郭鶯 林志楷 汪文華 劉黎卿 何恩銘

摘? 要：以接種病原菌 Leifsonia xyli subsp. Xyli（Lxx）的‘拔地拉（‘Badila）甘蔗為研究材料，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究病原菌Lxx在蔗莖中的積累情況，采用半薄切片技術(shù)研究莖維管束的病變規(guī)律。結(jié)果表明，在接種Lxx的Badila中，Lxx菌量積累隨蔗莖由基層到尾層呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。半薄切片結(jié)果表明，接種Lxx蔗莖基部維管組織中的韌皮部和木質(zhì)部損壞嚴(yán)重，甘蔗莖節(jié)處相對(duì)莖間的基本細(xì)胞小得多，且具有木質(zhì)部異形、細(xì)胞大小不一、細(xì)胞整體較為密集。接種Lxx蔗莖維管組織中的韌皮部和木質(zhì)部損壞程度與Lxx菌量分布呈正相關(guān)。甘蔗莖節(jié)與莖間的組織結(jié)構(gòu)差異是Lxx菌量由基層到尾層呈現(xiàn)遞減的原因之一。本研究為進(jìn)一步研究Lxx與甘蔗寄主的互作提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甘蔗;甘蔗宿根矮化病;Lxx;實(shí)時(shí)定量PCR;半薄切片

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.661????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Sugarcane variety ‘Badila which infected with Leifsonia xyli subsp. xyli （Lxx） was used as the materials in this research. The accumulation of Lxx in sugarcane stems was studied by real-time qPCR. And the pathological changes of vascular bundle of stems were studied by the semi-thin section technique. The results showed that the accumulation of Lxx decreased from the base layer to the tail layer in ‘Badila. Severe damage to phloem and xylem in the vascular tissue of the base of sugarcane stems. The basal cells between the stem nodes were much smaller than those between the stems. The xylem was heteromorphism， the cell of xylem was different in size and arranged tightly. The damage of phloem and xylem in the vascular tissue of sugarcane stem infected with Lxx was positively correlated with the distribution of Lxx. It was speculated that the structure difference between the stem node and stem was one of the reasons why the quantity of Lxx decreased from the base layer to the tail layer. It would provide a theoretical basis for the further study of the interaction between bacterial of Lxx and sugarcane hosts.

Keywords： sugarcane; ratoon stuning disease; Leifsonia xyli subsp. xyli （Lxx）; real-time qPCR; semi-thin section

甘蔗宿根矮化?。╮atoon stuning disease， RSD）是世界甘蔗主要的病害之一，由1種寄居木質(zhì)部的棒狀桿菌屬細(xì)菌Leifsonia xyli subsp. Xyli（Lxx）引起，病原細(xì)菌大小為（0.25～0.50）?μm× （1.00～4.00）?μm[1]。Lxx難以分離培養(yǎng)，直到1980年，Davis等[2]才成功獲得純培養(yǎng)的細(xì)菌。甘蔗感染RSD后，主要表現(xiàn)為植株矮化、蔗莖變細(xì)、分蘗減少等癥狀，且隨宿根年限增加而加重。Ward[3]研究發(fā)現(xiàn)，Q138、Q122新植蔗比對(duì)照減產(chǎn)19%和22%，第1年宿根分別減產(chǎn)30%和40%。Grisham[4]研究發(fā)現(xiàn)，第1年新植蔗減產(chǎn)14%，到第3年減產(chǎn)27%。RSD主要通過(guò)收獲機(jī)械和帶病蔗種傳播[5]，雖然生產(chǎn)上用50?℃水處理2 h，對(duì)病菌有一定的抑制作用，但并不能完全去除[6-7]。由于感染病害的甘蔗外部和內(nèi)部均無(wú)明顯的病癥，單從外觀難以鑒定，雖然目前利用PCR技術(shù)對(duì)Lxx病原菌進(jìn)行檢測(cè)的方法非常成熟[6， 8-10]，但對(duì)操作人員以及設(shè)備要求較高，在應(yīng)用于生產(chǎn)和大批量檢測(cè)中存在很大困難，使得病害蔓延。本研究主要以感染RSD病菌后的‘Badila和健康的‘Badila甘蔗為研究材料，應(yīng)用定量PCR和組織切片技術(shù)，揭示RSD病原菌侵染后，菌量在蔗莖中的分布情況與莖維管束的病變規(guī)律，為進(jìn)一步研究Lxx與甘蔗寄主的互作關(guān)系提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

選擇RSD易感甘蔗品種‘Badila，利用Lxx-PCR檢測(cè)[8]蔗莖確認(rèn)不帶病后砍成雙芽段，進(jìn)行溫湯處理2 h。利用本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的Lxx菌液接種蔗莖剖面，28?℃培養(yǎng)6 h，于2017年2月種于福建省亞熱帶植物研究所，共種植50株，并于2017年12月對(duì)接種甘蔗進(jìn)行Lxx病原菌檢測(cè)。

1.2? 方法

1.2.1? 感病蔗莖中Lxx病原菌DNA提取? 按圖1所示取蔗莖不同部位，蔗莖在流水中沖洗5 min，去皮，將蔗莖切成約1 cm×1 cm×3 cm大小。用鉗子榨取蔗汁于2 mL離心管中并立即放入冰盒中，以減少蔗汁褐變，3000 r/min離心2 min，取上清，5000 r/min離心1?min后棄上清，用PBS緩沖液重懸浮。參照TIANamp Bacteria DNA Kit 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2? 熒光定量PCR對(duì)蔗莖中Lxx絕對(duì)定量? 參照Carvalho等[6]的方法進(jìn)行Lxx細(xì)胞數(shù)的定量。熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備：對(duì)Lxx菌基因組進(jìn)行稀釋?zhuān)扔贸⒘糠止夤舛扔?jì)測(cè)定Lxx基因組的質(zhì)量和濃度，稀釋到約10 ng/μL（每次稀釋后，初始濃度略有差異），作為L(zhǎng)xx基因組梯度稀釋母液，按10倍濃度梯度稀釋5個(gè)梯度。待測(cè)DNA樣品用超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度并做記錄，每個(gè)樣品取2 μL用于定量分析。熒光定量的引物見(jiàn)表1，PCR體系為：10 μL SYBR Premix ExTaq II（Tli RNaseH Plus）（2×），0.8 μL正向引物L(fēng)xx12950 F1，0.8 μL反向引物L(fēng)xx 12950 R1，0.4 μL ROX Reference Dye II（50×），2 μL DNA模板，ddH2O 6 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95?℃預(yù)變性30 s，95?℃變性10 s，60?℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。將樣品在ABI 7500上擴(kuò)增，每個(gè)樣品技術(shù)重復(fù)3次，以無(wú)菌水為模板的體系作對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出每個(gè)樣品的Quantity Mean，DM=Quantity Mean/Concentration of Leaf Genome （ng/μL），2.63×10?6 ng為每個(gè)Lxx細(xì)胞中基因組質(zhì)量（來(lái)自Lxx CTCB07，GenBank：AE0168?22.1），根據(jù)公式NC=DM/2.63×10?6來(lái)評(píng)估Lxx細(xì)胞個(gè)數(shù)，NC，即為甘蔗葉片中Lxx滴度。獲得的病原菌含量數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

1.2.3? 樹(shù)脂半薄切片的制作? 對(duì)PCR檢測(cè)成陽(yáng)性的樣品取樣，取蔗莖芽部、近帶蔗皮處、莖中央、莖節(jié)、莖間中央各部位組織，具體如圖2所示。

1：基層莖節(jié)處;2：基層莖節(jié)間;3：中層莖節(jié)處;

4：中層莖節(jié)間;5：尾部莖節(jié)處;6：尾部莖節(jié)間。

1： Basal stem node ; 2： Basal stem Internode; 3： Middle stem node; 4： Middle stem Internode; 5： Tail stem node; 6： Tail stem Internode.

（1）前固定：將不同組織部位材料，用刀片切成截面1?mm×1?mm，長(zhǎng)3?mm大小，置于0.2?mL離心管中，做好標(biāo)記，加入已配置好的2.5% 戊二醛溶液，抽真空趕走氣泡，使固定液和組織充分接觸，置于4?℃，3 h。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Lxx病原菌在蔗莖中的分布情況

感染RSD的‘Badila蔗株莖部由基層到尾層，Lxx菌量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，甘蔗基部莖節(jié)處Lxx含菌量最高，基部莖間相對(duì)莖節(jié)Lxx菌含

量下降了44.89%，中間莖間相對(duì)莖節(jié)含量下降了49.26%，而頂端莖間相對(duì)莖節(jié)下降18.46%，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各部位的菌量差異未達(dá)到顯著水平。

圖3? 感染RSD甘蔗蔗莖中Lxx病原菌含量

Fig. 3? Content of Lxx in sugarcane stems infected

with RSD

2.2? 感染Lxx病原菌對(duì)蔗莖局部結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)健康蔗株和RSD蔗株根帶芽處進(jìn)行橫向切片發(fā)現(xiàn)（圖4），RSD芽軸、芽原基染色較深（圖4A1，圖4a1）。通過(guò)對(duì)莖部根帶、莖間的維管組織切片發(fā)現(xiàn)，健康蔗株維管組織結(jié)構(gòu)相較于RSD蔗株完好，主要差異體現(xiàn)在韌皮部和近導(dǎo)管處（圖4A2，圖4a2），此外莖節(jié)處的異形木質(zhì)部?jī)?nèi)染色較重，存在不明內(nèi)容物（圖4a2）。對(duì)莖基部、中部、頂部3層維管組織進(jìn)行的切片鏡檢結(jié)果顯示，RSD蔗株基部和中部的維管組織結(jié)構(gòu)破損嚴(yán)重，中間的原形成層細(xì)胞散裂明顯（圖4a3，圖4a4），頂端蔗莖維管組織結(jié)構(gòu)完好清晰（圖4a3，圖4a4，圖4a5），健康蔗株與RSD蔗株一樣，基部維管組織染色較深，但基部、中部、頂部維管組織，結(jié)構(gòu)完好，差異不大（圖4A3，圖4A4，圖4A5）。

從莖節(jié)和莖間的局部縱切面的維管組織切片發(fā)現(xiàn)（圖5），無(wú)論是健康的還是感病的甘蔗莖節(jié)的基本細(xì)胞相較于莖間的小得多，且具有木質(zhì)部異形、細(xì)胞大小不一、細(xì)胞整體較為密集的情況，推測(cè)莖節(jié)的組織結(jié)構(gòu)在一定程度上阻礙了病原菌的向上運(yùn)輸。

A1～5為健康蔗株莖部局部結(jié)構(gòu)，a1～5為RSD蔗株莖部局部結(jié)構(gòu)。A1、a1為莖節(jié)芽部，A2、a2為莖節(jié)處維管組織，A3～5、

a3～5 分別為健康/RSD 蔗株基部（3）、中部（4）、頂部（5）維管組織。Xy：木質(zhì)部;Ph：韌皮部;Bp：芽原基;Ste：芽軸。

A1-5 is a local structure of the stem of healthy sugarcane， and a1-5 is a part of the stem of the sugarcane infected RSD. A1， a1 are stem node bud. A2， a2 are vascular tissue at stem node. A3-5， a3-5 are healthy/RSD infected sugarcane base （3）， middle （4）， apical （5）. Xy： xylem; Ph： phloem; Bp： bud primordium; Ste： protocambium.

3? 討論

甘蔗莖為實(shí)心，可分為表皮、皮層、基本組織、維管束4個(gè)部分。表皮外被有明顯的角質(zhì)層，下皮層以內(nèi)是不同程度加厚的皮層細(xì)胞，維管束貫穿于基本組織中，分散于整個(gè)切面內(nèi)，靠邊緣的維管束和靠中央的維管束在鞘細(xì)胞的排列方式上是不同的?？窟吘壍木S管束導(dǎo)管口徑較小，但維管束鞘較發(fā)達(dá)，向心加厚;靠中央的維管束導(dǎo)管口徑較大，維管束鞘不如邊緣維管束明顯，成典型帽狀分布，即在韌皮部和木質(zhì)部均有厚壁細(xì)胞。基本組織由薄壁細(xì)胞組成，分布于皮層內(nèi)部維管束之間，維管束相互連接構(gòu)成維管系統(tǒng)，主要作用是為植物體輸導(dǎo)水分、無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)養(yǎng)料等，也有支持植物體的作用。胡敏[11]通過(guò)原位PCR方法對(duì)感染RSD的甘蔗Lxx的定位分析發(fā)現(xiàn)，在蔗莖維管組織中，Lxx主要分布在維管組織的木質(zhì)部導(dǎo)管、韌皮部處，尤其是木質(zhì)部與韌皮部之間的原形成層處。本研究RSD蔗株莖樣品半薄切片呈現(xiàn)出木質(zhì)部、韌皮部細(xì)胞形狀異形且細(xì)胞散裂，原形成層細(xì)胞也存在散裂明的現(xiàn)象。此外莖節(jié)處的異形木質(zhì)部?jī)?nèi)染色較重，存在不明內(nèi)容物，這與Giliaspie等[12]和陳明輝等[13]研究結(jié)果一致，推測(cè)是Lxx菌表面的病原相關(guān)分子如多糖或鞭毛蛋白等刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生非特異防御或者是植物R蛋白識(shí)別病原微生物后所產(chǎn)生特異性防御所產(chǎn)生的分泌物質(zhì)。其不明內(nèi)容物影響了篩分子對(duì)糖（蔗糖為主）、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、酰氨、維生素、無(wú)機(jī)鹽和植物激素的運(yùn)輸，從而導(dǎo)致染病的蔗株變矮，蔗莖變細(xì)，生長(zhǎng)遲滯。

過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)，Lxx侵染甘蔗后主要集中在其甘蔗莖基部2～3節(jié)間處[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Lxx菌量隨蔗莖生長(zhǎng)從下往上逐層減少，這與對(duì)莖基部、中部、頂部3層維管組織進(jìn)行的切片鏡檢結(jié)果中維管組織的完整性存在一定的關(guān)聯(lián)性，感染RSD蔗株基部維管組織結(jié)構(gòu)破損嚴(yán)重，頂端蔗莖維管組織結(jié)構(gòu)完好清晰。橫向切片的結(jié)果表明，甘蔗莖節(jié)的基本細(xì)胞相較于莖間的小得多，且具有木質(zhì)部異形、細(xì)胞大小不一、細(xì)胞整體較為密集的情況。根據(jù)q-PCR對(duì)RSD蔗株莖部病原菌Lxx的富集量分析發(fā)現(xiàn)，莖間蔗汁中Lxx的菌量少于莖節(jié)處，推測(cè)莖節(jié)與莖間的結(jié)構(gòu)差異可能是Lxx定植差異導(dǎo)致的，其體現(xiàn)病原菌與寄主互作過(guò)程中，病原菌Lxx對(duì)定植微生態(tài)的自主選擇。

RSD的主要傳播途徑是收獲機(jī)械、刀具以及帶病的蔗種[15]，Comstock等[5]研究證明，RSD按照甘蔗收獲順序傳播，而帶病蔗莖做為蔗種，引發(fā)了下一輪收獲傳播。在本研究中對(duì)健康蔗株和RSD蔗株莖節(jié)芽處進(jìn)行橫向切片發(fā)現(xiàn)，RSD芽軸、芽原基相對(duì)周?chē)渌M織染色較深，q-PCR結(jié)果也表明，莖節(jié)處Lxx含量較高，而芽軸是未發(fā)育的莖，RSD之所以會(huì)造成蔗區(qū)大量減產(chǎn)，很大程度上是由于甘蔗是腋芽進(jìn)行無(wú)性繁殖的作物。

4? 結(jié)論

感染RSD的蔗莖維管組織中的韌皮部和木質(zhì)部的損壞程度與Lxx菌量分布呈正相關(guān)。甘蔗莖節(jié)與莖間的組織結(jié)構(gòu)差異是Lxx菌量由基層到尾層呈現(xiàn)遞減的原因之一，以上結(jié)果為今后進(jìn)一步研究Lxx與甘蔗寄主的互作提供了一定的理論依據(jù)。

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