/986R組成巢式引物。采用引物EF-688F/986R進行第1輪擴增。反應(yīng)體系為：DNA模板2?μL，10×PCR Buffer 5?μL，dNTPs混合液（2.5?mmol/L）4?μL，rTaq聚合酶（5?U/μL）0.25?μL，引物EF-688F/986R（10?μmol/L）各0.5 μL，滅菌超純水補足50 μL。反應(yīng)程序為94?℃預(yù)變性5 min，94?℃變性30 s，54?℃退火30?s，72?℃延伸2 min，共25個循環(huán)，72?℃延伸10 min。

采用特異性引物EF-AF/AR進行第2輪擴增。反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5?μL，dNTPs混合液（2.5?mmol/L）4 μL，rTaq聚合酶（5?U/μL）0.25?μL，引物EF-AF/AR（10?μmoL/L）各0.5 μL，滅菌超純水補足50 μL。反應(yīng)程序為94?℃預(yù)變性5 min，94?℃變性30 s，63?℃退火30 s，72?℃延伸18 s，共37個循環(huán)，72?℃延伸7 min。

1.2.7? 巢式PCR特異性檢測? 以供試菌株BL1331和HD1332為靶標菌，以南洋楹上常見真菌及林木上常見的病原真菌作為參考菌株：皺赤殼（Rugonectria rugulosa）、擬盤多毛孢（Pes?talotiopsis sp.）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）、小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）、七葉樹殼梭孢（Fusicoccum aesculi）、炭角菌（Xylaria sp.）、荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii）。以無菌水為空白對照。

1.2.8? 巢式PCR靈敏性檢測? 以供試菌株BL?1331的基因組DNA為模板，DNA模板經(jīng)濃度測定后稀釋，獲得質(zhì)量濃度梯度依次為1?ng/μL、100?pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL、10 ag/μL的模板，進行巢式PCR擴增，以無菌水為空白對照。

1.2.9? 林間疑似病樣的巢式PCR檢測? 隨機抽取5份林間采集的南洋楹潰瘍病疑似病樣，采用OMEGA E.Z.N.A.TM Plant DNA Kit提取植物組織DNA，以健康南洋楹植株樣本組織的DNA為陰性對照，以南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331和HD1332基因組的DNA為陽性對照，以無菌水為空白對照。

1.2.10? PCR產(chǎn)物序列分析? PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至華大基因有限公司測序，將測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 供試菌株的致病力測定

利用南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331和HD1332接種南洋楹進行致病力測定（圖1）。結(jié)果表明：2個菌株均具有較強的致病力，能夠引起健康的南洋楹發(fā)病，接種10 d后，接種孔附近褐變，接種40 d時，菌株BL1331和HD1332分別在接種處形成（5.0～5.5）×（1.5～2.1）?cm及（3.5～4.1）×（1.2～ 1.6）?cm的大病斑，病斑暗褐色、長橢圓形或不規(guī)則形。菌株BL1331的致病力稍強于菌株HD1332。病斑繼續(xù)擴展，顏色變深至黑褐色，70 d后，黑褐色大病斑明顯凹陷，有的病斑表面縱裂，呈現(xiàn)爛皮（圖1）。挑選病斑進行病組織的分離，純化獲得的病原菌經(jīng)鑒定與接種的病原菌一致。而對照處理無病斑擴展，接種孔處的傷口很快愈合。

A：對照;B：菌株BL1331接種70 d后發(fā)病癥狀;

C：菌株HD1332接種70 d后發(fā)病癥狀。

2.2? 特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化

以南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331的基因組DNA為模板，在退火溫度為55、59、63、67、71?℃條件下，均能獲得單一目標擴增條帶（264?bp）（圖2），但在退火溫度為63?℃條件下擴增條帶最亮，而在退火溫度為71?℃條件下擴增條帶暗淡。為獲得穩(wěn)定擴增，確定特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)最佳退火溫度為63?℃。

2.3? 特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化

以南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331的基因組DNA為模板，在反應(yīng)循環(huán)數(shù)為22、27、32、37和42的條件下進行優(yōu)化（圖3），在循環(huán)數(shù)為22～42的條件下均有單一目標擴增條帶（264 bp）產(chǎn)生，在循環(huán)數(shù)為37的條件下擴增條帶最為明亮，故確定特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)為37個循環(huán)。

2.4? 巢式PCR的特異性檢測

利用引物EF-688F/986R和特異性引物EF- AF/AR對靶標菌株及參考菌株進行巢式PCR檢測（圖4），僅有南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331和HD?1332（泳道1～2）擴增到單一目標條帶（264?bp），而其他參考真菌菌株樣本（泳道3～10）和空白對照（泳道11）均沒有目的片段。

2.5? 巢式PCR的靈敏性檢測

利用引物EF-688F/986R和特異性引物EF-AF/AR對可可毛色二孢菌供試菌株BL1331進行巢式PCR靈敏性檢測（圖5），可可毛色二孢菌DNA濃度為1 ng/μL～1 fg/μL時均可穩(wěn)定擴增出單一特異性條帶（264 bp），而在DNA濃度為100?ag/μL時無目標條帶產(chǎn)生，巢式PCR可檢測到1 fg/μL的可可毛色二孢基因組DNA。

2.6? 林間病樣的巢式PCR檢測

以林間隨機抽選疑似病樣的基因組DNA為模板進行巢式PCR檢測。結(jié)果表明（圖6），所有病樣均可擴增出單一目的條帶（泳道1～5：264?bp）。以菌株BL1331和HD1332基因組DNA為陽性對照的樣本也能夠擴增出單一明亮目的條帶（泳道6和7），而以南洋楹健康組織樣本DNA（泳道8）及水對照（泳道9）為陰性對照均未獲得擴增條帶，其說明該巢式PCR體系能夠有效對林間南洋楹潰瘍病菌進行檢測。

3? 討論

可可毛色二孢菌主要分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，寄主十分廣泛，為害木本植物可引起潰瘍、枝枯、壞死、果腐等，造成經(jīng)濟損失[6-7]。國內(nèi)外已報道的可可毛色二孢侵染引起的林木病害主要有：橡膠速衰病、回枯病[8-9]，杧果流膠病、頂枯病[10-11]，毛葡萄穗軸褐腐病[12]，黃山欒樹裂皮病[13]，腰果枝枯病[14]，肉桂枝枯病[15]等。近年來，本研究組經(jīng)過長期的病害調(diào)查表明，潰瘍病在廣東省博羅、惠州等地的南洋楹種植區(qū)普遍發(fā)生，危害嚴重，通過形態(tài)及分子鑒定其病原是可可毛色二孢[5]，并研究了在不同的培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH及光照等條件下對該病原菌菌絲生長的影響[16]。國內(nèi)外有關(guān)可可毛色二孢快速分子檢測的研究鮮有報道。Xu等[17]基于ITS序列，針對藍莓冠腐病的3種病原菌L. theobromae，Neofusicoccum parvum及Botryosphaeria dothidea分別設(shè)計引物Lt347-F/R，Np304-FIR及FaF/Bt2b，能夠特異性地區(qū)分3種藍莓冠腐病菌，其中針對L. theobromae的特異性引物Lt347-F/R的檢測靈敏限度是1?ng。高靈敏度是病原菌快速分子檢測的重要指標。巢式PCR技術(shù)由內(nèi)外2對引物先后對靶序列進行擴增，使其DNA拷貝數(shù)以指數(shù)增加，靈敏度顯著提高。陳杰等[18]依據(jù)核桃枝枯病菌小新殼梭孢（N. parvum）的幾丁質(zhì)合酶基因（CHS1）設(shè)計了特異性引物CT-WK3-S/CT-WK3- A和CT-N-S/CT-N-A，建立的巢式PCR對N. parvum的檢測靈敏度可達30 fg/μL，比常規(guī)PCR提高了10倍。王健生等[19]利用靶標序列CYP51C建立的巢式PCR可檢測到1?pg的大豆枯萎病菌尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）的基因組DNA。翻譯延伸因子（EF）在tRNA轉(zhuǎn)運核糖體中發(fā)揮作用，是編碼蛋白質(zhì)的單拷貝核基因，具有高度的保守性和較豐富的種間變異，也是研究系統(tǒng)發(fā)育的重要分子標記[20]。本研究利用EF 1-α編碼基因通用引物EF-688F/986R和特異性引物EF- AF/AR組合建立的巢式PCR靈敏性高，對南洋楹潰瘍病菌L. theobromae的檢測限度為1?fg/?L。研究結(jié)果也表明，如僅用特異性引物EF-AF/AR對南洋楹潰瘍病菌進行常規(guī)PCR擴增，檢測限度為10 pg/μL（未報道）。本研究建立的巢式PCR與常規(guī)PCR相比較，靈敏度提高了104倍。 Zhao等[21]報道從南洋楹、相思、桉樹、林生杧果及泡桐等病樣中經(jīng)過常規(guī)組織分離能夠獲得假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）菌株，假可可毛色二孢與可可毛色二孢的種間形態(tài)差異小，序列比對差異小[22]。本研究基于EF 1-α建立的巢式PCR具有高度特異性，僅靶標菌南洋楹潰瘍病菌可可毛色二孢獲得了單一目的條帶，而同屬不同種的假可可毛色二孢菌及其他參考真菌均無擴增條帶。本研究建立的南洋楹潰瘍病菌的巢式PCR檢測快速、準確和靈敏性高，對南洋楹病害的早期防控及監(jiān)測具有一定的實踐意義。

致? 謝? 廣西農(nóng)業(yè)科學院植保所莫賤友研究員和青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院梁晨教授提供部分菌株，特此致以衷心的感謝！

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