李佩華，彭正松，趙 歡，周曉利，林 巧，鄧 迪

（1.西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615013；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充 637002）

食物過敏是指人們食用某種食物后出現(xiàn)皮膚瘙癢等不良反應(yīng)，是一種對(duì)食物中抗原分子產(chǎn)生的不良免疫介導(dǎo)反應(yīng)，主要由IgE（immunoglobulin E，免疫球蛋白 E）介導(dǎo)[1]，即通過IgE 使抗體和抗原結(jié)合。約1%～3%的成年人及5%～8%的兒童對(duì)一種或多種食物過敏[2]。乳糜瀉（celiac disease，CD）是病人因攝入來自小麥的麩質(zhì)蛋白而誘發(fā)T 細(xì)胞介導(dǎo)的慢性腸炎，是一種特殊的過敏癥狀[3]。典型的乳糜瀉臨床癥狀包括腸黏膜損害和繼發(fā)的吸收不良，伴有頑固的腹瀉、體重下降、營養(yǎng)不良、骨質(zhì)疏松、貧血、乏力、手足抽搐等。由于人體胃蛋白酶、胰蛋白酶和小腸刷狀緣酶缺乏脯氨酸內(nèi)切酶活性，導(dǎo)致富含脯氨酸和谷氨酰胺的小麥麩質(zhì)蛋白不能被完全消化，形成的長(zhǎng)蛋白肽段聚集在小腸上皮細(xì)胞[4]，誘發(fā)易感人群產(chǎn)生過敏性免疫反應(yīng)[5]。小麥麩質(zhì)蛋白包括谷蛋白（高分子量谷蛋白和低分子量谷蛋白）和醇溶蛋白，其中醇溶蛋白是乳糜瀉的主要致敏蛋白[6]。

馬鈴薯是世界上繼小麥、玉米和水稻之后的第四大糧食作物，其儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)富含多種人體必需的氨基酸, 因此馬鈴薯對(duì)改善人們的膳食營養(yǎng)結(jié)構(gòu)非常重要[7]。但馬鈴薯塊莖中是否存在可引起乳糜瀉的麩質(zhì)蛋白，目前尚無相關(guān)的報(bào)道。

本研究利用小麥麩質(zhì)蛋白的提取液提取馬鈴薯塊莖的蛋白，利用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目標(biāo)蛋白，然后切膠收集目標(biāo)蛋白，酶切后用質(zhì)譜鑒定蛋白種類，通過相似性比對(duì)鑒定包含乳糜瀉多肽的馬鈴薯蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

供試馬鈴薯（品種）“西芋3 號(hào)”由西昌學(xué)院馬鈴薯重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 馬鈴薯塊莖醇溶性蛋白的提取

將新鮮馬鈴薯薯塊研磨成細(xì)粉，取約30 mg 放入1.5 mL 離心管中，加小麥麩質(zhì)蛋白提取液[8]90 mL，振蕩器上充分混勻，95 ℃水浴 5 min，3 000 r/min 離心5 min，取上清液以普通小麥材料“中國春”為對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE 分析（見圖1）。

SDS-PAGE 方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行：10%的丙烯酰胺分離膠含 1 mL 40% Acr、0.52 mL 2% Bis、1 mL Resolving gel、0.09 mL 10%（W/V）過硫酸胺、4.2 μL TEMED、5.2mL H2O；3%的丙烯酰胺濃縮膠含0.375 mL 40% Acr、0.2 mL 2% Bis、0.62 mL Stacking gel 緩沖液、0.04 mL 10% SDS（W/V）、0.05 mL 10%（W/V）過硫酸胺、5 μL TEMED、3.7 mL H2O。

1.3 目的蛋白的質(zhì)譜分析

真空干燥回收的蛋白膠塊，然后用胰蛋白酶膠內(nèi)水解蛋白成多肽，參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行LTQ-質(zhì)譜檢測(cè)（Thermo Finnigan；中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所蛋白質(zhì)研究分析中心）。使用BIOWORKS 軟件搜索NCBI 的Solanum tuberosum 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/peptidome），查找與質(zhì)譜多肽相對(duì)應(yīng)的馬鈴薯蛋白，構(gòu)建本地馬鈴薯醇溶性蛋白數(shù)據(jù)庫。檢測(cè)參數(shù)為：當(dāng) Charge+1，Xcorr≥1.9；當(dāng) Charge+2，Xcorr≥2.2；當(dāng) Charge+3，Xcorr≥3.75；其中 DelCN≥0.1。

1.4 生物信息學(xué)分析

采用GO miner 軟件對(duì)蛋白進(jìn)行基因本體（Geneontology，GO）聚類分析。在 WEGO 數(shù)據(jù)庫（http：//wego.genomics.org.cn/）中進(jìn)行生物學(xué)通路分析。

1.5 馬鈴薯醇溶性致敏蛋白的鑒定

從 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載質(zhì)譜檢測(cè)到的馬鈴薯蛋白的全序列，然后通過序列比對(duì)明確這些蛋白是否含有已知的乳糜瀉多肽（見表1），具體方法如下：通過BioEdit（v7.2.5）軟件提供的本地BLAST-P 程序進(jìn)行全序列比對(duì)，根據(jù)兩者之間的序列相似性篩選潛在的馬鈴薯醇溶性致敏蛋白，設(shè)置參數(shù)期望值（E-value）為 1，矩陣（Matrix）為BLOSUM62，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE

SDS-PAGE 表明，在馬鈴薯塊莖蛋白泳道觀察到3 條與“中國春”的低分子量谷蛋白和醇溶蛋白遷移率相似的蛋白，回收這3 條蛋白條帶，胰蛋白酶水解，用于質(zhì)譜分析。

圖1 馬鈴薯品種“西芋3 號(hào)”和普通小麥“中國春”麩質(zhì)蛋白的SDS-PAGE 分析Figure 1 SDS-PAGE analysis of potato cultivar“xiyu 3”and common wheat“Chinese Spring”

2.2 馬鈴薯中致敏蛋白的識(shí)別

質(zhì)譜鑒定共檢測(cè)199 種不同的馬鈴薯蛋白（見表1）。下載這199 種蛋白的氨基酸全序列，并將其與已知的乳糜瀉多肽（見表1）進(jìn)行比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)其含有潛在的致敏多肽。

表1 已知可導(dǎo)致乳糜瀉的小麥麩質(zhì)蛋白多肽Table 1 Reported celiac disease (CD) epitopes in wheat seed storage proteins

2.3 蛋白的功能分析（GO分析）

分析199 種馬鈴薯蛋白的GO 注釋結(jié)果（見圖2），發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞（cell，GO：0005623）、細(xì)胞部分（cell part，GO：0044464）和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)組成（protein-containing，GO：0043226）的蛋白分別占 14.9%、14.9%、11.9%。在分子功能中，蛋白主要以催化功能（catalytic activity，58.4%，GO：0003824）和結(jié)合功能（binding，47.5%，GO：0005488）為主。參與生物學(xué)過程有7 個(gè)子類，其中大部分蛋白參與代謝過程（metabolic process，64.4%，GO：0008152）、其次是參與細(xì)胞過程（cellular process，41.6%，GO：0009987）和對(duì)刺激的響應(yīng)過程（response to stimulus，9.9%，GO：0050896）。

圖2 質(zhì)譜檢測(cè)到的199 種馬鈴薯蛋白的GO 分析Figure 2 GO analysis of the 199 proteins identified by mass spectrum

3 討論

2015 年初，農(nóng)業(yè)部確定了馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，這意味著馬鈴薯的種植面積將會(huì)增加，有利于保障糧食安全。主糧化意味著馬鈴薯將實(shí)現(xiàn)由副食向主食的轉(zhuǎn)變，我國居民食用馬鈴薯的人數(shù)和頻率將顯著增加，這將改善我國居民的膳食結(jié)構(gòu)。但是，部分人群可能對(duì)馬鈴薯過敏，因此有必要系統(tǒng)研究馬鈴薯的致敏原。黃靜等[20]通過生物信息學(xué)方法初步分析了馬鈴薯的致敏蛋白序列，發(fā)現(xiàn)了11 條潛在的內(nèi)源性致敏蛋白。但是，仍有必要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

乳糜瀉是一種危害嚴(yán)重的遺傳性疾病，最有效的治療方法是嚴(yán)格的無麩質(zhì)飲食[13]。但是，目前尚不清楚馬鈴薯是否含有乳糜瀉多肽。我們通過蛋白提取、純化、酶切、質(zhì)譜分析和相似性搜索，證明馬鈴薯不含有可導(dǎo)致乳糜瀉的麩質(zhì)蛋白，這為系統(tǒng)推進(jìn)馬鈴薯的主糧化安全性評(píng)價(jià)提供了必要支持。

目前已知的乳糜瀉多肽均來自小麥麩質(zhì)蛋白，尤其醇溶蛋白[3]。醇溶蛋白是一種特異溶解于70%乙醇溶液的蛋白。小麥醇溶蛋白有成熟的提取方法，已廣泛應(yīng)用于小麥的加工品質(zhì)研究[8]。本研究直接利用小麥的醇溶蛋白提取方法提取馬鈴薯的醇溶性蛋白，有利于借鑒小麥的成熟技術(shù)，保證實(shí)驗(yàn)順利開展。已報(bào)道的乳糜瀉多肽富含谷氨酰胺（Q）和脯氨酸（P）（表1），由于馬鈴薯和小麥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源蛋白的序列相似性較低，這導(dǎo)致不能排除小麥的提取液不能完全提取馬鈴薯醇溶性蛋白的可能性。因此，有必要繼續(xù)嘗試其他提取方法進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的結(jié)果。