王樹軍 孫進華 李煥苓 王果 李芳 王家保

摘? 要：為開拓荔枝轉(zhuǎn)基因育種新途徑，以GUS基因作為報告基因，用花粉管通道法轉(zhuǎn)化授粉后24 h的‘新球蜜荔荔枝雌花，并統(tǒng)計座果率、成苗率、轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示：共獲得303株實生苗，經(jīng)PCR檢測和GUS染色法證實外源基因整合到4株荔枝苗基因組中，轉(zhuǎn)化率為1.32%。此研究結(jié)果為荔枝生物技術(shù)育種提供了一種簡單有效的途徑。

關(guān)鍵詞：荔枝;花粉管通道;轉(zhuǎn)基因;育種

中圖分類號：S667.1????? 文獻標識碼：A

Abstract： In order to develop a new gene transformation pathway for litchi， the female flowers of Xinqiumili （24 h after pollination） were transformed by the pollen tube pathway method， using GUS as a report gene， and the fruit set percentage， seeding rate， and conversion rate were counted. A total number of 303 seedlings were obtained， and four positive transformed plants were verified according to PCR analysis and GUS staining， the transformation rate was 1.32%. This study would provide a simple and efficient way for the biotechnology breeding of litchi.

Keywords： litchi; pollen tube path; transgenic; breeding

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是華南重要的特色水果，其產(chǎn)業(yè)在區(qū)域農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位。但采前蒂蛀蟲危害和采后果皮褐變等問題限制了荔枝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。培育多抗、優(yōu)質(zhì)耐貯的新品種是解決荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根本途徑。由于荔枝遺傳基礎(chǔ)狹窄，缺乏抗性資源，使荔枝抗性育種進展緩慢。但現(xiàn)代植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起與發(fā)展為荔枝育種提供了新方向。目前，已見報道的成功案例均是通過農(nóng)桿菌介導法[1]和基因槍法[2]實現(xiàn)荔枝轉(zhuǎn)基因育種，但這2種方法均必須經(jīng)過繁瑣的組織培養(yǎng)和再生過程，周期較長。Zhou等[3]在1983年首次提出花粉管通道法，該法巧妙利用有花植物授粉后形成的花粉管外通道，將外源DNA直接導入胚囊，對還處于融合期沒有形成細

胞壁的受精卵細胞或者是早期的胚胎細胞進行轉(zhuǎn)化?；ǚ酃芡ǖ婪ú僮骱唵?，技術(shù)成本低廉，不依賴于組織培養(yǎng)，直接從萌發(fā)的種子獲得實生苗篩選轉(zhuǎn)化株，是一種簡便、高效的轉(zhuǎn)基因方法[4]。自創(chuàng)立以來已在辣椒[5]、蝴蝶蘭[6]、鐵皮石斛[7]、黑楊[8]、番木瓜[9]等植物育種中得到應(yīng)用。本研究首次采用花粉管通道法對荔枝遺傳轉(zhuǎn)化進行探索，旨在尋找一種適用于荔枝的簡便、高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，為加速荔枝生物技術(shù)育種進程提供基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗基地果園進行，選取‘新球蜜荔品種為材料。在第1批雄花將謝，雌花即將大量開放時期，選擇花期相對一致、花穗多、樹體健壯的荔枝樹作為轉(zhuǎn)基因母樹。農(nóng)桿菌菌株選用EHA105，植物表達載體選用包含GUS基因的pCAMBIA1301質(zhì)粒。

1.2? 方法

1.2.1? 農(nóng)桿菌菌液的制備? 用熱激轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pCAMBIA1301轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，恢復培養(yǎng)后在添加了卡那霉素（Kan）100?mg/L和利福平（Rif）100 mg/L的LB固體培養(yǎng)基上涂板，利用菌落PCR方法鑒定出陽性單菌落后培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基為LB+Kan 100 mg/L+Rif 100 mg/L，在200 r/min，28?℃條件下培養(yǎng)過夜。按1∶100的比例，轉(zhuǎn)接到含有Kan 100 mg/L+Rif 100 mg/L的1 L液體LB培養(yǎng)基中，在相同條件下擴大培養(yǎng)至OD600為0.8。將獲得的農(nóng)桿菌菌液5000 r/min離心10 min，收集菌體。然后用1 L轉(zhuǎn)化緩沖液重懸菌體至OD600值為0.8。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化緩沖液配方為：1/2 MS+100 ?mol/L AS+Silwet L-77（0.05% V/V）+蔗糖（5 mg/L）+0.0l mg/L 6-BA，pH調(diào)至5.8。

1.2.2? 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液對花粉萌發(fā)的影響? 在雄花盛花期，摘取帶有淡黃色雄花的花穗，保濕帶回實驗室后，用鑷子將淡黃色雄花花朵摘下，置于40?℃的烘箱內(nèi)12?h，使其干燥散粉后，利用80目篩子收集金黃色花粉于2 mL離心管內(nèi)備用。

花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的制備參照李煥苓等[10]方法，取10 g蔗糖和1 g瓊脂加入到0.5 mg/L硼酸水溶液100 mL，加熱溶解。待培養(yǎng)基溫度冷卻至不燙手，滴加1滴至曲面載玻片上，培養(yǎng)基凝固冷卻后備用。此外，分別制備1/2 MS、1/2 MS+ 100??mol/L AS、1/2 MS+Silwet L-77?（0.05% V/V）、1/2MS+100 ?mol/L AS+Silwet L-77（0.05% V/V）4種液體培養(yǎng)基以及OD600為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的農(nóng)桿菌菌液，用于重懸適量花粉，搖勻后靜置5 min，滴加1滴花粉液在冷卻的硼酸固體培養(yǎng)基上，將載玻片放置在28?℃且保濕的環(huán)境中。3?h后在Nikon ECLIPSE Ti顯微鏡下觀察載玻片上的花粉萌發(fā)情況。

1.2.3? 花粉管生長的熒光顯微觀察? 選取盛花期的花穗疏花，待雌花柱頭微微露白，去雄并套袋隔離。雌花柱頭開裂即將彎曲時進行人工授粉并繼續(xù)套袋隔離。授粉后1～10?h，每隔1?h取樣1次;授粉后10～30 h，每隔2 h取樣1次;授粉后30～48 h，每隔6 h取樣1次。每次取10個雌蕊，用卡諾氏固定液固定12 h后轉(zhuǎn)入70%乙醇中低溫保存?zhèn)溆?。熒光顯微觀察前，用8 mol/L NaOH軟化雌蕊4～5 h，蒸餾水沖洗后，在0.05%苯胺藍溶液中染色4 h。壓片后，在ZEISS Stereo Lumar.V12顯微鏡356 nm波長下觀察，分別觀測柱頭上花粉的萌發(fā)和花粉管在花柱內(nèi)的生長情況。

1.2.4? 侵染轉(zhuǎn)化? 選好試驗樹后，對花穗進行疏花和去雄處理，保留柱頭未開裂的雌花，套袋隔離。待雌花柱頭開裂，將貯藏的花粉用授粉筆點授于雌花柱頭，套袋隔離。根據(jù)花粉管生長的熒光顯微觀察結(jié)果確定適宜的轉(zhuǎn)化時機。將制好的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液倒入大燒杯中，浸沒授粉后的雌花花穗10?s。同時，選擇一些雌花用刀片從花柱基部切割柱頭后用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液浸沒10?s。對處理的花穗掛牌做標記并做套袋處理，侵染結(jié)束1周后去除套袋。待果實成熟后統(tǒng)計座果率，公式如下：

座果率=果實數(shù)量/轉(zhuǎn)化雌花數(shù)量×100%。

取種子洗凈，播種，4周后統(tǒng)計成苗率，公式如下：

成苗率=成苗數(shù)量/播種種子數(shù)量×100%。

1.2.5? PCR檢測? 取播種后長成的實生幼苗葉片提取DNA，做PCR檢測。引物F和R根據(jù)潮霉素基因設(shè)計（引物序列：F： 5-AAAAGTTCGACA GCGTCTC-3;R： 5-GCGACCTCGTATT?GG?GA?A? T?C-3），PCR反應(yīng)程序為：94?℃預變性3 min;94?℃變性30 s，58?℃退火30 s，72?℃延伸1 min， 35次循環(huán);72?℃延伸5 min。統(tǒng)計陽性轉(zhuǎn)化率，公式如下：

轉(zhuǎn)化率=陽性苗數(shù)量/成苗數(shù)量×100%。

1.2.6? GUS組織化學染色? 取轉(zhuǎn)化2周后的部分幼果以及PCR檢測結(jié)果為陽性的實生幼苗的根和葉片，切成小塊，用無菌水清洗之后置于GUS染液[50 mmol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液、0.1 mmol/L K3[Fe（CN）6]、0.1 mmol/L K4[Fe（CN）6]、1 mmol/L Na2EDTA、0.1% Triton-100、20%甲醛、0.5 mg/mL X-Gluc加入中、37?℃染色過夜，酒精脫色后在OLYMPUS SZX7顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液對花粉萌發(fā)影響研究

花粉管通道法大致有4種：柱頭涂抹法、浸泡法、斷口滴加法和注射法[11-14]。在應(yīng)用花粉管通道法轉(zhuǎn)化外源基因時，應(yīng)根據(jù)不同物種花的特性及開花習性選擇適合的方法[15]。柱頭涂抹法、子房注射法、斷口滴加法，均適合用于子房較大的開花植物[16]。而荔枝花小而密，宜選擇浸泡法?；ǚ勰苷Ｃ劝l(fā)是花粉管通道法成功應(yīng)用的前提條件，因此首先開展了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液對‘妃子笑花粉萌發(fā)影響的研究。顯微觀察并統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：經(jīng)1/2 MS和1/2 MS+AS重懸后的花粉萌發(fā)率分別為34%和32%，而經(jīng)過1/2MS+Silwet L-77、1/2 MS+ AS+Silwet L-77和不同濃度的農(nóng)桿菌菌液重懸后的花粉萌發(fā)率均為0%。由此推斷，轉(zhuǎn)化液中的乙酰丁香酮（AS）不影響花粉萌發(fā)，但Silwet L-77和不同濃度的農(nóng)桿菌菌液均會抑制花粉萌發(fā)（圖1，圖2）。綜上可見，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液包裹荔枝花粉會抑制花粉萌發(fā)，導致無法形成花粉管通道。因此，花粉管通道法中農(nóng)桿菌就只能借助荔枝雌花授粉后已形成的花粉管通道到達胚囊。

2.2? 花粉管生長的熒光顯微觀察

選取‘新球蜜荔的雌花為母本，以‘妃子笑、‘新球蜜荔的花粉為父本，開展荔枝花人工授粉授精過程的研究，進行花粉管通道生長的熒光顯微觀察。結(jié)果顯示，‘新球蜜荔雌花授粉后約8?h，花粉管伸長可達花柱道基部，約授粉16～18 h以后，花粉管穿過花柱道基部繼續(xù)向子房延伸。根據(jù)觀察結(jié)果確定授粉后24 h的雌花為理想的實驗材料（圖3）。

2.3? PCR檢測

本研究共獲得376?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD(zhuǎn)化荔枝種子，播種后得到實生苗303株。提取幼苗葉片DNA后，經(jīng)PCR檢測證實獲得4株轉(zhuǎn)化株（圖4），轉(zhuǎn)化率為1.32%。此外，本研究還比較了柱頭切割對荔枝花粉管通道法的影響（表1），結(jié)果顯示，切割柱頭處理不能有效提高轉(zhuǎn)化效率，但會明顯降低座果率。

2.4? GUS組織化學染色

隨機取轉(zhuǎn)化2周后的20顆幼果進行GUS染色，染色結(jié)果顯示有1顆幼果的胚可見藍色斑點。播種獲得的實生苗進行PCR檢測后，隨機取陽性幼苗的根和葉片進行GUS染色。染色結(jié)果顯示，

荔枝轉(zhuǎn)基因育種的新途徑具有重要的意義。農(nóng)桿菌介導法和基因槍法均必須經(jīng)過周期較長的組織培養(yǎng)過程，而利用自身的生殖系統(tǒng)作為載體的花粉管通道法在轉(zhuǎn)基因育種中卻可避免繁瑣的組織培養(yǎng)和再生過程，能夠直接通過花粉管通道轉(zhuǎn)化目的基因，且還可克服遠緣雜交的一些障礙，是一種便捷、有效的育種途徑。因為該方法在應(yīng)用中是通過收獲種子，播種后直接獲得轉(zhuǎn)化植株，因此，要選擇核大、豐產(chǎn)的荔枝品種進行實驗，如‘新球蜜荔。

花粉管通道法早期的應(yīng)用主要是將提取并純化的含有目的基因片段的質(zhì)粒DNA涂抹于雌花柱頭或通過微量注射器注入子房。但由于‘新球蜜荔雌花盛開的季節(jié)海南正處高溫天氣，且實驗是在田間活體開展，裸露的質(zhì)粒DNA在陽光強烈的高溫環(huán)境下易降解，難以達到轉(zhuǎn)化目的。因此，本研究在探明花粉管通道萌發(fā)生長規(guī)律的基礎(chǔ)上，選擇授粉后24?h為最佳的轉(zhuǎn)化時機，借助農(nóng)桿菌攜帶質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)化，并初步鑒定獲得轉(zhuǎn)基因?qū)嵣酌?。借助花粉管通道使用農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化方法，首先要排除農(nóng)桿菌自身造成的檢測干擾。因此，本研究選擇載體pCAM?B?I?A?1301中含有內(nèi)含子的GUS基因作為報告基因，因為農(nóng)桿菌等原核生物細胞在基因轉(zhuǎn)錄過程中沒有剪接內(nèi)含子的能力，所以含有內(nèi)含子的基因只能在真核生物細胞中表達而不能在原核生物細胞中表達[20]，從而避免農(nóng)桿菌自身的GUS染色干擾。

花粉管通道法結(jié)合農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的實驗受外界環(huán)境條件影響較大。結(jié)果表明，本研究中荔枝的座果率較低，可能是與花期恰遇連續(xù)陰雨天氣有關(guān)。座果率是影響花粉管通道法轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一。在實際的操作中可通過采取一些有效措施來提高座果率，比如選擇晴天進行實驗，避開中午高溫天氣進行實驗，轉(zhuǎn)化侵染后套袋等。因為花期雨水會導致落果，而睛天中午強烈的太陽強紫外線會降低農(nóng)桿菌活性，套袋則既可避免雨水打濕，又可避免陽光直射。另外，部分研究表明，花粉管通道法轉(zhuǎn)基因操作步驟中會有切割柱頭的處理，目的是縮短侵染路徑，但荔枝花較小，柱頭本身較短，所以影響不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，切割柱頭并不能有效提高轉(zhuǎn)化效率，反而會明顯降低座果率，還會數(shù)倍增加工作量，降低實驗效率。

本研究先通過潮霉素抗性基因PCR檢測初步確定了4株轉(zhuǎn)基因?qū)嵣酌?，為不影響幼苗的正常生長，僅在葉片和根部隨機取樣進行GUS染色，結(jié)果均呈陽性，這進一步證明外源基因整合到了荔枝基因組內(nèi)。但由于GUS基因表達的豐度差異，顯色部位多集中在葉脈和根尖。至于是否能穩(wěn)定遺傳，還需要對實驗植株的下一代進行驗證。

綜上所述，本研究首次將花粉管通道法用于將外源基因?qū)肜笾?，但是轉(zhuǎn)化效率不理想，后續(xù)研究將在本實驗基礎(chǔ)上優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系，對影響因素進行深入細致研究，以期建立簡便、高效、穩(wěn)定的荔枝花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。

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