程瀟 劉娟娟 賈貞

摘要 [目的]掌握食品中沙門氏菌能力驗(yàn)證中可疑菌落的分離及鑒定，分析食品中沙門氏菌檢驗(yàn)過程中存在漏檢的可能性及判定方法。[方法]按照沙門氏菌能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書及GB 4789.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》的要求對(duì)編號(hào)為224號(hào)、740號(hào)、845號(hào)3份能力驗(yàn)證考核樣品進(jìn)行沙門氏菌的檢測(cè)。[結(jié)果]3份樣品中均檢出沙門氏菌，其中224號(hào)樣品中檢出沙門氏菌雙相亞利桑那亞種。[結(jié)論]3份能力驗(yàn)證樣品結(jié)果均為滿意。

關(guān)鍵詞 能力驗(yàn)證;沙門氏菌;分離鑒定

沙門氏菌是一種無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，易存在于家禽、肉及蛋等食品中，是食品中分布比較廣、危害程度嚴(yán)重的食源性致病微生物，可引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉及發(fā)熱等疾病[1]。隨著對(duì)沙門氏菌的不斷深入研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)沙門氏菌超過3 000種血清型[2]。正是由于沙門氏菌具有存在廣泛、種類繁多等特點(diǎn)，且我國(guó)每年大多數(shù)食物中毒事件都是由沙門氏菌感染引起的，所以食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)對(duì)強(qiáng)化食品安全、保障人民衛(wèi)生健康具有重要意義。

食品微生物能力驗(yàn)證是通過按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則來考察評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室是否具備從事微生物檢測(cè)能力的重要手段。因此，參加能力驗(yàn)證活動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制有著非常重要的意義[3]。目前，食品中沙門氏菌的檢測(cè)有多種方法，其中比較常用的是GB4789.4的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，此外還有酶聯(lián)免疫分析法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法、普通PCR法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、序列分析及生物飛行質(zhì)譜法等[4]。筆者比較了沙門氏菌能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書及GB 4789.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)? 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)? 沙門氏菌檢驗(yàn)》對(duì)食品中沙門氏菌能力驗(yàn)證的結(jié)果，為食品中沙門氏菌的能力驗(yàn)證提供一些參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株

沙門氏菌能力驗(yàn)證采用的標(biāo)準(zhǔn)菌株為鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）和大腸埃希氏菌（ATCC 25922）。

1.2試劑與儀器

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫酸鈉黃綠增菌液（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌（SC）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、三糖鐵（TSI）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂均使用北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品;沙門顯色培養(yǎng)基使用法國(guó)科瑪嘉產(chǎn)品，沙門氏菌屬診斷O及H血清使用寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，VIDAS SLM試劑條及VITEK 2 GN鑒定卡使用法國(guó)生物梅里埃產(chǎn)品，所有試劑均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室合格供應(yīng)方提供并在有效期內(nèi)。

移液器Eppendorf research plus（德國(guó)Eppendorf公司）、MSC1.8型生物安全柜（賽默飛世爾科技有限公司）、 恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)賓得）、5050型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋（以色列騰氏公司）、全自動(dòng)熒光免疫分析儀VIDAS（法國(guó)生物梅里埃）及全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2（法國(guó)生物梅里埃）。

1.3檢測(cè)方法

檢驗(yàn)方法主要依據(jù)沙門氏菌檢驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書以及GB 4789.4-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)? 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》的要求進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1酶聯(lián)免疫分析技術(shù)檢驗(yàn)結(jié)果

分別將224號(hào)、740號(hào)、845號(hào)3份樣品按照作業(yè)指導(dǎo)書的要求接種于BPW后置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)10、14和18 h后的增菌液接種于TTB和SC進(jìn)行選擇性增菌，每份樣品各接種3管（其中預(yù)增菌10 h樣品僅檢測(cè)1管），分別按要求放置于36℃（SC）和42℃（TTB）恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后使用全自動(dòng)熒光免疫分析儀VIDAS進(jìn)行檢測(cè)（檢測(cè)值<0.23為陰性，≥0.23為陽(yáng)性）。

由表1～3可知，740號(hào)、845號(hào)2份樣品3個(gè)重復(fù)在經(jīng)TTB和SC選擇性增菌10、14、18 h后結(jié)果均為陽(yáng)性，而224號(hào)樣品僅有1個(gè)重復(fù)在經(jīng)SC增菌14 h后為陽(yáng)性，其余結(jié)果均為陰性，造成這種現(xiàn)象可能是由于224號(hào)樣品中含有的多種干擾菌生長(zhǎng)旺盛，從而抑制了沙門氏菌的正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致沙門氏菌的含量低于儀器檢出限。此外試驗(yàn)結(jié)果表明740號(hào)和845號(hào)樣品經(jīng)TTB增菌后18 h的檢測(cè)值要高于14 h的檢測(cè)值，經(jīng)SC增菌后18 h的檢測(cè)值要低于14 h的檢測(cè)值，表明TTB相對(duì)SC而言對(duì)樣品中非沙門氏菌具有一定的抑制性。

2.2常規(guī)微生物培養(yǎng)法檢驗(yàn)結(jié)果

分別將接種于TTB和SC的增菌液用接種環(huán)轉(zhuǎn)接至BS瓊脂和沙門顯色培養(yǎng)基后，置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果（圖1），從每塊平板上至少挑取3個(gè)可疑菌落接種于TSI瓊脂，同時(shí)接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行純化并置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，最后將純化后的菌落用全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2進(jìn)行鑒定?？梢删浣?jīng)VITEK 2鑒定后顯示740號(hào)、845號(hào)樣品結(jié)果均為沙門氏菌屬（Salmonella group），224號(hào)樣品鑒定結(jié)果為沙門氏菌亞利桑那亞種（Salmonella enterica ssp. Diarizonae）。

2.3血清凝集試驗(yàn)結(jié)果

樣品分離菌的血清學(xué)分型結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，740號(hào)和845號(hào)2份考核樣品O抗原A-F多價(jià)血清和H多價(jià)血清均可正常凝集，224號(hào)樣品O抗原A-F多價(jià)血清不能正常凝集，經(jīng)過0抗原因子逐一篩查發(fā)現(xiàn)O60單因子血清可以凝集，H多價(jià)血清在經(jīng)過誘導(dǎo)后可以產(chǎn)生正常凝集反應(yīng)。

3結(jié)論與討論

結(jié)合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定結(jié)果得出，3個(gè)樣品均檢測(cè)出沙門氏菌，其中224號(hào)樣品為沙門氏菌雙相亞利桑那亞種，此次能力驗(yàn)證結(jié)論最終為滿意結(jié)果。

目前，國(guó)標(biāo)中要求做食品中沙門氏菌檢驗(yàn)增菌環(huán)節(jié)中必須使用TTB和SC 2種增菌液同時(shí)進(jìn)行增菌，在選擇性分離環(huán)節(jié)中必須同時(shí)使用BS瓊脂平板和XLD（或HE、沙門顯色平板）進(jìn)行分離。這是由于沙門氏菌具有3 000多種血清型，部分沙門氏菌具有比較特殊的生理生化特性，僅使用1種培養(yǎng)基有很大可能造成漏檢;同時(shí)有的沙門氏菌在選擇性增菌液中，生長(zhǎng)會(huì)受到一定的抑制，同時(shí)使用2種增菌液會(huì)提高檢出率。

此次能力驗(yàn)證740號(hào)和845號(hào)樣品在VIDAS上可以得出準(zhǔn)確的初篩結(jié)果，同時(shí)在BS瓊脂平板和沙門顯色平板上均能出現(xiàn)典型可疑菌落;224號(hào)樣品在使用VIDAS進(jìn)行初篩時(shí)僅有1管提示為陽(yáng)性，這可能是由于樣品中含有大量干擾菌造成沙門氏菌雙相亞利桑那亞種在增菌過程中生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致該樣品中沙門氏菌的含量低于儀器檢出限;此外該樣品在沙門顯色平板上菌落為藍(lán)色菌落，不是標(biāo)準(zhǔn)的紫紅色菌落，以上2種情況會(huì)造成對(duì)該樣品的誤判，導(dǎo)致沙門氏菌的漏檢。因此在檢測(cè)沙門氏菌時(shí)除對(duì)典型菌落進(jìn)行鑒定外，還必須挑去一些平板上的非典型菌落進(jìn)行篩查，從而避免漏檢情況的發(fā)生。

740號(hào)和845號(hào)樣品在血清凝集試驗(yàn)中O多價(jià)血清和H多價(jià)血清均可凝集，但是224號(hào)樣品O抗原A-F多價(jià)血清不凝集，由于VITEK 2提示該樣品中含有沙門氏菌雙相亞利桑那亞種，繼而使用O抗血清單因子對(duì)該純化菌落進(jìn)行逐一篩查，最終發(fā)現(xiàn)使用O60單因子血清可以獲得凝集反應(yīng)，這些非典型的特征都會(huì)造成該樣品中沙門氏菌的漏檢。通過此次沙門氏菌能力驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)個(gè)別沙門氏菌僅依靠常規(guī)經(jīng)驗(yàn)對(duì)典型可疑菌落進(jìn)行判斷是不夠的，在試驗(yàn)中還必須盡可能多地挑取非典型特征的菌落進(jìn)行生化鑒定，同時(shí)結(jié)合VITEK 2生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行判斷。

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責(zé)任編輯：鄭丹丹