張 愷, 支明玉, 何 藝, 朱 巖, 曾秀瓊, 壽 旦

(1.寧波大學科學技術(shù)學院, 浙江 寧波 315212; 2.杭州職業(yè)技術(shù)學院, 浙江 杭州 310018; 3.浙江大學化學系, 浙江 杭州 310028; 4.浙江省中醫(yī)藥研究院, 浙江 杭州 310007)

陽離子交換色譜(CEC)作為離子色譜(IC)的一個分支,已成為目前檢測陽離子型化合物的重要方法之一。當目標物質(zhì)的基體組成較為復(fù)雜時,陽離子交換色譜與傳統(tǒng)的原子吸收光譜法相比,是更加合適的分析方法[1]。同時,陽離子交換色譜能實現(xiàn)對不同價態(tài)的金屬離子以及有機胺類的定量分析,這也是其他陽離子檢測手段所不具備的能力。作為離子色譜的核心部件,離子交換色譜固定相一直以來受到了研究人員的廣泛關(guān)注。與陰離子交換固定相不同,用于現(xiàn)代離子色譜的陽離子交換固定相多采用羧酸、膦酸等弱酸性基團作為離子交換功能基[2-5],其所需的修飾密度較大,對接枝、涂覆工藝手段具有較高的要求。近年來離子交換色譜固定相的進展以陰離子交換固定相為主,新型陽離子交換固定相的報道比較少見,整體發(fā)展趨勢并不均衡。

“巰基-烯”點擊化學修飾方法反應(yīng)條件溫和,具有高度的選擇性和反應(yīng)效率,被廣泛應(yīng)用于親水作用色譜以及混合模式色譜等固定相的制備當中。成曉東等[6]將不同比例的氨基和巰基化硅烷偶聯(lián)劑鍵合到硅球表面,再利用巰基與乙烯基膦酸進行點擊修飾,得到正負電荷可調(diào)控的親水作用色譜固定相,應(yīng)用于多種極性化合物的分離;胡靜等[7]將半胱氨酸點擊修飾到乙烯基化580 nm粒徑硅球表面,得到亞微米親水作用色譜固定相,應(yīng)用于加壓毛細管電色譜中?！皫€基-烯”點擊化學正交性好,且易于模塊化,使之非常適合于多元功能基的修飾,用于混合模式色譜。王曉歡等通過巰基化微球和苯乙烯型極性化合物間的“巰基-烯”反應(yīng),分別制備了反相/陽離子交換[8,9]以及反相/陰離子交換[10]混合模式固定相,應(yīng)用于多種色譜分離模式,并考察了極性化合物的保留機理;呂倩楠[11]將半胱氨酸點擊修飾到聚倍半硅氧烷微球,制備得到了反相/親水作用色譜固定相,應(yīng)用于中草藥中活性成分的分離;王照地等[12]在硅膠顆粒表面分別進行C18鍵合以及C10-羧酸的點擊修飾,制備得到反相/親水作用色譜固定相實現(xiàn)了多種堿性藥物的高效分離。此外,Peng等[13]將硫代蘋果酸修飾到乙烯基硅球表面,制備得到了二元羧酸鍵合的新型弱陽離子交換固定相,首次將“巰基-烯”點擊修飾方法應(yīng)用到非抑制型離子色譜當中。

二乙烯基苯型聚合微球與傳統(tǒng)的硅球和甲基丙烯酸型微球相比,能完全耐受強酸或強堿性的淋洗液,因此完全滿足現(xiàn)代抑制型離子色譜非常嚴苛的兼容性要求,具有顯著的優(yōu)勢。不過,由于這種固定相基質(zhì)的化學穩(wěn)定性很好,其化學衍生修飾方法較為有限。目前常采用傅克烷基化、?；姆椒╗14-18]對微球進行改性,再做進一步的接枝以得到離子交換填料,其反應(yīng)條件較為苛刻,步驟相對繁瑣,而且還會引入金屬離子催化劑的污染。近年來發(fā)展了惰性聚合物微球的“巰基-烯”的修飾方法[19,20]:使用含巰基的氨基化試劑在溫和的條件下處理二乙烯基苯型微球,使之表面的殘余雙鍵與巰基發(fā)生點擊反應(yīng),可以直接實現(xiàn)此類惰性聚合物微球的功能化;再通過簡單的“環(huán)氧-胺”修飾,即得到多種接枝型陰離子交換固定相。單純的“巰基-烯”修飾功能化密度較為有限,僅適用于容量較小的陰離子交換固定相。利用“巰基-烯”的自由基機理,以巰基化合物作為鏈轉(zhuǎn)移試劑進行自由基聚合,是一種較為高效的接枝手段,被應(yīng)用于硅膠基質(zhì)的反相色譜[21]以及親水作用色譜[22]固定相中。本文在聚合物微球“巰基-烯”修飾方法的基礎(chǔ)上,使用不飽和羧酸和羧酸酐作為單體,巰基磺酸為改性劑,在乙基乙烯基苯-二乙烯基苯微球表面實現(xiàn)了“巰基-烯”聚合修飾,制備了含有羧基和磺酸基的高交換容量雙功能基陽離子交換固定相,將其應(yīng)用于離子色譜當中,對其色譜分離能力色譜以及離子保留行為進行了考察。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

ICS-3000離子色譜儀(美國Thermo Fisher公司,配備有四元梯度泵、電導(dǎo)檢測池、CSRS300陽離子抑制器以及Chromeleon v7.2色譜工作站); Vario MICRO Cube元素分析儀(德國Elementar Analysensysteme公司); ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜儀(美國Thermo Fisher公司); SU8010掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司); KQ-500DE超聲清洗機(昆山超聲儀器有限公司); SHZ-D(M)循環(huán)水真空泵(河南予華儀器制造有限公司); BAO-50A鼓風干燥箱(美國STIK公司); K-1959氣動泵(德國Knauer公司)。

2-巰基乙基磺酸鈉(MESANa, 98%)、丙烯酸(99%)、順丁烯二酸酐(99%),以及偶氮二異丁氰(AIBN, 98%)購自阿拉丁生化科技股份有限公司;甲基磺酸(MSA, 99%,購自ACROS試劑公司)用于配制色譜用淋洗液;乙腈(色譜純)購自Tedia試劑公司;實驗用水均為電阻率大于18.20 MΩ·cm的二次去離子水(GenPure Pro UV/UF超純水儀,美國Thermo Fisher公司)。色譜用標準樣品均用分析純試劑配制。

單分散聚合物微球乙基乙烯基苯-二乙烯基苯(EVB-DVB,交聯(lián)度55%,粒徑4.6 μm)通過兩步溶脹法制備,具體參考文獻[23-25]。

1.2 陽離子交換固定相的制備

1.2.1“巰基-烯”聚合修飾

以丙烯酸和順丁烯二酸酐作為聚合的單體材料,MESANa作為鏈轉(zhuǎn)移修飾改性劑對EVB-DVB微球進行“巰基-烯”點擊自由基聚合。具體制備過程如下:首先配制溶解有1.44 g丙烯酸、1.96 g順丁烯二酸酐以及0.1 g AIBN的10 mL乙腈溶液作為單體溶液,以及溶解有一定量MESANa的10 mL水溶液。在30 mL玻璃反應(yīng)瓶中加入2.5 g EVB-DVB微球和單體溶液并充分混合均勻,隨后再加入MESANa水溶液并充分混合均勻?；旌弦和ǖ獨獬?超聲分散5 min并密封,隨后置于65 ℃烘箱內(nèi)反應(yīng)6 h。待反應(yīng)結(jié)束后,微球分別用乙腈、1%(v/v)MSA和純水充分洗滌,除去過量的游離聚合物,得到陽離子交換固定相,以濕餅狀態(tài)冷藏保存。若試樣需要進行表征,則取少量,用乙腈充分洗滌后在60 ℃干燥箱中烘干。

圖1 陽離子交換固定相的制備過程

如圖1所示,制得的陽離子交換固定相具有雙功能基,分別是由丙烯酸-順丁烯二酸共聚物和MESA封端殘基。其中,固定相的弱陽離子交換部分由共聚物鏈的羧基組成,強陽離子交換部分來自于共聚物鏈末端的磺酸基。通過改變MESANa的初始加入量,對固定相的強陽離子交換基團比例進行控制,以探究MESA殘基對固定相色譜性能的影響。分別制備了3種陽離子交換固定相,計作CE-1、CE-2以及CE-3。它們的MESANa初始加入量分別為丙烯酸和順丁烯二酸酐單體總量的3.8%、5.6%和7.5%(物質(zhì)的量分數(shù))。同時,還制備了對照組固定相,其中未添加巰基改性劑,計作CE-R。

1.2.2色譜柱裝填

采用勻漿法對固定相進行裝填,取約4 g(濕重)上小節(jié)中制備得到的固定相微球,分散于50 mL純水中,超聲均勻后傾入勻漿罐中;勻漿罐用純水補滿,擰緊固定后以30 mmol/L NH4Cl作為頂流液,氣動泵保持40 MPa壓力,將固定相裝入不銹鋼柱管中。除了對照組固定相采用200 mm×4.6 mm規(guī)格的柱管外,其余3種固定相均采用150 mm×4.6 mm規(guī)格的柱管。裝柱完成后,固定相用50 mmol/L MSA在1 mL/min的流速下沖洗凈化過夜,以便進行色譜性能的測試。

1.2.3色譜條件

配制不同濃度的MSA作為淋洗液,在1 mL/min的流速下進行色譜分離;進樣量為25 μL;柱溫為30 ℃。

1.2.4交換容量的測定

CSO3H=S/MS×5 000

(1)

其中S為含硫量(%),MS為硫的相對原子質(zhì)量。固定相中的氧元素可認為來源自羧基、磺酸基以及吸收的水分。以EVB-DVB微球的含氧量作為空白,排除水分帶來的干擾,則固定相的弱陽離子交換容量(μequiv/g)和固定相含硫量、含氧量滿足如下關(guān)系:

CCOOH=(O-1.5×S-OEVB-DVB)/MO×5 000

(2)

其中O和OEVB-DVB分別為固定相和EVB-DVB微球中的含氧量(%),MO為氧的相對原子質(zhì)量。EVB-DVB微球基質(zhì)和4種陽離子交換固定相的氮、碳、氫3種元素的含量由元素分析方法測定(見表1);試樣中的氧、硫兩種元素的含量比例則通過X射線光電子能譜(XPS)確定。假設(shè)固定相完全由氮、碳、氫、氧和硫5種元素構(gòu)成,可通過固定相的氧/硫比和其余元素的總含量計算出氧、硫兩種元素的含量,然后根據(jù)交換容量計算方法分別估算出固定相的強陽離子交換容量和弱陽離子交換容量(詳見表1)。

表1 陽離子交換固定相的元素含量以及估算的交換容量

EVB: ethylvinylbenzene; DVB: divinylbenzene; n.a.: not available.

圖2 固定相微球的掃描電鏡圖像

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡表征

使用掃描電子顯微鏡對EVB/DVB基質(zhì)微球和陽離子交換固定相進行表征。如圖2所示,微球的粒徑在4.6 μm左右,單分散性良好;經(jīng)“巰基-烯”聚合修飾改性后(見圖2b),微球仍保持良好的單分散性和完整性,粒徑和表面形貌均沒有發(fā)生明顯的變化,這表明離子交換功能基以非常薄的形態(tài)均勻地鍵合在微球表面。

2.2 陽離子交換容量與分離能力的對比

根據(jù)1.2.4節(jié)方法估算得到陽離子交換固定相的強、弱陽離子交換容量。根據(jù)表1, CE-1, CE-2和CE-3 3種固定相具有比較接近的弱陽離子交換容量,均為3 500 μequiv/g左右。3種固定相交換容量的差異主要體現(xiàn)在強陽離子交換容量上,隨著巰基改性劑MESANa初始加入量的增加,固定相的含硫量由0.34%遞增至0.42%,相應(yīng)的強陽離子交換容量由53 μequiv/g增加至66 μequiv/g;作為對比,對照組固定相CE-R是采用自由基聚合直接接枝的弱陽離子交換固定相,其交換容量為1 600 μequiv/g左右,不足“巰基-烯”聚合修飾的二分之一。這說明巰基改性劑MESANa不但作為強陽離子交換功能基團的載體,也能提高聚合的效率,提升固定相羧基的含量。

圖3 陽離子交換固定相的色譜圖對比

2.3 色譜性能表征與評價

2.3.17種無機陽離子的等度分離

圖4 7種無機陽離子的色譜圖

2.3.2離子保留模型

根據(jù)線性溶劑強度模型(LSSM)[26],離子在交換樹脂上的保留因子k的對數(shù)值與淋洗液中競爭離子濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系。在陽離子交換模式下,淋洗液濃度的對數(shù)值可等效為pH值,此時線性溶劑強度模型可表示為:

logk=C1+C2×pH

(3)

其中,C1、C2均為無量綱常數(shù)。相應(yīng)地,在二次項模型(QM)中,保留因子k的對數(shù)值與淋洗液pH值呈二次關(guān)系,可表示為:

logk=C1+C2×pH+C3×pH2

(4)

其中,C3為無量綱常數(shù)。

以2.3.1節(jié)中的7種陽離子為目標離子,使用上述兩種模型對3種固定相的色譜保留行為進行擬合。CE-1的線性擬合方程的相關(guān)系數(shù)(r2)為0.979 9～0.984 7; CE-2和CE-3線性擬合方程的r2均在0.99以上。如圖5所示,固定相CE-1的色譜保留行為更加符合二次項模型;固定相CE-2和CE-3的色譜保留行為則與線性溶劑強度模型符合得很好(顯然也符合二次項模型)。在陽離子交換固定相中,由于H+會抑制羧基的解離,其有效交換容量會隨著淋洗液pH值的減小而減小。由于線性強度溶劑模型是將固定相交換容量作為定值近似處理的,使之在一定程度上與固定相的真實保留產(chǎn)生偏差。在擬合實驗中,CE-1采用的是濃度較低的一組淋洗液(～15 mmol/L, pH 1.82),這與固定相的功能基的有效pKa值較為接近,因此交換容量變化程度較大,其色譜行為與線性溶劑強度模型偏離最明顯。這種現(xiàn)象也與基于IonPac CS12色譜柱的一項研究結(jié)果一致[27]。

2.3.3有機胺的色譜分離與保留行為

圖5 7種無機陽離子在固定相上的保留因子-淋洗液pH對數(shù)關(guān)系圖以及色譜模型的擬合

圖6 銨根離子、脂肪胺以及烷醇胺在CE-3上的保留因子-正辛醇/水分配系數(shù)對數(shù)關(guān)系圖

借助梯度淋洗模式,使用CE-3對7種無機陽離子和3種脂肪族胺進行分離。如圖7所示,10種陽離子均實現(xiàn)梯度分離,與等度淋洗模式相比,分離時間可縮短至24 min,顯示出這種陽離子交換固定相具有很好的應(yīng)用價值。

圖7 10種陽離子在CE-3上的梯度分離色譜圖

2.4 固定相穩(wěn)定性評價

以CE-3為例,對其連續(xù)運行超過1 200個柱體積,期間進行9次進樣,分離6種常規(guī)陽離子,考察交換容量(保留因子)、柱效(理論塔板數(shù))以及柱床(背壓)的穩(wěn)定性。6種目標離子的保留因子k和理論塔板數(shù)的RSD值分別小于0.3%和1.7%,證明了功能基具有良好的化學穩(wěn)定性;固定相色譜柱背壓變化也小于0.6%,證明了柱床良好的機械穩(wěn)定性。其余兩種固定相也能在各自的工作條件下維持穩(wěn)定的色譜性能,在數(shù)月中未見到交換容量損失和柱效降低。

3 結(jié)論

本文提出了基于“巰基-烯”聚合修飾的聚合物基質(zhì)陽離子交換固定相的制備方法。以丙烯酸和順丁烯二酸酐作為弱陽離子交換聚合單體,選用MESANa作為巰基改性劑提供強陽離子交換功能基,進行巰基參與的自由基聚合接枝,可一步得到新型雙功能基陽離子交換固定相。該固定相具有良好的色譜分離性能,使用簡單的強酸淋洗液即可完成堿金屬、堿土金屬離子的基線分離;若采取梯度淋洗模式,可在24 min內(nèi)實現(xiàn)無機陽離子和多種有機胺的高效分離。本文提出的巰基改性聚合修飾方法具有簡單、高效的特點。通過調(diào)節(jié)巰基改性劑的比例能夠?qū)崿F(xiàn)對固定相交換能力的調(diào)控,具有廣闊的應(yīng)用前景。

此外,若能在“巰基-烯”聚合修飾的基礎(chǔ)上引入非功能性的親水性單體,有望提升固定相親水性,減少功能基脂肪鏈和固定相內(nèi)核對陽離子的非特異性作用,從而改善疏水性陽離子的峰形,進一步提高固定相的柱效和分離能力。