顧 凡,陳 玲,陳 越,趙昶靈,肖素勤,程在全*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術學院,云南 昆明 650201;2.云南省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術與種質(zhì)資源研究所,云南 昆明 650205)

褐飛虱(Nilaparvatalugens)是以水稻為食的單食性昆蟲,從水稻中吸取汁液,當其為害嚴重時能引起稻飛虱群體大規(guī)模的暴發(fā),給水稻種植區(qū)帶來嚴重的破環(huán),是亞洲最嚴重的水稻害蟲之一。褐飛虱每年在中國的為害面積達40萬hm2左右，為水稻種植總面積的50%左右[1]。水稻為禾本科稻屬一年生栽培谷物,是我國重要的糧食作物,而在其種植中易發(fā)生褐飛虱危害,會導致水稻大片倒伏,從而形成枯孕穗或半枯穗,最終造成水稻大幅減產(chǎn)甚至顆粒無收。褐飛虱是典型的吸食維管束液的昆蟲[2],其對中國和亞洲的稻米生產(chǎn)造成了很大的影響,特別是在易感水稻品種種植的地區(qū),褐飛虱種群增長速度較快,對水稻生產(chǎn)構(gòu)成了嚴重的威脅。選育和種植抗蟲品種是褐飛虱綜合防治的基礎,抗褐飛虱品種的培育應用被認為是控制褐飛虱危害最經(jīng)濟和環(huán)境友好的途徑[3]。自20世紀90年代以來,科學家們特別注意從野生稻中開發(fā)新的抗性基因,各國科學家歷來都十分重視水稻抗褐飛虱資源的挖掘、研究和利用。近年來,利用分子標記技術也將一些抗褐飛虱基因進行了定位[4]。通過對與其緊密相連的分子標記的物理位置的查詢,可以推斷出分子標記在物理圖上的大致位置。Bph14是從水稻中第一個被克隆的抗蟲基因[5],從那時起,新基因的發(fā)現(xiàn)、鑒定、定位和克隆就被頻繁報道。本研究將來自不同群體的褐飛虱抗性基因整合到水稻品種“日本晴”的測序圖中,旨在為抗褐飛虱基因的克隆、分子標記選擇和功能分析提供參考。

1 材料與方法

通過查閱大量文獻(主要來源于http://www.Ricedata.cn/)以及在互聯(lián)網(wǎng)上搜索,獲得了褐飛虱抗性基因的鑒定、定位和克隆的總體情況,并獲得了與褐飛虱抗性基因相關的分子標記。針對褐飛虱的定位基因使用不同的種群和標記。在構(gòu)造的連鎖圖中,幾乎沒有發(fā)現(xiàn)其共同的標記,因此很難確定標記與基因之間的序列和距離。不過好在日本晴的測序工作已經(jīng)完成,大部分的水稻標記都在其測序圖上。因此,本文以日本晴的序列圖作為參考圖,整合不同來源的標記物和對褐飛虱的抗性基因。在整合過程中,在測序圖上確定了與褐飛虱抗性基因相關的分子標記的序列和位置,并以該標記為參照標記了抗性基因在染色體上的物理位置。在本研究中,我們利用最新的連鎖分子標記和對褐飛虱的抗性基因構(gòu)建了一個新的褐飛虱抗性遺傳圖譜,該圖譜是在www.gramene.org網(wǎng)站2009年發(fā)布的《Gramene注釋的Nippon Bare Sequence》的序列圖的基礎上構(gòu)建而成的。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗褐飛虱基因鑒定、定位、克隆的總體情況

自20世紀70年代以來,隨著分子標記技術的應用,人們對水稻抗褐飛虱基因的定位和克隆的研究越加頻繁。到目前為止,水稻中有43個褐飛虱抗性基因,其中26個為顯性基因,其余為隱性基因,這些基因均已得到國際注冊和期刊報道。在這43個基因中，有38個抗性基因已完成定位工作,其分布在水稻7條染色體中,其中2號染色體1個,3號染色體5個,4號染色體15個,6號染色體6個,10號染色體1個,11號染色體1個,12號染色體9個。其中Bph3、Bph6、Bph14、Bph18、Bph26、bph29和Bph32等7個抗性基因已被克隆[6]。這38個抗褐飛虱基因大部分聚集在染色體的不同區(qū)域。

2.2 抗褐飛虱基因在染色體上的分布

經(jīng)大量檢索,將已鑒定并命名的水稻抗褐飛虱抗性基因繪制成表1,并通過染色體圖譜的構(gòu)建繪制成圖1。從表1和圖1可以看出,褐飛虱抗性基因Bph13(t)位于2號染色體上。位于3號染色體上也有一個褐飛虱抗性基因Bph13(t),但它們不是同一個基因。Bph13(t)這個基因的命名與Yang等[22]從藥用野生稻中鑒定出的基因是重復的,因此,為了區(qū)分彼此，本文將2號染色體上的基因命名為Bph13(t)-1,將3號染色體上的基因命名為Bph13(t)-2。此外，在第3號染色體和第12號染色體上均發(fā)現(xiàn)了抗性基因bph19(t),但兩者也并非同一個基因,為區(qū)分彼此，本文特將其分別命名為bph19(t)-1、bph19(t)-2?；虻闹貜兔餐瑯影l(fā)生在位于第3號和第4號染色體上的Bph31(t),經(jīng)研究兩者也并非同一基因,故分別將其命名為Bph31(t)-1、Bph31(t)-2。位于第6號染色體上的基因bph20(t)與bph25(t),由于前期發(fā)現(xiàn)人及其所用研究方法的不同,得以分別命名,但經(jīng)后期研究發(fā)現(xiàn)兩者是同一個基因。同樣先后發(fā)現(xiàn)的位于第10號染色體的基因bph21(t)、bph26(t),現(xiàn)在研究結(jié)果表明兩者為同一基因。

褐飛虱抗性基因Bph13(t)-1位于2號染色體上。劉國慶等[7]利用RFLP和SSR等分子標記將Bph13(t)-1定位在2號染色體上,位于兩個微衛(wèi)星標記RM240和RM250之間。它在2號染色體上的物理距離是31.50～32.78 Mbp。該基因的發(fā)現(xiàn)和定位將有助于對水稻褐飛虱抗性的改良[7]。

在3號染色體上鑒定出5個抗褐飛虱基因,分別為bph11、Bph13(t)-2、Bph14、bph19(t)-1和Bph31(t)-1。Bph13(t)-2[22]來源于緊穗野生稻中,位于3號染色體上，定位于RG100和RG191標記之間。Bph14[2]來源于藥用野生稻,其與Feb-76標記共分離；該基因cDNA全長為9576 bp,包含3個外顯子,編碼由1323個氨基酸組成的蛋白質(zhì)產(chǎn)物,產(chǎn)物包括螺旋結(jié)構(gòu)域、核苷酸結(jié)合域和富含亮氨酸的重復序列(CC-NB-LRR)。重組自交系RI35與臺中1號中的Bph14基因序列差異很大,其中CC域和NB域較為保守,而LRR具有獨特的差異[8]。bph19(t)-1來源于水稻品種AS20-1,被定位在RM517與RM218標記之間,其位于第3號染色體的物理距離在6.16～8.40 Mbp[27]。Bph31(t)-1來源于品種CR2711-76,對褐飛虱生物型Ⅳ有很好的抗性,其被定位于RM251和RM2334之間[41]。

在第4號染色體上定位了15個抗褐飛虱基因,即Bph6、Bph12(t)、bph12、Bph15、Bph17、bph18(t)、Bph20(t)、bph22(t)、bph23(t)、Bph24(t)、Bph27(t)、Bph30、Bph31(t)-2、Bph33和Bph34。Bph6位于4號染色體Y37標記處,約21.4 Mbp的位置[16]。來源于闊葉野生稻的顯性基因Bph12(t),被定位于水稻第4號染色體上的RM261和RM8213之間,且位于第4號染色體上4.44～6.57 Mbp之間[22]。bph12位于4號染色體上的G271和R93之間,在染色體上的物理距離為20.34～21.31 Mbp[21]。宋丁丁等[23]將Bph15定位于第4號染色體的分子標記M1(STS)位置,其位于第4號染色體上物理距離6.94 Mbp處。Sun L H等[24]通過連鎖作圖和QTL分析將Bph17定位到4號染色體短臂上的RM8213和RM5953標記之間,其在染色體上的物理距離為4.45～9.38 Mbp。bph18(t)位于RM6506和RM273標記之間,在染色體上的物理距離為24.05～25.05 Mbp[26]。Rahman等[29]將Bph20(t)定位于水稻第4號染色體短臂區(qū),它與標記B43共分離,位于染色體物理距離8.76 Mbp處。bph22(t)被定位于第4號染色體RM8212和RM261標記之間[8]。來源于廣西野生稻的Bph24(t)位于兩個標記YZ16611和YZ26之間[30]。Huang等[36]從普通野生稻中鑒定出Bph27(t),并將其定位在第4染色體上的RM16852標記上,其大概位于染色體物理距離19.18 Mbp的位置。目前眾多抗褐飛虱基因分布于4號染色體上。眾所周知，抗病基因也集中在相同染色體的區(qū)域[9]。

在6號染色體上鑒定出6個抗褐飛虱基因,分別為Bph3、bph4、bph20(t)/bph25(t)、Bph25、bph29和Bph32。Bph3[13]和bph4[14]位于水稻第6號染色體短臂的同一區(qū)域,這2個基因可能緊密相連或是等位基因。從廣西野生稻上挖掘的bph20(t)/bph25(t)基因位于BYL7與BYL8標記之間,在染色體上物理距離0.47～0.53 Mbp[26]。Myint K K M等[34]在水稻品種ADR52中發(fā)現(xiàn)的抗褐飛虱Bph25基因被定位在第6號染色體S00310標記上,該標記是Bph25基因的共分離標記,位于第6號染色體物理距離0.21 Mbp處。bph29位于標記RM540和RM435之間,在第6號染色體上的物理距離為0.38～0.53 Mbp[38]。另外，據(jù)文獻報道，抗褐飛虱bph29基因含有B3結(jié)合域,能激活水楊酸信號通路,抑制茉莉酸/乙烯通路。

褐飛虱抗性基因bph21(t)/bph26(t)位于第10號染色體上。bph21(t)/bph26(t)來源于廣西野生稻,位于標記RM222和RM244之間,其在第10號染色體上的物理距離為2.62～5.00 Mbp[30]。

褐飛虱抗性基因Bph28位于第11號染色體上。Bph28來源于水稻品種DV85,該基因被定位在標記Xue17處,該標記與基因Bph28共分離，位于染色體物理距離9.35 Mbp位置[37]。

在第12號染色體上定位了9個抗褐飛虱基因,即Bph1、bph2、bph7、Bph9、Bph10、Bph18(t)、bph19(t)-2、Bph21(t)和Bph26。第一個被鑒定出的抗性基因Bph1位于12號染色體的pBPH9標記處,在染色體物理距離22.86 Mbp位置[11]。bph2被定位于第12號染色體上SSR標記RM7102和RM463之間[12]。bph7位于12號染色體上RM3448和RM313之間,在染色體上的物理距離為19.95～20.87 Mbp[17]。蘇昌潮等[19]對Bph9進行了連鎖分析,發(fā)現(xiàn)Bph9基因位于水稻12號染色體的InD2和RM28466標記之間,其在染色體上的物理距離為22.85～22.97 Mbp?？购诛w虱Bph9基因在表達起作用時會編碼一種罕見核苷酸,引起細胞死亡,在水稻植株中激活水楊酸和茉莉酸信號通路,從而對褐飛虱產(chǎn)生抗性,抑制褐飛虱的取食[10]。Bph10被定位于第12號染色體上標記RM260和RM17之間[20]?？剐曰駼ph18(t)來源于澳大利亞野生稻,位于12號染色體長臂末端的標記KC1/7312和T4A(KT)之間,其位于染色體物理距離22.88 Mbp處[25]。Bph21(t)基因位于12號染色體長臂端194.0 kb的區(qū)間內(nèi),介于兩個標記RM3726和RM5479之間,在染色體上的物理距離為23.27～24.41 Mbp[29]。Bph26位于12號染色體上,其與RM5479標記共分離,在染色體上的物理距離約為24.41 Mbp[35]。

表1 已鑒定并命名的水稻抗褐飛虱抗性基因

注:“*”表示該基因已被克隆。

3 討論

3.1 抗褐飛虱基因命名混亂的問題

到目前為止,已有至少43個水稻褐飛虱基因被報道,其中38個基因已被定位,其中一些基因是緊密相連的或是等位基因。前期由于供者親本和標記方法的不同,在不同的研究機構(gòu)中鑒定出的同一基因可能存在一定的差異。例如位于水稻6號染色體上的bph20(t)與bph25(t)基因就是由于前期發(fā)現(xiàn)人和供體材料的不同,得以分別命名,后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)兩者是同一基因。位于10號染色體上的bph21(t)與bph26(t)基因,亦是這種情況。再者不同基因的命名相同現(xiàn)象也時常發(fā)生,比如位于2號和3號染色體上均有基因Bph13(t),但兩者并非同一基因,為了區(qū)分彼此,本文將其分別命名為Bph13(t)-1和Bph13(t)-2；在3號、12號染色體上的bph19(t)基因與3號、4號染色體上的bph31(t)基因也是這種情況?？购诛w虱基因命名混亂的問題給科研工作帶來了不良的影響,溝通交流時容易造成歧義,給學術交流制造障礙,也會造成財力、物力上的浪費。因此在今后抗褐飛虱基因的命名上應努力做到基因命名的標準化,實現(xiàn)命名的統(tǒng)一,以便在今后的科研工作中能夠更加快捷、有效的溝通,也有助于其他領域的科學家聯(lián)合開展工作,共享研究成果。

左邊刻度為3×106個堿基對;右側(cè)文字為標記和基因的相對位置。圖1 水稻抗褐飛虱基因在物理圖譜上的位置

3.2 抗褐飛虱基因成簇分布于染色體上

據(jù)前人研究報道,有些抗褐飛虱基因并不是隨機、無序地分布于水稻各個染色體上,這38個褐飛虱抗性基因大部分以基因簇的形式分布在水稻的不同染色體區(qū),其中在水稻4、6、12號染色體上形成了較大的基因簇。這些抗褐飛虱基因緊密連鎖,成簇狀集中排列在同一條染色體的某一特定區(qū)域。這些褐飛虱抗性基因彼此關聯(lián),相互配合,共同發(fā)揮作用。相比于褐飛虱單個抗性基因,抗褐飛虱基因簇的存在使得其基因間配合更加密切、高效,能更好地發(fā)揮其生物功能。除了這3個比較大的基因簇外,在其他染色體上也分布著比較小的基因簇。在38個已鑒定和定位的褐飛虱抗性基因中，有大量基因位于特定的基因簇中。但是這些基因簇的分布也增加了等位基因測定的難度和基因間抗性譜的差異,因此很難判斷抗褐飛虱基因簇中各個基因彼此間的差異情況。在未來,基因精細定位技術的不斷發(fā)展、基因克隆和基因間抗性譜測定的精準性提高,都將幫助我們探討抗褐飛虱基因簇中各個基因的結(jié)構(gòu)以及彼此之間的關系,明確各個抗褐飛虱基因的生物功能。

3.3 抗褐飛虱基因在育種上的應用

在常規(guī)育種中,通過有性雜交培育褐飛虱抗性品種是目前最常見也是應用最廣的方法。目前許多褐飛虱抗性品種已被培育和推廣,但是在常規(guī)育種中,還存在許多問題：一方面耗時較長,在短時間內(nèi)無法獲得好的抗性品種；另一方面隨著時間的推移,一些高抗水稻品種會出現(xiàn)抗性退化的現(xiàn)象,并且可能出現(xiàn)褐飛虱新的“生物型”,導致辛苦培育的品種失去抗性。因此,如何培育具有持久抗性的抗褐飛虱水稻品種逐漸成為當前科學家和技術人員面臨的難題。

在分子標記輔助(marker-assisted selection)以及基因工程育種方面,許多抗褐飛虱基因抗譜窄,并且具有連鎖累贅和隱性特征,使得基因的轉(zhuǎn)育效率極低[46]。目前除了基因Bph1、bph2、Bph3、Bph14和Bph15外,尚未能有效利用其他的抗褐飛虱基因[47]。有效利用已知抗性基因,繼續(xù)深入挖掘更多抗性基因,是今后分子標記育種工作的重要內(nèi)容。前人的研究結(jié)果表明,在利用分子標記輔助選擇抗褐飛虱品種時,含單個抗性基因的品種的抗性沒有含兩個或多個抗性基因的品種強,這就提醒我們今后利用分子標記輔助選擇培育抗性品種時,要有目的地聚集抗蟲基因和QTL,尋找與抗蟲基因緊密相連或分離的分子標記,盡可能多地培育包含兩個或兩個以上的抗性基因品種,增加品種的耐抗性,延緩抗蟲品種的退化時間,防止出現(xiàn)新的褐飛虱生物型[48]。當前許多優(yōu)良的褐飛虱抗性基因是在野生稻種上被發(fā)現(xiàn)挖掘的,因此,育種工作者必須充分利用野生水稻尤其是藥用野生稻,以及含有褐飛虱抗性基因的突變體植株,以此來加強對褐飛虱新抗性基因的開發(fā)挖掘。目前水稻褐飛虱的大部分抗性基因都已被定位,這大大提高了褐飛虱基因轉(zhuǎn)移的效率,有助于褐飛虱抗性基因的利用[49]。總的來說，利用分子標記對水稻育種材料進行篩選培育,能夠準確判斷其是否帶有抗褐飛虱基因,以及所帶抗性基因的類型。目前,我國已成功利用分子標記輔助選育出一批抗褐飛虱的水稻新品種,褐飛虱對水稻的危害得到了較大的控制。

如何將水稻常規(guī)育種方法和分子標記輔助選擇方法相互結(jié)合,使兩者取長補短,既能縮短育種周期,又能準確高效地篩選培育出高抗褐飛虱的品種，這是育種家們要面對的難題，也是今后研究工作的努力方向。

本研究將38個已定位的抗褐飛虱基因整合到日本晴的序列圖中，在其物理圖譜上可以找到基因的連鎖標記及其區(qū)域；通過檢索GRAMENE、RGP網(wǎng)站可以獲得連鎖標記之間的片段。水稻抗褐飛虱基因在物理圖譜上的錨定,為今后基因的精細定位、基于圖位克隆和通過分子標記輔助選擇培育新品種打下了基礎,有助于水稻抗褐飛虱基因的系統(tǒng)研究。