李 谞，徐書(shū)琴，張 顯，徐美娟，楊套偉，張惠玲，方海田，饒志明*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；3.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川750021）

在利用微生物進(jìn)行表達(dá)重組蛋白質(zhì)的過(guò)程中，良好的分泌性能降低產(chǎn)品回收成本，是重組蛋白質(zhì)能否進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的重要考量因素。為了滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，科研工作者們通過(guò)基因工程手段建立了許多提高分泌的策略[1-3]。其中，枯草芽孢桿菌由于缺少細(xì)胞外膜而具有良好的分泌能力[4]，是分泌生物制品的理想宿主。同時(shí)，枯草芽孢桿菌還具有食品安全性[5]、基因信息清楚[6]、良好的生產(chǎn)技術(shù)和發(fā)酵基礎(chǔ)等特性，因此被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、食品添加劑、抗生素的生物發(fā)酵制備當(dāng)中。

在枯草芽孢桿菌中，根據(jù)分泌的蛋白質(zhì)是否依賴信號(hào)肽，可以分為信號(hào)肽依賴的分泌途徑和不依賴于信號(hào)肽的分泌途徑?？莶菅挎邨U菌中依賴信號(hào)肽分泌的途徑又分為以下4種[7]：Sec分泌途徑（General secretion pathway），原核微生物中主要的蛋白質(zhì)分泌途徑，該類(lèi)信號(hào)肽的最典型特征是C端氨基酸序列為Ala-X-Ala（X代表任何氨基酸），由Ⅰ型信號(hào)肽酶切割；Tat分泌途徑（Twin-arginine translocation pathway），其特征在于N端含有雙精氨酸（RR/KR）二級(jí)結(jié)構(gòu)；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)途徑（ATP-binding cassette transporter），ABC轉(zhuǎn)運(yùn)途徑僅用于細(xì)菌素等分子的輸出[8]；假菌絲蛋白質(zhì)輸出途徑（Pseudophilin pathway），假菌絲蛋白質(zhì)輸出途徑參與枯草芽孢桿菌細(xì)胞感受態(tài)的形成[9]。在枯草芽孢桿菌胞外蛋白質(zhì)組中的113種被鑒定的蛋白質(zhì)中，約有15%的蛋白質(zhì)缺少信號(hào)肽但依然被分泌到胞外培養(yǎng)基中[2]。這些不依賴于信號(hào)肽的蛋白質(zhì)分泌途徑研究相對(duì)較少，其分泌機(jī)理尚無(wú)法完全解析，并且與經(jīng)典分泌途徑有所不同，因此該分泌途徑被稱為非經(jīng)典分泌途徑（non-classical protein secretion pathway）[10]。

L-天冬酰胺酶（L-Asparaginase，EC 3.5.1.1）能夠通過(guò)水解L-天冬酰胺脫氨基形成L-天冬氨酸和氨[11]，其在醫(yī)療和食品行業(yè)中都具有重要的應(yīng)用價(jià)值[12]。在醫(yī)療行業(yè)中，L-天冬酰胺酶能降解癌細(xì)胞代謝循環(huán)所必須的L-天冬酰胺，從而殺死癌細(xì)胞[13]。在食品行業(yè)中，L-天冬酰胺酶能通過(guò)分解潛在致癌物質(zhì)丙烯酰胺的前體天冬酰胺來(lái)降低高溫、油炸食品中的丙烯酰胺含量[14-15]。

在課題組此前的研究中[16]，我們已經(jīng)在枯草芽孢桿菌中成功實(shí)現(xiàn)Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶的高產(chǎn)發(fā)酵，與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)部分該酶能被枯草芽孢桿菌分泌到胞外，基于此，作者分析鑒定了Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶在枯草芽孢桿菌中的分泌途徑，并通過(guò)添加信號(hào)肽及共表達(dá)分子伴侶的方式提高了其分泌水平。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

E.coli和B.subtilis穿梭質(zhì)粒pMA5、克隆宿主E.coliJM109、表達(dá)宿主B.subtilis168：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；限制性核酸內(nèi)切酶、PrimeSTAR?HS DNA聚合酶和T4 DNA連接酶：購(gòu)買(mǎi)自TaKaRa生物公司（大連，中國(guó)）；小型質(zhì)粒快速分離試劑盒、DNA提取試劑盒和Mini DNA快速純化試劑盒等：購(gòu)自Sangon Biotech Co.，Ltd（上海，中國(guó)）；質(zhì)粒同源重組試劑盒（ClonExpress?MultiS One-Step Cloning Kit）：購(gòu)自Vazyme Biotech Co.（南京，中國(guó)）；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建以作者所在實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建含有Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶基因（pyasnase）的重組質(zhì)粒pMA5-pyasnase為模板[16]，分別用引物F1&R1和F2&R2為模板分別克隆啟動(dòng)子PHpaII和pyasnase，見(jiàn)表1。將獲得的啟動(dòng)子PHpaII和pyasnasePCR產(chǎn)物分別用EcoRI&Eco RV和EcoRV&HindIII限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，通過(guò)酶連的方式將啟動(dòng)子PHpaII基因和pyasnas分別酶連于pMA5多克隆位點(diǎn)Eco RI&Eco RV和EcoRV&HindIII之間。以枯草芽孢桿菌168基因組為模板，分別用引物F3&R3-F13&R13分別擴(kuò)增信號(hào)肽基因SPphoD、SPLipA、SPwapA、SPywbN、SPYmaC、SPpel、SPyvbx、SPlipB、SPnprE。利用同源重組試劑盒將攜帶有啟動(dòng)子PHpaII和pyasnase同源臂的信號(hào)肽基因連接到PHpaII和pyasnase之間。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌脂肪酶信號(hào)肽SPlips基因由上海生工Sangon Biotech Co.，Ltd（上海，中國(guó)）合成并連接到PHpaII和pyasnase之間。以枯草芽孢桿菌基因組為模板，分別用引物F12&R12和F13&R13擴(kuò)增PrsA和DnaK，并用酶切酶連的方式連接到含有信號(hào)肽基因pMA5的BamHI&MluI間。將所得連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序并檢測(cè)是否構(gòu)建成功，抽提質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌Bacilus subtilis168感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。

表1 引物序列表Table 1 Primers used in this study

1.2.2 L-天冬酰胺酶的表達(dá)和純化將重組枯草芽孢桿菌接種至含有終質(zhì)量濃度為20μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中（NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L），于37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，作為種子液。取1 mL該種子液接種在100 mL的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基（蔗糖35 g/L，蛋白胨15 g/L，尿素0.8 g/L，玉米漿12 g/L，K2HPO42.612 g/L，KH2PO42.041 g/L，MgSO4·7H2O 1.845 g/L，NaCl 5 g/L，L-天冬酰胺1 g/L）中，并在相同條件下培養(yǎng)24 h，將擴(kuò)培后的重組枯草芽孢桿菌細(xì)胞于4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液作為胞外粗酶液，用于胞外L-天冬酰胺酶酶活測(cè)定，并用Edman水解法降解，并用質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)N端測(cè)序。取其細(xì)胞用裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.0）重復(fù)洗滌細(xì)胞3次后，在細(xì)胞裂解緩沖液中加入6 mg/mL溶菌酶，4℃放置2 h，再于20 MHz、45%功率下，超聲處理細(xì)胞30 min。將所得細(xì)胞裂解物在12 000 r/min下離心25 min，收集上清液作為胞內(nèi)粗酶液，用于胞內(nèi)L-天冬酰胺酶酶活測(cè)定。

1.2.3 L-天冬酰胺酶酶活的測(cè)定L-天冬酰胺酶酶活測(cè)定采用Li等人所述的奈斯勒試劑顯色法進(jìn)行，通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)所生成氨的量來(lái)計(jì)算酶促反應(yīng)速率[16]。在95℃下對(duì)底物（1 mL的25 mmol/L L-天冬酰胺和50 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl混合物）進(jìn)行預(yù)熱后，加入100μL酶溶液，反應(yīng)進(jìn)行10 min后加入100μL 15%的三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)。反應(yīng)后的混合物體系以20 000 r/min離心10 min，取200μL澄清上清液加入4.8 mL去離子水中，并加入200μL奈斯勒試劑反應(yīng)，用分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)量吸光度來(lái)檢測(cè)反應(yīng)中釋放的氨的量。對(duì)照組在酶促反應(yīng)前加入100μL的15%三氯乙酸提前終止反應(yīng)，以除去由于高溫下L-天冬酰胺自水解帶來(lái)的誤差。酶活力單位定義：在酶的最適反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol氨所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶分泌途徑的鑒定

利用食品安全菌株枯草芽孢桿菌分泌L-天冬酰胺酶具有良好的食品應(yīng)用前景[16]。Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶具有良好的熱穩(wěn)定性，在85℃下的半衰期達(dá)到105 min，37℃儲(chǔ)藏1個(gè)月仍能保持90%以上的酶活，具有良好的應(yīng)用潛能[17]。在此前的研究中，發(fā)現(xiàn)該酶在枯草芽孢桿菌中具有一定的分泌能力，搖瓶發(fā)酵24 h后，胞外和胞內(nèi)酶活分別為23.31、65.72 U/mL，本研究對(duì)其分泌途徑進(jìn)行了分析鑒定。

SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線預(yù)測(cè)軟件能準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)[18]。我們通過(guò)SignalP4.1 Server對(duì)該酶信號(hào)肽進(jìn)行了預(yù)測(cè)，見(jiàn)圖1。發(fā)現(xiàn)其整段氨基酸序列的切割位點(diǎn)值（C值）均較低，最高為0.213，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，說(shuō)明該酶不具有典型的信號(hào)肽。同時(shí)，我們將胞外所得酶液體進(jìn)行N端測(cè)序，發(fā)現(xiàn)分泌到胞外該酶N端序列（MRLLILGMG）與該酶蛋白N端初始氨基酸序列一致，說(shuō)明該酶分泌過(guò)程中不存在信號(hào)肽的切割，再一次說(shuō)明該酶的分泌不依賴于信號(hào)肽。

圖1 P.yayanosii L-天冬酰胺酶信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.1 Signal peptideprediction of P.yayanosii Lasparaginases

在枯草芽孢桿菌胞外蛋白質(zhì)組中的113種被鑒定的蛋白質(zhì)中，約有15%蛋白質(zhì)缺少了典型的信號(hào)肽，但依舊被分泌到胞外[19]。對(duì)于這些“分泌蛋白”，一些學(xué)者們認(rèn)為可能是由于細(xì)胞裂解所導(dǎo)致的[20]。為了驗(yàn)證該L-天冬酰胺酶的分泌是否由枯草芽孢桿菌裂解所致，我們監(jiān)控了搖瓶發(fā)酵過(guò)程中胞外L-天冬酰胺酶的酶活情況，發(fā)現(xiàn)該酶在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（發(fā)酵9 h）開(kāi)始分泌，在穩(wěn)定期胞外酶活也有所增加（圖2（a））。穩(wěn)定期間枯草芽孢桿菌生物量不變，胞外酶活的增加說(shuō)明細(xì)胞持續(xù)分泌該L-天冬酰胺酶，但也有可能是由于細(xì)胞裂解速率與生物量增加速率相一致導(dǎo)致的。為排除細(xì)胞裂解的影響，我們?cè)诩?xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后半段（發(fā)酵12 h）添加終質(zhì)量濃度為100μg/mL的氯霉素，抑制枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，此后9小時(shí)枯草芽孢桿菌的生物量未降低，說(shuō)明細(xì)胞未出現(xiàn)裂解，而此段時(shí)間內(nèi)，該L-天冬酰胺酶在胞外酶活依舊持續(xù)增加，說(shuō)明該L-天冬酰胺酶在枯草芽孢桿菌中的分泌不是細(xì)胞裂解所引起的（圖2（b））。綜上所述，該L-天冬酰胺酶在枯草芽孢桿菌中的分泌是由于不依賴信號(hào)肽的非經(jīng)典非經(jīng)典分泌途徑（non-classical protein secretion pathway）進(jìn)行分泌的。

圖2 Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶搖瓶發(fā)酵情況Fig.2 Shake flask fermentation of Pyrococcus yayanosii L-asparaginase

2.2 信號(hào)肽對(duì)L-天冬酰胺酶分泌的影響

為了提高Pyrococcus yayanosiiL-天冬酰胺酶的分泌水平，我們研究了枯草芽孢桿菌來(lái)源的5種Tat途徑的信號(hào)肽（SPphoD、SPLipA、SPwapA、SPywbN、SPYmaC）和4種Sec途徑信號(hào)肽（SPpel、SPyvbx、SPlipB、SPnprE），以及1個(gè)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Sec途徑信號(hào)肽SPlips對(duì)該酶分泌的影響。

將啟動(dòng)子PHpaII和L-天冬酰胺酶基因pyasnase分別連接到pMA5的EcoRI&Eco RV和EcoRV&HindIII酶切位點(diǎn)中，并利用同源重組將各信號(hào)肽基因連接到啟動(dòng)子和pyasnase之間，構(gòu)建新的重組質(zhì)粒（圖3（a））。對(duì)胞外粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定（圖3（b）），并進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖3（c）），發(fā)現(xiàn)Sec途徑的信號(hào)肽對(duì)L-天冬酰胺酶的分泌都具有一定的抑制作用，Tat途徑的信號(hào)肽對(duì)L-天冬酰胺酶的影響相對(duì)較小，其中SPphoD對(duì)該酶的分泌有一定促進(jìn)作用，使該酶的分泌量從23.31 U/mL提高到30.03 U/mL，見(jiàn)表2。Sec途徑分泌途徑和Tat分泌途徑的一個(gè)重要差異在于Sec途徑分泌時(shí)先進(jìn)行蛋白質(zhì)分泌后再進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊，而Tat途徑分泌時(shí)蛋白質(zhì)先折疊形成正確構(gòu)象后再通過(guò)信號(hào)肽分泌到胞外[21]?？赡苡捎谠揕-天冬酰胺酶在枯草芽孢桿菌中迅速折疊，而Sec分泌途徑的信號(hào)肽無(wú)法正確介導(dǎo)已折疊好的蛋白質(zhì)進(jìn)行分泌，反而由于在該L-天冬酰胺酶的N端加入一段短肽抑制了其自身的分泌特性從而降低了該酶的分泌能力。同時(shí)從表2可看出，在提高胞外酶活的同時(shí)并未造成胞內(nèi)酶活的降低，這可能該酶在枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)“閾值”，當(dāng)該酶的量達(dá)到此“閾值”時(shí)，該酶難以再在細(xì)胞內(nèi)積累，因此將酶分泌到胞外對(duì)提高該酶在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)也具有重要的研究意義。

圖3 信號(hào)肽介導(dǎo)的P.yayanosii L-天冬酰胺酶分泌型質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)酶分泌的影響Fig.3 Construction of secretion plasmid with signal peptide and effect to the secretion of P.yayanosii L-asparaginase

表2 信號(hào)肽對(duì)L-天冬酰胺酶在枯草芽孢桿菌中分泌的影響Table 2 Effect of signal peptides on L-asparaginase secretion with B.subtilis

2.3 共表達(dá)分子伴侶提高L-天冬酰胺酶分泌水平

分子伴侶（molecular chaperones）在細(xì)胞中能識(shí)別并結(jié)合到不完整折疊或裝配的蛋白質(zhì)，幫助這些蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊、分泌。在枯草芽孢桿菌中，PrsA是一種能結(jié)合到胞質(zhì)外側(cè)的脂蛋白分子伴侶，在蛋白質(zhì)分泌的過(guò)程中，它能協(xié)助蛋白質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞膜，因此與細(xì)胞的分泌水平緊密相關(guān)，提高PrsA的水平能使淀粉酶的分泌量提高6倍[22]。DnaK是一種胞內(nèi)分子伴侶，它具有協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)折疊、減少蛋白質(zhì)聚集、保護(hù)蛋白質(zhì)前體轉(zhuǎn)移的功能，該蛋白質(zhì)的缺失會(huì)限制異源蛋白質(zhì)分泌水平[23]。將PrsA和DnaK基因分別連接到含有pyasnase及SPphoD基因的pMA5質(zhì)粒上的BamHI&MluI間（圖4（a）），并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入B.subtilis168中實(shí)現(xiàn)分子伴侶和該L-天冬酰胺酶的共表達(dá)，用以提高該酶的分泌水平。

圖4 分子伴侶共表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)P.yayanosii L-天冬酰胺酶分泌的影響Fig.4 Co-expression plasmid construction of molecular chaperone and effect on the secretion of P.yayanosii L-asparaginase

取胞外粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖4（b））并進(jìn)行酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該酶的分泌量在與DnaK共表達(dá)后并未出現(xiàn)明顯變化（胞外酶活僅從30.03 U/mL變?yōu)?0.15 U/mL，總酶活從96.15 U/mL變?yōu)?6.25 U/mL），而與PrsA共表達(dá)后，成功的將胞外酶活從30.03 U/mL提高到40.12 U/mL，并且將蛋白質(zhì)總的表達(dá)量從96.15 U/mL提高到105.4 U/mL。綜合考慮不同途徑信號(hào)肽及分子伴侶對(duì)該酶的影響，出現(xiàn)該結(jié)果可能是由于該酶的折疊較快，且不需要DnaK的協(xié)助或枯草芽孢桿菌中DnaK已足夠滿足該酶的折疊及轉(zhuǎn)運(yùn)的需求，同時(shí)由于其折疊較快且折疊好的分子相對(duì)較大，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)出細(xì)胞膜成為限制該蛋白質(zhì)分泌的重要因素，此時(shí)過(guò)表達(dá)PrsA，有利于該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)出細(xì)胞膜，從而提高了該酶的分泌水平。

總體來(lái)說(shuō)，通過(guò)添加Tat途徑信號(hào)肽，并在此基礎(chǔ)上共表達(dá)分子伴侶PrsA，使L-天冬酰胺酶分泌量從23.31 U/mL提高到40.12 U/mL，分泌量提高了72.11%。

3 結(jié)語(yǔ)

在本研究中，針對(duì)前期工作發(fā)現(xiàn)P.yayanosiiL-天冬酰胺酶在枯草芽孢桿菌中表達(dá)時(shí)具有一定分泌性的現(xiàn)象進(jìn)行了研究。通過(guò)信號(hào)肽預(yù)測(cè)、N端測(cè)序等手段鑒定出P.yayanosiiL-天冬酰胺酶的分泌依賴非經(jīng)典蛋白質(zhì)分泌途徑，并且發(fā)現(xiàn)Tat途徑的信號(hào)肽SPphoD能提高該酶分泌水平，同時(shí)共表達(dá)分子伴侶PrsA有利于該酶的分泌，通過(guò)以上策略，將該L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%，并且對(duì)該酶的分泌過(guò)程進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究和探討該L-天冬酰胺酶的分泌過(guò)程及提高分泌能力提供了一定參考價(jià)值。