劉甜甜，王擎擎，姚魁武，劉友明，段錦龍

（中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053）

心肌梗死嚴(yán)重威脅人類生命健康，其發(fā)病率和病死率已居各類心血管疾病之首[1]。心肌梗死是由于冠狀動(dòng)脈閉塞引起局部心肌嚴(yán)重而持久的缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死的一種病癥[2]，其損傷機(jī)制復(fù)雜。已知心肌細(xì)胞的氧化損傷、凋亡和壞死是影響急性心肌梗死后心臟功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素[3]，因此抗氧化治療和抑制心肌凋亡對防控心肌梗死等缺血性心臟病具有重要意義。

中醫(yī)認(rèn)為心肌梗死發(fā)病多與陽微陰弦、心陽不振、瘀血滯脈有關(guān)。活血溫通方是由導(dǎo)師姚魁武教授在傳承國醫(yī)大師薛伯壽教授學(xué)術(shù)思想基礎(chǔ)上研發(fā)的中藥方劑。該方由丹參、桂枝、川芎、雞血藤、赤芍、黨參6味中藥組成，具有活血化瘀、益氣溫陽、通脈止痛的功效，臨床用于治療心肌缺血具有一定療效，但活血溫通方療效的科學(xué)機(jī)制尚未明確。本研究擬采用缺氧無血清刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，模擬體內(nèi)心肌缺血過程，驗(yàn)證活血溫通方對心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用，為防治缺血性心臟病提供選擇性藥物治療。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠10只，體質(zhì)量220～240 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：SCXK（京）2014-0004，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號：IACUC-GAMH-2019-005）。

1.2 細(xì)胞 H9c2大鼠心肌細(xì)胞（廣州吉妮歐生物科技有限公司）。

1.3 藥品和試劑 活血溫通方組成：丹參30 g，桂枝 10 g，川芎 9 g，雞血藤 10 g，赤芍 10 g，黨參 10 g，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥房經(jīng)提取、濃縮制成顆粒劑。DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，批號8119034），活性氧（ROS）檢測熒光探針-DHE（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司），噻唑藍(lán)（MTT）（Solarbio，批號1123A0510），細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)，批號022519190320），Caspase3活性測定試劑盒（Solarbio，批號 20190404），Caspase 8活性測定試劑盒（Solarbio，批號20190404），丙二醛（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號20190401），過氧化氫酶（CAT）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號20190402），超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號20190313）。

1.4 儀器 SpectraMax M2型酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國），化學(xué)發(fā)光凝膠成像FluorChemTMFC3 system（Protein Simple，美國），二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國），低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國），eppendorf高速冷凍離心機(jī)，臺(tái)式恒溫振蕩器（太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），Leica DM 2LLED倒置顯微鏡，Nicon TI-U倒置熒光顯微鏡。

2 方法

2.1 含藥血清制備 Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組和活血溫通方組，每組5只。活血溫通方組按840mg/kg劑量灌胃（按人體表面積折算的等效劑量），空白組給予等體積純水灌胃，每日2次，連續(xù)灌胃5 d。于末次灌胃1 h后，采用6%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min，離心15 min，取上清，經(jīng)滅活和0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，將含藥血清及空白血清保存于-80℃冰箱，備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基配置終濃度為10%的含藥血清。

2.2 細(xì)胞缺氧模型建立及分組 接種合適密度的H9c2心肌細(xì)胞于DMEM高糖完全培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液），然后將培養(yǎng)好的H9c2用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗2次，培養(yǎng)于Hanks buffer緩沖液中（無胎牛血清），缺氧組（給予空白血清）和活血溫通方組（給予活血溫通方血清）的H9c2置于37℃低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h（95%N2，5%CO2），對照組的H9c2置于 37℃常氧培養(yǎng)箱中（95%O2，5%CO2）培養(yǎng)相同的時(shí)間。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 細(xì)胞活力測定 使用MTT法評價(jià)細(xì)胞活力情況。采用0.25%胰酶消化不同組細(xì)胞，按每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，于37℃，5%CO2孵箱中孵育，同時(shí)加 MTT 溶液（5mg/mL）20μL，再孵育 4 h，然后棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處A值。計(jì)算公式如下：細(xì)胞活力（%）=（A處理組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

2.3.2 Caspase活性測定 收集細(xì)胞蛋白，測定細(xì)胞裂解液中Caspase 3和Caspase 8活性，按試劑盒說明書進(jìn)行測定。

2.3.3 抗氧化酶活性和MDA含量測定 收集細(xì)胞蛋白裂解液評價(jià)SOD、CAT活性及MDA含量的改變，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.3.4 活性氧ROS檢測 利用熒光探針二氫乙啶（DHE）檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的產(chǎn)生。接種合適密度心肌細(xì)胞于6孔板內(nèi)，用PBS洗滌細(xì)胞，在含5 μmol/L DHE的PBS中37℃孵育30 min。然后，用PBS再次清洗細(xì)胞，于倒置熒光顯微鏡觀察各組紅色細(xì)胞核數(shù)目改變，觀察各組心肌細(xì)胞ROS含量。

2.3.5 細(xì)胞凋亡檢測 接種合適密度心肌細(xì)胞于12孔板內(nèi)，細(xì)胞融合約80%進(jìn)行Hoechst染色，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，觀察各組心肌細(xì)胞凋亡情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心肌細(xì)胞活力 與對照組相比，缺氧組H9c2細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05）。而與缺氧組比較，活血溫通方含藥血清組細(xì)胞活力明顯上升（P＜0.01）?；钛獪赝ǚ綄θ毖鮄9c2細(xì)胞活力的影響。見表1。

3.2 Caspase 3和Caspase 8活性 與對照組相比，缺氧組H9c2細(xì)胞中Caspase 3和Caspase 8活性顯著升高（P＜0.01）。與缺氧組相比，活血溫通方含藥血清組中細(xì)胞Caspase 3和Caspase 8活性顯著降低（P＜0.01）。活血溫通方對缺氧H9c2細(xì)胞Caspase活性的影響。見表1。

表1 活血溫通方對缺氧H9c2細(xì)胞活力、Caspase 3和Caspase 8 活性的影響（±s）Tab.1 Effects of Huoxue Wentong Formula on cell viability，Caspase 3 and Caspase 8 activities in hypoxic H9c2 cells（±s）

表1 活血溫通方對缺氧H9c2細(xì)胞活力、Caspase 3和Caspase 8 活性的影響（±s）Tab.1 Effects of Huoxue Wentong Formula on cell viability，Caspase 3 and Caspase 8 activities in hypoxic H9c2 cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與缺氧組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別對照組缺氧組活血溫通方組細(xì)胞皿數(shù)Caspase 8（mmol/mg）100.00± 9.82 3.32±0.25 8.24±0.80 68.35±10.19* 7.16±1.48* 11.39±2.04*84.60±15.38# 3.23±0.38## 7.97±1.96##細(xì)胞活力（%）Caspase 3（mmol/mg）6 6 6

3.3 心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目 對照組心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常藍(lán)色，而缺氧會(huì)導(dǎo)致H9c2細(xì)胞凋亡，所以Hoechst染色后，缺氧組多數(shù)細(xì)胞核會(huì)呈現(xiàn)致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白（白色箭頭指示）。與缺氧組比較，活血溫通方組的濃染細(xì)胞核數(shù)目明顯減少，多數(shù)細(xì)胞核呈正常藍(lán)色。見圖1。

3.4 活性氧ROS表達(dá) DHE是反映活性氧ROS含量的指標(biāo)，采用DHE染色可使被ROS氧化的細(xì)胞核呈現(xiàn)明亮的紅色熒光。與對照組比較，缺氧組心肌細(xì)胞中紅色熒光細(xì)胞核數(shù)目顯著增多，而與缺氧組相比，活血溫通方組的細(xì)胞核呈紅色熒光的數(shù)目明顯減少，見圖2。

圖1 活血溫通方對缺氧H9c2細(xì)胞凋亡的影響（Hoechst染色，×200）Fig.1 Effect of Huoxue Wentong Formula on apoptosis in hypoxic H9c2 cells(Hoechst staining，×200)

圖2 活血溫通方對缺氧H9c2細(xì)胞ROS的影響（DHE 染色，×200）Fig.2 Effect of Huoxue Wentong Formula on ROS in hypoxic H9c2 cells(DHE staining，×200)

3.5 抗氧化酶含量 與對照組相比，缺氧組H9c2細(xì)胞中 SOD、CAT 活性明顯降低（P＜0.01），而 MDA含量顯著增加（P＜0.01）。與缺氧組相比，活血溫通方組細(xì)胞中 SOD、CAT 活性明顯回升（P＜0.01），同時(shí)MDA含量顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 活血溫通方對缺氧H9c2細(xì)胞SOD、CAT、MDA含量的影響（±s）Tab.2 Effects of Huoxue Wentong Formula on contents of SOD，CAT，MDA in hypoxic H9c2 cells（±s）

表2 活血溫通方對缺氧H9c2細(xì)胞SOD、CAT、MDA含量的影響（±s）Tab.2 Effects of Huoxue Wentong Formula on contents of SOD，CAT，MDA in hypoxic H9c2 cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與缺氧組比較，#P＜0.01。

組別 細(xì)胞皿數(shù)對照組缺氧組活血溫通方組6 6 6 SOD（U/mg）20.40±1.77 4.51±1.07*9.50±2.73#CAT（U/mg）46.46±8.30 7.87±2.37*41.74±13.73#MDA（nmol/mg）14.24±1.82 31.05±5.01*16.96±1.92#

4 討論

心肌細(xì)胞氧化損傷、壞死和凋亡參與了缺血性心臟病的發(fā)展進(jìn)程，包括冠心病、心絞痛、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷和心力衰竭等[2]。因此，最大程度減輕氧化損傷和抑制心肌凋亡已成為治療缺血性心臟病的潛在新策略。研究結(jié)果顯示活血溫通方可以通過增加細(xì)胞活力、抑制心肌細(xì)胞凋亡，并且增強(qiáng)抗氧化酶活性，減輕過氧化損傷，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧損傷。

凋亡是組織細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和器官發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，在心肌梗死過程中，心肌細(xì)胞凋亡是造成心肌損傷和功能障礙的重要因素之一[4]。因此，心肌細(xì)胞凋亡作為基本的病理變化在心肌損傷中發(fā)揮著重要的作用。以往的研究表明，缺氧可引起過氧化物累積，激活Caspase 3，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[5-6]。細(xì)胞凋亡的特征是染色質(zhì)凝聚、DNA斷裂和蛋白質(zhì)分解[7]。目前已知有2個(gè)經(jīng)典的凋亡信號傳導(dǎo)通路，即外源性膜受體調(diào)節(jié)凋亡通路和內(nèi)源性線粒體調(diào)節(jié)凋亡通路，這2條通路均存在于心肌細(xì)胞凋亡過程中。一方面，與死亡受體配體（如Fas）相互作用導(dǎo)致Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（Fadd）形成，進(jìn)一步激活Caspase 8活性，然后再激活Caspase 3，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡，這是外源性凋亡通路。另一方面，凋亡信號引起線粒體激活，然后釋放線粒體膜空間蛋白形成凋亡小體，并激活Caspase 9，最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡，這是內(nèi)源性凋亡通路[8]。因此，明確心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制有助于尋找合適的治療藥物，從而減少缺血性心臟病的發(fā)病率和致死率。研究證實(shí)了活血溫通方可以通過降低Caspase 3和Caspase 8活性而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激反應(yīng)與心肌細(xì)胞損傷密切相關(guān)，是缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[9]。氧化應(yīng)激包括氧化產(chǎn)物生成的增加和抗氧化酶活性的降低。心肌損傷可由ROS引起，正常情況下，體內(nèi)產(chǎn)生的少量ROS能被清除，但是ROS生成過多，機(jī)體不能及時(shí)有效清除，長期貯存體內(nèi)能與脫氧核糖核酸（DNA）、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致過氧化損傷[10-11]。因此，抗氧化治療對于減輕心肌損傷至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明，通過提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT活性，抑制ROS的產(chǎn)生和MDA的生成，活血溫通方可以有效抵抗缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

中醫(yī)認(rèn)為陽微陰弦是缺血性心臟病發(fā)病的基本病機(jī)，心陽不振，陰邪瘀阻，生物學(xué)機(jī)制上可見氧化損傷、壞死和凋亡?；钛獪赝ǚ结槍θ毖孕呐K病陽微陰弦病機(jī)，結(jié)合臨證經(jīng)驗(yàn)組方，具有抗心肌缺血的功效。研究結(jié)果顯示心肌細(xì)胞缺氧之后，細(xì)胞活力降低，凋亡增加，抗氧化酶活性降低，ROS增加，致使心肌細(xì)胞損傷加重。活血溫通方能增加細(xì)胞活力，抑制凋亡發(fā)生，增強(qiáng)抗氧化酶活力，減輕活性氧產(chǎn)生，顯示活血溫通方具有保護(hù)心肌缺氧損傷的作用。活血溫通方活血化瘀、益氣溫陽、通脈止痛，通過抑制細(xì)胞凋亡和減輕氧化損傷，提高機(jī)體抗氧化酶活力阻斷心肌缺氧損傷進(jìn)程，為進(jìn)一步研究活血溫通方的保護(hù)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。