劉閔豪 徐郡儡 葉 靖 李周岐 范睿深 李 龍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌 712100)

杜仲(Eucommiaulmoides)是我國(guó)特有的重要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。杜仲樹(shù)皮為傳統(tǒng)中藥材，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其主要藥用成分為木質(zhì)素、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯基丙烷、多糖、氨基酸、其他萜類和脂肪族(張京京等，2014)。此外，杜仲樹(shù)皮、樹(shù)葉及果實(shí)中含有杜仲膠(反式聚異戊二烯)，具有耐水性、耐腐蝕性、低溫塑性、良好的韌性和溶解性，在化工領(lǐng)域具有巨大的潛力(Fang，2016)。

由于木本植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)與生長(zhǎng)環(huán)境控制難等原因，傳統(tǒng)的杜仲雜交育種要經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)時(shí)間才能獲得新的品種，嚴(yán)重制約了杜仲資源的開(kāi)發(fā)利用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，組織培養(yǎng)與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)廣泛運(yùn)用于林木育種研究中，克服了傳統(tǒng)育種的不足，具有良好的前景(Girietal.，2004)。杜仲組織培養(yǎng)的研究早在20世紀(jì)80年代就開(kāi)始進(jìn)行，到目前為止，已有以子葉和下胚軸為外植體的再生體系，以及葉和腋芽的組織培養(yǎng)研究報(bào)道(張朝成，1988；Chenetal.，1995；2008；李琰等，2006；袁云香，2012)，在此基礎(chǔ)上，對(duì)愈傷組織的繼代條件進(jìn)行了研究，初步構(gòu)建了以葉片為外植體的再生體系(金曉玲等，2014)。盡管如此，杜仲組織培養(yǎng)仍存在愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率低、不定芽再生困難等問(wèn)題(劉慧敏等，2016)，這導(dǎo)致杜仲目前沒(méi)有以成熟植株組織為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系研究的報(bào)道，僅有以下胚軸為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系(趙丹等，2009；李巖等，2011)，下胚軸屬于子代材料，不能代表原優(yōu)良品種的遺傳背景(Sidorovaetal.,2017)，這一局限性嚴(yán)重制約了杜仲基因功能與遺傳改良的研究。

本研究以杜仲優(yōu)良品種‘華仲4號(hào)’成年植株葉片為材料，優(yōu)化了葉片愈傷組織的再生體系，并在此基礎(chǔ)上研究了愈傷組織對(duì)抗生素與抑菌劑的敏感性。以獲得的葉片愈傷組織受體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過(guò)正交試驗(yàn)探索不同轉(zhuǎn)化因子對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響。使用最適轉(zhuǎn)化因子組合對(duì)約200個(gè)愈傷組織進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化操作，共篩選獲得3個(gè)抗卡那霉素(Km)的抗性芽，PCR檢測(cè)證明這些抗性芽中存在NPTⅡ基因。本研究構(gòu)建的體系使得在杜仲成熟材料中進(jìn)行基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究成為可能，為杜仲基因功能的研究與定向改良奠定基礎(chǔ)，對(duì)杜仲資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

杜仲成年植株葉片采集于西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院試驗(yàn)苗圃種植的‘華仲4號(hào)’(杜蘭英等，2014)，該優(yōu)良品種于2005年從河南靈寶引種至西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)苗圃，樹(shù)齡14年。采集時(shí)間為4—5月，此時(shí)間段采集的外植體具有最低的污染率(羅麗，2009)。

遺傳轉(zhuǎn)化使用的植物表達(dá)載體為pBI121，含有該表達(dá)載體的農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105 由西北農(nóng)林科技大學(xué)劉雅莉教授惠贈(zèng)。

1.2 杜仲葉片的表面滅菌

采集的葉片在自來(lái)水中沖洗3 h，然后使用75%(V/V)酒精清洗30 s，再浸泡在5%(M/V)次氯酸鈉溶液中5 min進(jìn)行表面滅菌，消毒后用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，放在無(wú)菌濾紙上干燥，切成約0.5 cm×0.5 cm的小片備用。

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖

將切成小片的葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每瓶3到4片，葉片誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為MS + 8.1 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA。接種后在(24±2)℃的溫度下暗培養(yǎng)4天，再在光照條件下培養(yǎng)30～40天，光照周期為每日16 h，溫度為(24±2) ℃。獲得的葉片愈傷組織采用MS + 0.27 μmol·L-1NAA + 6.7 μmol·L-16-BA的繼代培養(yǎng)基(金曉玲等，2014)，繼代周期為18天。

1.4 不定芽誘導(dǎo)與復(fù)壯培養(yǎng)基的優(yōu)化

將繼代培養(yǎng)2個(gè)周期的愈傷組織接種于含不同濃度大量元素的MS(MS，3/4MS)培養(yǎng)基中，添加不同濃度的NAA(0、0.27、0.54 μmol·L-1)和6-BA(0、4.4、6.7、8.8 μmol·L-1)，培養(yǎng)3周后，統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率(誘導(dǎo)出不定芽的愈傷組織/所有愈傷組織)。將愈傷組織誘導(dǎo)的不定芽接種到含不同濃度NAA(0.054、0.27 μmol·L-1)和6-BA(4.4、8.8 μmol·L-1)的MS(MS，3/4MS)培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)壯，3周后測(cè)量不定芽伸長(zhǎng)長(zhǎng)度。每個(gè)處理50個(gè)愈傷組織，培養(yǎng)條件同1.3的光照培養(yǎng)條件，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，使用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析。

1.5 杜仲愈傷組織抑菌劑和抗生素敏感性試驗(yàn)

遺傳轉(zhuǎn)化的抗性芽選擇培養(yǎng)基以不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，抑菌劑為頭孢霉素(Cef)，篩選用的抗生素為卡那霉素(Km)。將愈傷組織分別接種于含不同濃度Cef(0、50、100、200、300 mg·L-1)和Km(0、25、50、100、200 mg·L-1)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理30塊愈傷組織，培養(yǎng)條件同1.3的光照培養(yǎng)條件。3周后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，分析愈傷組織對(duì)抑菌劑和抗生素的敏感性，以獲得最適合的選擇培養(yǎng)基。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化因子正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化體系(趙丹等，2009；李巖等，2011)和其他植物愈傷組織為受體的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Yangetal.，2010；Abdallatetal.，2011；Trivellini，2015；黃天帶等，2010；陳子龍等，2014)，本試驗(yàn)選擇了4個(gè)可能影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化效率的轉(zhuǎn)化因子(預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和乙酰丁香酮濃度)進(jìn)行研究，通過(guò)L16(45) 的正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，轉(zhuǎn)化因子的水平如表1所示。

1.7 遺傳轉(zhuǎn)化操作

將-80 ℃冰箱中保存的農(nóng)桿菌甘油菌使用接種環(huán)接種于固體LB培養(yǎng)基上劃線活化，28 ℃倒置培養(yǎng)16 h，再挑取平板上的單克隆接種于50 mL含50 mg·L-1卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r·min-1的搖床震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，直到OD600值達(dá)到0.6～0.7。將農(nóng)桿菌懸浮液在室溫下以4 000 r·min-1離心10 min收集菌體，再使用不含激素的無(wú)菌液體MS培養(yǎng)基重懸農(nóng)桿菌，重懸至OD600值達(dá)到0.6后加入不同水平濃度的乙酰丁香酮(AS)備用。

正交試驗(yàn)的每個(gè)處理均使用50塊愈傷組織，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織置于農(nóng)桿菌重懸液中進(jìn)行侵染，侵染后使用無(wú)菌濾紙吸干菌液，接種于普通的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于(24±2)℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。

1.8 GUS組織化學(xué)染色

使用GUS組織化學(xué)染色法(Jefferson，1987)檢測(cè)GUS瞬時(shí)表達(dá)效率。具體為各處理的愈傷組織在共培養(yǎng)后，置于X-Gluc染色液(GUS染色液，Solarbio)中，37 ℃染色6 h，使用90%(V/V)和70%(V/V)的酒精分別脫色24 h，以除去葉綠素。統(tǒng)計(jì)愈傷組織的染色情況，進(jìn)行染色強(qiáng)度的評(píng)級(jí)(孟妮等，2018)，并以GUS組織化學(xué)染色結(jié)果代表GUS瞬時(shí)表達(dá)效率(含藍(lán)色GUS染色位點(diǎn)愈傷組織/所有愈傷組織)，使用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并進(jìn)行方差分析。

1.9 抗性芽的篩選

使用獲得的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系對(duì)愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作，將共培養(yǎng)后愈傷組織使用CEFO水(含200 mg·L-1Cef的無(wú)菌蒸餾水)沖洗3次，再在含100 mg·L-1Cef的液體MS培養(yǎng)基中浸泡10 min脫毒，使用無(wú)菌濾紙吸干多余液體后，接種于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選獲得抗性芽，培養(yǎng)條件同1.3的光照培養(yǎng)條件。篩選出的抗性芽使用GUS組織染色法(同1.8)和PCR法進(jìn)行檢測(cè)。

1.10 抗性芽的PCR檢測(cè)

使用CTAB法從獲得的抗性芽葉片中提取總DNA，以沒(méi)有進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的不定芽葉片DNA和pBI121質(zhì)粒作為對(duì)照進(jìn)行PCR檢測(cè)。以NPTⅡ基因?yàn)闄z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)特異性引物：上游引物為5′-TCACTTCGCTCGCGGAGAA-3′，下游引物為5′-AGAGGVGATAGAGCGAGATGC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為465 bp。PCR反應(yīng)體系為：94 ℃ 3 min預(yù)變性；98 ℃變性10 s，60℃退火20 s，72 ℃延伸70 s，共30個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表1 轉(zhuǎn)化因子正交試驗(yàn)①Tab.1 Factors and levels of L16 (45) orthogonal experiments

①AS:乙酰丁香酮 Acetosyringone.

2 結(jié)果與分析

2.1 大量元素與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)杜仲葉片愈傷組織再生體系的影響

葉片接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS + 8.1 μmol·L-1NAA+ 4.4 μmol·L-16-BA)上培養(yǎng)25天左右，葉片逐漸膨大，并在切口處出現(xiàn)小塊愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)90%，這些愈傷組織在幾天內(nèi)迅速生長(zhǎng)(圖1a)，35天左右即需進(jìn)行繼代培養(yǎng)。愈傷組織接種到繼代增殖培養(yǎng)基(MS + 0.27 μmol·L-1NAA+ 6.7 μmol·L-16-BA)進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)，會(huì)在繼代培養(yǎng)20天后出現(xiàn)褐化，因此適宜的繼代培養(yǎng)周期為18～20天，胚性愈傷組織約在連續(xù)繼代培養(yǎng)2次后形成(圖1b)，能夠進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。這些試驗(yàn)結(jié)果與金曉玲等(2014)的研究結(jié)果相似。

不定芽誘導(dǎo)和復(fù)壯培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明：愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率受到6-BA和NAA配比的影響，當(dāng)6-BA與NAA濃度比為16∶1時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率最高。此外，3/4濃度大量元素的MS培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率更高。在3/4MS + 0.27 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA的培養(yǎng)基上，不定芽誘導(dǎo)率最高(83%±10%)，并且誘導(dǎo)的芽更加健康(圖1c)。不定芽復(fù)壯的結(jié)果與不定芽誘導(dǎo)的結(jié)果相似，不定芽的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度受大量元素濃度影響更顯著，在3/4MS + 0.054 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-1的6-BA的培養(yǎng)基中芽伸長(zhǎng)長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為(2.47±1.33) cm(圖1d)。

2.2 頭孢霉素與卡那霉素對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

抑菌劑與抗生素敏感性試驗(yàn)(表3)表明：在含有300 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Km的MS培養(yǎng)基上，愈傷組織仍呈黃褐色，但是無(wú)法誘導(dǎo)不定芽；在含400 mg·L-1Cef和70 mg·L-1Km的MS培養(yǎng)基上，愈傷組織則完全褐化死亡。因此，遺傳轉(zhuǎn)化的選擇培養(yǎng)基中，抑菌劑頭孢霉素的濃度為200 mg·L-1，能抑菌并不會(huì)對(duì)愈傷組織產(chǎn)生過(guò)大影響；篩選用的抗生素卡那霉素濃度為70 mg·L-1，能夠?qū)е虏缓琄m抗性的野生型愈傷組織死亡，從而篩選出有Km抗性的抗性芽。

圖1 杜仲葉片誘導(dǎo)愈傷組織及其再生過(guò)程Fig.1 Callus induction and plant regeneration in E.ulmoidesa.葉片在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS + 8.1 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA)上培養(yǎng)5周形成的愈傷組織；b.在繼代增殖培養(yǎng)基(MS + 0.27 μmol·L-1 NAA + 6.7 μmol·L-1 6-BA)上繼代培養(yǎng)2個(gè)周期的愈傷組織；c.愈傷組織在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(3/4MS + 0.27 μmol·L-1 NAA + 4.4 μmol·L-1 6-BA)上培養(yǎng)2周誘導(dǎo)的不定芽；d.在不定芽復(fù)壯培養(yǎng)基(3/4MS + 0.054 μmol·L-1 NAA + 4.4 μmol·L-1)上復(fù)壯2周的不定芽；e.在不定芽復(fù)壯培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2次獲得的植株。a.Callus induction on callus induction medium (MS with 8.1 μmol·L-1 NAA and 4.4 μmol·L-1 6-BA) after 5 weeks;b.Callus multiplication on callus subculture medium (MS with 0.27 μmol·L-1 NAA and 6.7 μmol·L-1 6-BA) after sub-cultured twice;c.Adventitious bud induction on shoot induction medium (3/4MS with 0.27 μmol·L-1 NAA and 4.4 μmol·L-16-BA) after 2 weeks;d.Shoot multiplication on shoot regeneration medium (3/4MS with 0.054 μmol·L-1 NAA and 4.4 μmol·L-1 6-BA) after 2 weeks;e.Plants on shoot regeneration medium after sub-cultured twice.

表2 不同濃度的大量元素、NAA、6-BA對(duì)杜仲不定芽誘導(dǎo)和復(fù)壯的影響①Tab.2 Effect of different concentrations of macro-element,NAA and 6-BA on shoot induction and regeneration

①SD表示來(lái)自3次試驗(yàn)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)后的小寫字母表示使用Tukey (P≤0.05)均值差異顯著性檢驗(yàn)所劃分的差異顯著性。Data represent means ± SD from 3 biological replicates.Means followed by different letters are signicantly different using a Tukey test (P≤0.05).

表3 頭孢霉素(Cef)與卡那霉素(Km)對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of different concentrations of Cef and Km on shoot induction

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化因子

通過(guò)L16(45)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，共進(jìn)行了16組不同水平處理的轉(zhuǎn)化因子組合試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明：GUS瞬時(shí)表達(dá)率高的處理組合其愈傷組織染色程度(圖2)也更強(qiáng)(表4)，其中侵染時(shí)間與共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率有顯著影響(P≤0.05)，即侵染時(shí)間與共培養(yǎng)時(shí)間顯著影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化效率，而AS濃度和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的影響不顯著(表5)。比較均值可以發(fā)現(xiàn)GUS瞬時(shí)表達(dá)率隨著侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間的增加以“S形”曲線上升(侵染時(shí)間的GUS瞬時(shí)表達(dá)率均值為：6 min 22.0%、8 min 16.0%、10 min 35.0%、15 min 33.8%；共培養(yǎng)時(shí)間的GUS瞬時(shí)表達(dá)率均值為：1天10.8%、2天16.5%、3天38.5%、4天41.0%)，侵染10 min和共培養(yǎng)3天的GUS瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到了高值；4天的共培養(yǎng)時(shí)間雖然瞬時(shí)表達(dá)率均值更高，但提升較小并且對(duì)愈傷組織傷害較大。此外，雖然預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率沒(méi)有顯著影響，但預(yù)培養(yǎng)5天的GUS瞬時(shí)表達(dá)率均值高于其他預(yù)培養(yǎng)時(shí)間(預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的GUS瞬時(shí)表達(dá)率均值為：0天24.0%、2天17.8%、5天37.5%、10天27.5%)。根據(jù)這些試驗(yàn)結(jié)果可以獲得農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的最佳轉(zhuǎn)化因子組合是：預(yù)培養(yǎng)5天，侵染10 min，共培養(yǎng)3天。

2.4 抗性芽的檢測(cè)

總計(jì)約200塊愈傷組織進(jìn)行了最適轉(zhuǎn)化因子組合的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，在選擇培養(yǎng)基上共獲得3個(gè)抗Km的抗性芽(圖3)。對(duì)抗性芽的葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，3個(gè)抗性芽葉片均呈藍(lán)色，而未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的愈傷組織和不定芽葉片的GUS組織化學(xué)染色均為無(wú)色(圖4)，這表明GUS基因在抗性芽中得到了表達(dá)。使用NPTⅡ基因的特異引物對(duì)抗性芽、未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的不定芽葉片和pBI121質(zhì)粒的PCR分析(圖5)表明：在抗性植株和pBI121質(zhì)粒中檢測(cè)到NPTⅡ基因的465 bp擴(kuò)增產(chǎn)物，而在未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的不定芽葉片中沒(méi)有該擴(kuò)增產(chǎn)物。GUS檢驗(yàn)與PCR分析初步證明T-DNA已經(jīng)整合到了這些抗性芽的基因組中。

圖2 愈傷組織GUS組織化學(xué)染色評(píng)級(jí)模式Fig.2 Pattern of scoring for the histochemical GUS assay of callusa.空白對(duì)照；b.未染色；c.+(染色程度淺)；d.++(染色程度中等)；e.+++(染色程度強(qiáng))。a.Blank control;b.Unstained;c.+(staining is shallow);d.++(staining moderate);e.+++(staining the strongest).

表4 轉(zhuǎn)化因子正交試驗(yàn)的GUS瞬時(shí)表達(dá)①Tab.4 Transient GUS expression in L16 (45) matrix of factors of genetic transformation

① +、++和+++分別表示染色程度淺、中等和強(qiáng)的愈傷組織染色率(圖2)。+,++,and +++ indicate the staining rate of the callus with a light,medium and strong level(Fig.2).

表5 轉(zhuǎn)化因子正交試驗(yàn)GUS瞬時(shí)表達(dá)的方差分析①Tab.5 ANOVA of transient GUS expression frequency in L16 (45) matrix of factors of genetic transformation

①*:差異顯著Significant difference(P<0.05).

圖3 抗Km的抗性芽Fig.3 Km-resistant budsa,b,c.愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周誘導(dǎo)出的3個(gè)抗性不定芽。a,b,c.A total of 3 Km-resistant buds induced on the selection medium (3/4MS + 0.054 μmol·L-1 NAA + 4.4 μmol·L-1 6-BA + 200 mg·L-1 Cef + 70 mg·L-1 Km) after 2 weeks.

圖4 愈傷組織和抗性芽葉片的GUS組織化學(xué)染色Fig.4 Transient GUS expression of callus and leaf tissues of Km-resistant budsa,c.對(duì)照組(未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作)愈傷組織和不定芽葉片的GUS組織化學(xué)染色；b.最適轉(zhuǎn)化因子組合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織的GUS組織化學(xué)染色；d.抗Km的抗性芽的GUS組織化學(xué)染色。a,c.GUS expression in callus and leaf tissues of controls (untransformed plants);b.GUS expression in callus of optimum transforming factors combination:pre-culture duration of 5 days,infection duration of 10 min and co-culture condition of 3 days;d.GUS expression in leaves of Km-resistant buds.

圖5 抗性芽、未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的不定芽葉片和pBI121質(zhì)粒的PCR分析Fig.5 PCR analysis of putative transformants, binary vector pBI121 and controlsp:pBI121質(zhì)粒;c:未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的不定芽葉片;1,2,3:獲得的3個(gè)抗性芽。p:Binary vector pBI121;c:Untransformed plant;1,2,3:Putative transformants.

3 討論

本研究?jī)?yōu)化了杜仲葉片愈傷組織的再生體系，對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化因子進(jìn)行了研究。長(zhǎng)期以來(lái)，杜仲只有一種以下胚軸為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系(趙丹等，2009；李巖等，2011)，下胚軸為子代材料，無(wú)法代表該優(yōu)良品種的遺傳背景(Sidorovaetal.，2017)。如今，這一缺點(diǎn)可以通過(guò)使用成年杜仲葉片愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化體系來(lái)克服。

構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，建立受體系統(tǒng)的再生體系是前提條件(Gorpenchenkoetal.，2006)。本研究分析了NAA和6-BA對(duì)杜仲愈傷組織誘導(dǎo)不定芽以及不定芽復(fù)壯的影響，其結(jié)果與金曉玲等(2014)的研究結(jié)果相似；此外，本研究還發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基只添加3/4濃度的大量元素對(duì)杜仲葉片愈傷組織誘導(dǎo)不定芽以及不定芽的復(fù)壯有顯著的促進(jìn)作用。植物組織培養(yǎng)中，大量元素濃度是重要的影響因素之一，然而由于大部分試驗(yàn)中均使用MS培養(yǎng)基，大量元素濃度對(duì)杜仲再生體系的影響被忽視。一些研究表明，大量元素濃度能夠顯著影響不定芽的培養(yǎng)(Azadietal.，2010；Zhaoetal.，2014；周新華等，2017)，甚至影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率(Naiketal.，2011)。其原因可能是大量元素的減少使得培養(yǎng)基中鹽濃度降低，促使酚的代謝減少，大大減輕褐化現(xiàn)象，而褐化是愈傷組織繼代培養(yǎng)和不定芽誘導(dǎo)最主要的干擾因素之一。此外，早在1980年，Lloyd和McCown就發(fā)現(xiàn)山月桂(Kalmialatifolia)的莖尖培養(yǎng)更適合于低鹽培養(yǎng)基，從而開(kāi)發(fā)了WPM(woody plant medium)木本植物培養(yǎng)基(Lloydetal.，1980)。本研究的結(jié)果也表明，杜仲更加適合于低鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這一結(jié)果值得進(jìn)一步研究。

考慮到多因素研究的復(fù)雜性，本研究采用了正交試驗(yàn)研究4種轉(zhuǎn)化因子(預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、AS濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)條件)對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響。結(jié)果表明侵染時(shí)間和共培養(yǎng)條件是影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素，而AS濃度和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其影響不明顯。與其他植物相同，侵染時(shí)間對(duì)杜仲愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，較長(zhǎng)的時(shí)間能夠提高轉(zhuǎn)化效率。在本研究中，10 min的侵染時(shí)間達(dá)到了最高的GUS瞬時(shí)表達(dá)率并且有較低的愈傷組織死亡率，這一侵染時(shí)間與杜仲的下胚軸轉(zhuǎn)化體系相同，但比大部分木本植物短，這可能是由于杜仲對(duì)農(nóng)桿菌EHA105有更高的敏感性(李巖等，2011)。較長(zhǎng)的共培養(yǎng)時(shí)間則有利于農(nóng)桿菌將T-DNA轉(zhuǎn)化到植物基因組中(Kondoetal.，2000)。不過(guò)，本研究的結(jié)果表明，4天共培養(yǎng)時(shí)間的GUS瞬時(shí)表達(dá)率均值雖高于3天，但提升較小并且對(duì)愈傷組織傷害較大，一些其他植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究結(jié)果表明共培養(yǎng)時(shí)間不宜超過(guò)3天，長(zhǎng)期的共培養(yǎng)會(huì)使農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低(Cerveraetal.，1998；Curtisetal.，1999；Yangetal.，2010)。

本研究中獲得的3個(gè)抗性芽經(jīng)PCR分析和GUS組織化學(xué)染色檢驗(yàn)證明，T-DNA已整合到了抗性芽基因組中，表明這一遺傳轉(zhuǎn)化體系能夠?qū)⒒驅(qū)氤墒熘仓甑慕M織培養(yǎng)材料中，為杜仲基因功能與遺傳改良的研究奠定了基礎(chǔ)。在今后的研究中可以進(jìn)一步優(yōu)化不定芽復(fù)壯后的再生體系，完善整個(gè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

4 結(jié)論

本研究對(duì)杜仲以葉片為外植體的再生過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化因子進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，添加3/4大量元素濃度的MS培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)和復(fù)壯有顯著的促進(jìn)作用，愈傷組織誘導(dǎo)不定芽最適培養(yǎng)基：3/4MS + 0.27 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA，不定芽復(fù)壯的最適培養(yǎng)基：3/4MS + 0.054 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA。農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化最適合的轉(zhuǎn)化因子組合為：預(yù)培養(yǎng)5天、侵染10 min和共培養(yǎng)3天，篩選培養(yǎng)基為3/4MS + 0.054 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA+200 mg·L-1Cef + 70 mg·L-1Km。利用此體系共獲得了3個(gè)抗性芽，PCR分析和GUS組織化學(xué)染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因組中。