郭立佳 汪軍 楊臘英 梁昌聰 周游 劉磊 黃俊生

摘? 要：解淀粉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌等是重要的有益微生物，被廣泛應(yīng)用于植物病蟲的生物防治。前期分離獲得1株芽胞桿菌JK05，對(duì)其形態(tài)、生理生化特征、16S rRNA和gyrA基因序列進(jìn)行分析，將其鑒定為解淀粉芽胞桿菌植生亞種Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum。對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JK05菌株對(duì)多種植物病原鐮刀菌具有拮抗作用。植物生長促進(jìn)實(shí)驗(yàn)表明，JK05菌株對(duì)香蕉和玉米生長具有明顯促進(jìn)作用。盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JK05菌株對(duì)香蕉枯萎病具有良好的防治效果。采用特異引物對(duì)JK05菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其可擴(kuò)增到表面活性素（surfactin）、豐原素（fengycin）、伊枯草菌素A（iturin A）等抗生素合成基因。綜上，JK05菌株具有良好的生防潛力，有望應(yīng)用于生物農(nóng)藥和微生物肥料。

關(guān)鍵詞：芽胞桿菌;拮抗;鐮刀菌;促生長

中圖分類號(hào)：S432.4????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Bacillus strains， including Bacillus amyloliquefaciens， B. subtilis and B. thuringiensis， are important beneficial microbes， which have been applied for the biocontrol of plant diseases and pests. We isolated a Bacillus strain named JK05 previously， and it was identified as Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum based on its morphological characterization， physiological， and biochemical properties as well as 16S rRNA and gyrA gene seqences analysis. The confrontation assay showed that JK05 had antifungal activities against a number of fungal phytopathogens. Plant growth promotion assay revealed that JK05 played roles in promoting plant growth of maize （Zea mays L.） and banana （Musa spp.）. The pot assay demonstrated that JK05 possessed a prominent effect on the control of Fusarium wilt of banana caused by F. oxysporum f. sp. cubense. The PCR assay performed using the specific primers for genes related to the antibiotic biosynthesis revealed that the genome of JK05 contained the genes responsible for the synthesis of surfactin， fengycin and iturin A. The results suggested that JK05 had an excellent biocontrol potential， which could be applied as biopesticides and biofertilizers.

Keywords： Bacillus; antagonism; Fusarium; plant growth promotion

芽胞桿菌（Bacillus spp.）普遍存在于自然環(huán)境中，大部分芽胞是非致病的，相反許多芽胞桿菌對(duì)人類是有益的，可產(chǎn)生應(yīng)用于不同領(lǐng)域的酶。解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）是核糖核酸酶的來源，且產(chǎn)生的淀粉酶用于水解淀粉?？莶菅堪麠U菌（B. subtilis）產(chǎn)生的蛋白酶subtilisin用于制備洗滌劑，產(chǎn)生的限制性內(nèi)切酶BamH I用于DNA研究。另外，許多芽胞桿菌可產(chǎn)生抗生素、生長素（吲哚乙酸）、赤霉素等次生代謝物，其抗生素在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值[1-5]。但少數(shù)芽胞桿菌具有寄生致病性，常見寄生致病類的芽胞為：引起人類和動(dòng)物炭疽病的炭疽桿菌（B. anthraci）、引起食物中毒的蠟樣芽胞桿菌（B. cereus）、引起昆蟲中毒的蘇云金芽胞桿菌（B. thuringiensis）以及引起植物細(xì)菌病害的禾草巨大芽胞桿菌（B. megaterium pv. cerealis）[6]和短小芽胞桿菌（B. pumilus）[7] 等。此外，許多枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌菌株具有抑制植物病原真菌生長，促進(jìn)作物生長、誘導(dǎo)植物抗性等功能，被應(yīng)用于生產(chǎn)生物肥料和生物農(nóng)藥[1-2]。應(yīng)用其有益微生物被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)作物合理、安全治理最有前景的措施之一。

由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）引起的香蕉枯萎病是重要土傳維管束病害。為探索香蕉枯萎病有效防治措施，國內(nèi)外許多學(xué)者開展生防菌篩選和評(píng)價(jià)相關(guān)的研究。張妙宜等[8]從黃豆醬中分離篩選得到香蕉枯萎病菌拮抗細(xì)菌，其中1株為解淀粉芽胞桿菌，其粗蛋白和乙醇提取物具有穩(wěn)定的抑菌活性。陳川雁等[9]發(fā)現(xiàn)，接種低濃度的枯草芽胞桿菌R31能激發(fā)香蕉根系免疫反應(yīng)和活性氧產(chǎn)生，并延長R31在根表定殖，最終影響其對(duì)枯萎病的防效。王國芬等[10]對(duì)收集的生防菌資源進(jìn)行抗性篩選，篩選到的3株拮抗芽胞桿菌分別施用于土壤中，其均可降低香蕉枯萎病菌數(shù)量。盆栽實(shí)驗(yàn)顯示，其中A5-6菌株的防治效果可達(dá)72.3%。張琳等[11]發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌TR21可濕性粉劑能降低粉雜1號(hào)發(fā)病率，而在葉腋上增加接種該菌的栓劑（劑型）處理可顯著增加單株產(chǎn)量，并顯著縮短粉雜1號(hào)生育期。石妞妞等[12]研究枯草芽胞桿菌T122F菌株在香蕉中的內(nèi)生定殖及其對(duì)香蕉枯萎病的生防效果，盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其防治效果達(dá)66.0%。Yuan等[13]發(fā)現(xiàn)，施用含有解淀粉芽胞桿菌NJN-6的生物菌肥可抑制香蕉枯萎病，并促進(jìn)香蕉的生長。類似地，Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，施用枯草芽胞桿菌N11的生物菌肥可有效控制香蕉枯萎病的發(fā)生。Wang等[15]從健康香蕉根際分離獲得一些枯萎病菌拮抗菌，其中包括解淀粉芽胞桿菌W19，將其與有機(jī)肥混合施用可顯著降低香蕉枯萎病的發(fā)生，并促進(jìn)香蕉的生長。同時(shí)W19可產(chǎn)生3種脂肽物質(zhì)包括伊枯草菌素（iturin A）、桿菌霉素bacillomycin D和表面活性素surfactin，以及18種揮發(fā)性的真菌拮抗物質(zhì)?？梢姡瑖鴥?nèi)外學(xué)者對(duì)香蕉枯萎病的生物防治開展了大量研究，然而對(duì)分離菌株的拮抗和促生長的機(jī)理研究相對(duì)比較薄弱。本研究作者所在的研究室對(duì)芽胞桿菌進(jìn)行了大量分離篩選，獲得一些對(duì)多種病原鐮刀菌具有拮抗作用的芽胞桿菌菌株。其中1株芽胞桿菌生長繁殖迅速，對(duì)香蕉枯萎病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，并分析生防應(yīng)用潛能以及拮抗和促生長的機(jī)理，以期用于枯萎病的防治和生產(chǎn)生物肥料。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? JK05是從香蕉根際土壤中分離純化獲得的細(xì)菌菌株。供試10株真菌菌株（FG01-FG10）為本課題組保存的菌株。供試香蕉品種為巴西蕉（Musa spp. AAB cv. Brazil），玉米品種為京香糯2000（Zea mays L. cv. Jingxian?g?nuo 2000）。盆栽基質(zhì)為椰糠與營養(yǎng)土混合物（體積比7∶3）。

1.1.2? 培養(yǎng)基? 供試細(xì)菌菌株JK05所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。供試真菌的培養(yǎng)與拮抗譜測(cè)定采用PDA培養(yǎng)基。IAA檢測(cè)培養(yǎng)基（胰蛋白胨17?g/L、植物蛋白胨3?g/L、氯化鈉5?g/L、磷酸氫二鉀2.5 g/L、葡萄糖2.5?g/L、色氨酸 100 mg/L，最終pH （7.3±0.2）。

1.2? 方法

1.2.1? 細(xì)菌基因組DNA提取? 將細(xì)菌JK05接種于裝有LB培養(yǎng)液的三角瓶中，置于搖床中于37?℃、150?r/min條件下過夜培養(yǎng)，取1?mL培養(yǎng)物，10?000?r/min離心收集菌體，采用上海生工生物工程有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518225）所提供的方法提取細(xì)菌基因組DNA。

1.2.2? 細(xì)菌菌株JK05的鑒定? 用接種環(huán)取少量菌液劃線培養(yǎng)于LB平板上，37?℃過夜培養(yǎng)后，觀察菌落形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色，芽胞染色，在1000×顯微鏡下觀察細(xì)菌細(xì)胞和芽胞形態(tài)。V-P實(shí)驗(yàn)、甲基紅（MR）實(shí)驗(yàn)、明膠和淀粉水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、生長溫度、pH、耐鹽、溶菌酶抗性以及碳氮源利用等實(shí)驗(yàn)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]所列的相應(yīng)方法進(jìn)行。16S rRNA的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增是采用通用擴(kuò)增引物（27F： 5-AGAGTTT?GA?TC?CT?GGCTCAG-3和1492R： 5-TGACTGAC?TG?A?G?G?YTACCTTGTTACGACTT-3），以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增程序和反應(yīng)體系按照Amann等[18]的方法進(jìn)行，預(yù)計(jì)擴(kuò)增約1500 bp的DNA片斷。gyrA基因的擴(kuò)增采用Chun等[19]報(bào)道的引物（p-gyrA-f： 5-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCT T-3和p-gyrA-r：5-CAAGGTA?A?T?G-CTCCAGGC ATTGCT-3），反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件與擴(kuò)增16S rRNA相同，預(yù)計(jì)擴(kuò)增1025 bp的DNA片斷。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與9株其他模式菌株的16S rRNA和gyrA基因序列利用MEGA 5.2軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用鄰接法（自展1000次）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3? JK05菌株拮抗植物病原鐮刀菌的測(cè)定?? 將11種病原鐮刀菌（表1）分別在PDA平板上培養(yǎng)5?d，沿菌落邊緣打菌餅（直徑約7?mm），各取1塊接種于PDA平板上，距離平板中心2?cm左右，將細(xì)菌菌株JK05劃線（長約4?cm）接種于鐮刀菌菌餅的另一側(cè)，使兩者之間的距離大約為3?cm。對(duì)照用無菌水代替菌液劃線，每個(gè)鐮刀菌菌株重復(fù)3次。PDA平板于28?℃培養(yǎng)5 d后，測(cè)量鐮刀菌菌落半徑。抑制率的測(cè)定采用公式：

抑制率=（對(duì)照菌落半徑?拮抗菌落半徑）/對(duì)照菌落半徑×100%。

1.2.4? JK05發(fā)酵濾液對(duì)病原鐮刀菌的測(cè)定? JK05菌株采用28?℃、150?r/min振蕩培養(yǎng)48?h后，10?000 r/min離心5?min收集上清液，并用濾器（孔徑0.22??m）過濾制備成無菌濾液。測(cè)定方法，在距離菌餅邊緣約3?cm處放置大小約4?cm×0.5?cm的滅菌濾紙片并分別加100??L無菌濾液代替菌液劃線，無菌水為對(duì)照，每個(gè)菌株重復(fù)3次。28?℃培養(yǎng)5?d，然后測(cè)量菌落半徑，計(jì)算抑制率。

1.2.5? 盆栽實(shí)驗(yàn)測(cè)定JK05菌株對(duì)香蕉枯萎病的防控效果? JK05菌株在LB培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)48?h后，稀釋10倍，取20?mL稀釋液澆灌于香蕉幼苗（株高約10?cm）的根際，對(duì)照用稀釋相同倍數(shù)的LB培養(yǎng)液替代。每組共處理20株，共重復(fù)3次。在施用JK05菌株2 d后，接種香蕉枯萎病菌，方法是取20?mL病原菌孢子懸浮液（約107個(gè)孢子/mL）接種于上述香蕉幼苗根際。病原菌接種處理30 d后，縱向剝開球莖和假莖基部，根據(jù)球莖褐化程度和植株萎蔫程度，劃分病級(jí)，并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。病級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)和病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)參照文獻(xiàn)[20]。防治效果計(jì)算依據(jù)如下公式：

防治效果=（對(duì)照植株病情指數(shù)JK05處理植株病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.2.6? JK05對(duì)香蕉和玉米生長的影響? 細(xì)菌JK05接種于LB液體培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液用無菌水稀釋10倍，配制成稀釋液（2×108 CFU/mL）。取健康香蕉幼苗（株高約10?cm），每株澆灌稀釋液20?mL，對(duì)照用稀釋相同倍數(shù)的LB培養(yǎng)液。每個(gè)處理澆灌15株，重復(fù)3次。處理40 d后，測(cè)量株高，假莖直徑、葉面積（最靠心葉的葉片）和地上部分鮮重。玉米種子播種于裝有椰糠基質(zhì)的花盆中，待種子萌發(fā)長出嫩芽時(shí)，采用同樣方法每株澆灌稀釋液20 mL，每個(gè)處理15株，對(duì)照用稀釋相同倍數(shù)的LB培養(yǎng)液，重復(fù)3次。處理30 d后測(cè)量玉米株高、莖粗和地上部分鮮重。

1.2.7? 生長素IAA的測(cè)定? JK05菌株振蕩培養(yǎng)48 h后，10?000 r/min 離心10?min，取1?mL上清液加入2 mL Salkowsky試劑（35%高氯酸、1?mL三氯化鐵溶液）[21]并混勻，于28?℃靜置30?min 后，在530 nm條件下進(jìn)行比色，用10～100??g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)IAA稀釋液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，單位為?g/mL。取未接菌的培養(yǎng)液作為對(duì)照。

1.2.8? 解磷效果測(cè)定? 采用NBRIP培養(yǎng)液（葡萄糖10?g，磷酸三鈣5?g，氯化鎂5 g，硫酸鎂0.25?g，氯化鉀0.2 g，硫酸銨0.1 g，蒸餾水1000?mL，pH 7.0）培養(yǎng)JK05菌株。取100?μL過夜培養(yǎng)的JK05菌液8?000?r/min離心5?min，去上清，菌體沉淀用等體積的無菌水重懸，接種于20?mL的NBRIP培養(yǎng)液中，于28?℃、160?r/min震蕩培養(yǎng)3?d。未接種菌的NBRIP作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用鉬銻抗比色法測(cè)定培養(yǎng)液中可溶性磷含量[22]。

1.2.9? 抗生素合成基因的PCR擴(kuò)增? 采用Khabbaz等[23]研究中9對(duì)抗生素合成編碼基因特異擴(kuò)增引物，分別為：擴(kuò)增2，4?二乙酰藤黃酚[2，4-diacetyl phloroglucinol （DAPG）， phlD]、吩嗪（phenazine， phzFA）、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin， prnD）、藤黃綠菌素（pyoluteorin， pltC）、豐原素（fengycin， fenD）、芽胞菌霉素（bacillomycin D， bmyB）、桿菌溶素（bacilysin， bacA）、伊枯草菌素A（iturin A， ituD）、表面活性素（surfactin， srfAA）等抗生素合成基因DNA片斷，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為629、1408、789、438、269、370、498、647、201 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后寄送至生工生物工程上海股份有限公司測(cè)序，所測(cè)序列用NCBI數(shù)據(jù)的BLASTn進(jìn)行比對(duì)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。所有數(shù)據(jù)利用Origin pro 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），對(duì)處理之間差異性多重比較采用LSD（least significant difference）分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? JK05菌株形態(tài)特征

JK05菌株在LB平板培養(yǎng)基上生長良好，37?℃靜置培養(yǎng)16 h，可形成近圓形或不規(guī)則形狀菌落，菌落乳白色不透明、表面干燥，邊緣凸起，不產(chǎn)色素（圖1A）。菌體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，呈長桿狀，大小約為0.8??m×3.0??m。革蘭氏染色陽性，芽胞呈卵圓形（圖1B）。

2.2? 生理生化特征

JK05菌好氧，可水解淀粉，液化明膠。接觸酶陽性，V-P反應(yīng)陽性，甲基紅（MR）染色結(jié)果為陰性。硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)和檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性。可水解酪素，不可分解酪氨酸。在含7%和10% NaCl的LB培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)過夜可以生長，在20～45?℃溫度下可生長，pH 5.0～8.0可生長，可在0.001%溶菌酶中生長。另外，JK05菌可利用葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、肌醇、甘露醇等為唯一碳源，不能利用麥芽糖、木糖、甘露糖、山梨醇等作為唯一碳源，可利用甘氨酸、半胱氨酸、色氨酸、纈氨酸等可為唯一氮源。

2.3? 16?S rRNA和gyrA基因聚類分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，所擴(kuò)增的16S rRNA的條帶大小約為1500 bp，所擴(kuò)增的gyrA基因DNA片斷大小為1000 bp左右，將其回收并測(cè)序。結(jié)

果顯示，所擴(kuò)增的JK05菌株16S rRNA序列長為1463 bp，gyrA基因片斷為1025 bp，分別提交至GenBank，獲得登錄號(hào)為MN080398和MN08?68?21。分別將其與其他模式菌株的16S rRNA和gyrA基因序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，在基于16S rRNA序列構(gòu)建的聚類分析樹中，JK05菌株與模式菌株Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42聚在同一分支（圖2），暗示兩者在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上較為密切。而在基于gyrA基因構(gòu)建的聚類分析樹中，JK05菌株也與模式菌株Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42聚在同一分支（圖3），進(jìn)一步暗示兩者在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上較為密切。

2.4? JK05菌株對(duì)11株鐮刀菌的抑制效果

JK05菌株及其發(fā)酵液對(duì)11株病原鐮刀菌的抑制率見表1。在PDA平板上，JK05菌株對(duì)FG01（禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum）的平均抑制率為70.13%，顯著高于其對(duì)其他菌株的平均抑制率，其對(duì)FG11（F. oxysporum f. sp. radicis- ly?co?persici）的抑制效果最低，為40.93%。與上述的稍微不同，JK05發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的平均抑制率最高，為61.27%，但與JK05發(fā)酵液對(duì)其他6個(gè)菌株（FG02-FG07）的抑制率（54.31%～56.73%）沒有顯著差異，對(duì)FG08～FG10的抑制率較高，對(duì)

標(biāo)尺表示每個(gè)核苷酸位置有0.005個(gè)核苷酸替換，表示相似性百分比;分支點(diǎn)數(shù)字為自展支持率（%）。

2.5? JK05對(duì)香蕉枯萎病的防控效果

采用JK05菌液處理香蕉，香蕉植株發(fā)病指數(shù)為15.5±1.1，顯著低于對(duì)照香蕉植株的平均發(fā)病指數(shù)52.9±1.4，對(duì)香蕉枯萎病的防治效果為70.5%，其表明施用JK05對(duì)香蕉枯萎病具有良好的防治效果。

2.6? JK05對(duì)香蕉和玉米生長的影響

施用JK05菌液對(duì)香蕉生長的影響見表2。與對(duì)照相比，JK05處理的香蕉株高、莖粗、地上部分鮮重和葉面積均顯著增加（P<0.05），分別增加21.7%、22.7%、57.6%和19.5%，其表明施用JK05可顯著促進(jìn)香蕉植株的生長。

施用JK05菌液后，玉米的生長狀況見表3。由表3可知，施用JK05處理的玉米植株平均莖粗、株高和地上部分鮮重顯著高于對(duì)照處理（P< 0.05），分別增加56.3%、52.1%和171.8%，表明JK05菌株可促進(jìn)玉米生長。

2.7? 吲哚乙酸的測(cè)定

為了解JK05合成吲哚乙酸能力，將JK05菌株在添加色氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3?d，通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中吲哚乙酸的濃度為（16.4±0.9）??g/mL，而未加菌的對(duì)照未檢測(cè)到吲哚乙酸。結(jié)果表明JK05可以色氨酸為前體合成生長素吲哚乙酸。

2.8? 解磷效果

將JK05菌株在NBRIP培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)。由圖4可知，隨著時(shí)間延長，NBRIP培養(yǎng)液中的可溶性磷含量增加，在第8天達(dá)到最大值（13.9?mg/L），隨后培養(yǎng)液中的可溶性磷含量有所降低。其表明JK05菌株具有一定的解磷能力。將其接種在有機(jī)磷平板上培養(yǎng)7?d，菌落和透明圈直徑比為1∶1，表明JK05菌株具有降解有機(jī)磷的能力。將JK05接種于含磷礦粉的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5?d，培養(yǎng)液可溶性磷含量為15.1 mg/L，表明JK05具有一定的降解難溶磷礦粉為可溶性磷的能力。

2.9? 抗生素合成基因PCR擴(kuò)增

以JK05菌株的基因組DNA為模板，采用9對(duì)抗生素合成基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以JK05基因組DNA為模板，可擴(kuò)增到豐原素（fengycin， fenD）、芽胞菌霉素（bacillomycin， bmyB）、桿菌溶素（bacilysin， bacA）、伊枯草菌素A（iturin A， ituD）、表面活性素（surfactin， srfAA）等抗生素合成基因DNA片斷，其大小與預(yù)計(jì)一致，而另外4個(gè)抗生素基因[2，4?二乙酰藤黃酚（2，4?DAPG， phlD）、吩嗪（phenazine， phzFA）、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin， prnD）、藤黃綠菌素（pyoluteorin， pltC）] DNA片斷無擴(kuò)增條帶（圖5）。將上述所擴(kuò)增的DNA片斷進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，所擴(kuò)增的豐原素、芽胞菌霉素、桿菌溶素、伊枯草菌素A、表面活性素合成基因DNA片斷與已知的模式菌株FZB42對(duì)應(yīng)基因序列一致性分別為99%、96%、99%、97%和98%。以上結(jié)果表明，JK05菌株基因組包含豐原素、芽胞菌霉素、桿菌

圖4? JK05菌株對(duì)無機(jī)磷的溶解效果

Fig. 4? Inorganic phosphate solubilization by JK05

M：DL2000 DNA Marker;1：合成DAPG的phlD基因;2：合成吩嗪的phzFA基因;3：合成硝吡咯菌素的基因prnD;4：合成藤黃綠菌素基因pltC;5：合成豐原素的fenD;6：合成芽胞菌霉素D的基因bmyB; 7：合成溶桿菌素Bacilysin;8：合成伊枯草菌素的基因ituD;9：合成表面活性素的基因srfAA。

M： DL2000 DNA Marker; 1： phlD gene for 2，4-diacetyl phloroglucinol （DAPG）; 2： phzFA for phenazine; 3： prnD for pyrrolnitrin; 4： pltC for pyoluteorin; 5： fenD for fengycin; 6： bmyB for bacillomycin D; 7： bacA for bacilysin; 8： ituD for iturin A;

9： srfAA for surfactin.

圖5? PCR擴(kuò)增JK05菌株的抗生素合成基因

Fig. 5? PCR amplification products of 9 antibiotic

biosynthetic genes in JK05

溶素、伊枯草菌素A和表面活性素等5種抗生素的合成基因。

3? 討論

根據(jù)JK05菌株的形態(tài)、生理生化特征可判斷JK05菌株為芽孢桿菌。同時(shí)，16S rRNA聚類分析顯示，其與解淀粉芽胞桿菌植生亞種B. amyloli?quefa?ciens subsp. plantarum FZB42在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上十分接近。另外，采用gyrA基因部分序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果也表明JK05菌株與解淀粉芽胞桿菌植生亞種FZB42菌株在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上更加接近。因此，將JK05鑒定為解淀粉芽胞桿菌植生亞種B. amyloliquefaciens subsp. plantarum。研究報(bào)道，解淀粉芽胞桿菌植生亞種FZB42是一株促進(jìn)植物生長的根際菌，對(duì)多種植物病原菌具有拮抗作用，其可產(chǎn)生表面活性素、伊枯草菌素，豐原素等脂肽抗生素，且具有合成吲哚乙酸的能力，其基因組包含對(duì)應(yīng)的抗生素和吲哚乙酸合成編碼基因[24-25]。JK05與FZB42在系統(tǒng)發(fā)育上與其接近，暗示兩者可能在功能上也具有相似性。拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種JK05及其無細(xì)胞發(fā)酵液可以抑制11種植物病原鐮刀菌的菌絲生長，而植物促生長實(shí)驗(yàn)證實(shí)，施用JK05菌株可以促進(jìn)香蕉幼苗和玉米植株的生長，表明JK05與FZB42相似，具有抑制植物病原真菌和促進(jìn)植物生長的能力。此外，張妙宜等[8]報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌Y-4菌株對(duì)香蕉枯萎病菌在內(nèi)許多病原真菌具有抑制作用。王國芬等[10]報(bào)道A5-6是一株解淀粉芽孢桿菌，并且對(duì)香蕉枯萎病的防效達(dá)72.3%。Yuan等[13]報(bào)道的NJN-6菌株和Wang等[15]報(bào)道的菌株W19，均鑒定為解淀粉芽孢桿菌，且其具有防治香蕉枯萎病和促進(jìn)香蕉生長的作用。因此，JK05菌株與上述的4株解淀粉芽孢桿菌相似，均具有抑菌譜廣和對(duì)枯萎病防效較好的特性，以上結(jié)果暗示環(huán)境中廣泛存在對(duì)植物病原真菌具有生防潛力的解淀粉芽孢桿菌菌株。解磷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JK05具有溶解無機(jī)難溶磷和有機(jī)磷的能力，同時(shí)能用色氨酸生產(chǎn)生長素吲哚乙酸，其能力與其促進(jìn)植物生長相對(duì)應(yīng)。因此，可推測(cè)JK05可能通過溶解土壤中難溶的無機(jī)磷，為植物提供有效養(yǎng)分，同時(shí)產(chǎn)生植物生長激素吲哚乙酸，從而促進(jìn)植物生長。這種機(jī)制與許多報(bào)道的芽胞桿菌促進(jìn)生長的機(jī)制相似[1， 3， 25]。在抑制植物病原真菌的機(jī)制方面，大量研究報(bào)道芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽物質(zhì)如伊枯草菌素豐原素等可抑制真菌的生長[4-5]，因此，JK05菌株抑制病原鐮刀菌生長的機(jī)制可能與脂肽物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。而PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，用抗生素合成基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可從JK05基因組中檢測(cè)到伊枯草菌素，豐原素等基因。因此，JK05菌株可能通過產(chǎn)生伊枯草菌素，豐原素等脂肽抗生素抑制病原真菌的生長。

綜上所述，從香蕉根際土壤分離的菌株JK05被鑒定為解淀粉芽胞桿菌植生亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum）。該菌株具有抑制植物病原鐮刀菌生長和促進(jìn)植物生長的作用。其可能通過溶解有機(jī)磷和難溶的無機(jī)磷為植物提供有效磷養(yǎng)分，以及產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸等機(jī)制促進(jìn)植物的生長，可能通過分泌脂肽抗生素如伊枯草菌素，豐原素 等抑制病原真菌的生長。JK05菌株的其潛能表明其將來有望用于微生物肥料和殺菌劑的制備。

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