崔華星,王寧,侯敏,許俊鋒,郭文超,安康,陳陽(yáng)輝,崔衛(wèi)東*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 烏魯木齊 830001； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,烏魯木齊 830001；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院新疆特殊環(huán)境微生物試驗(yàn)室， 烏魯木齊 830001；4.北京達(dá)農(nóng)生物科技有限公司， 北京 100043)

分枝列當(dāng)(Orobancheaegyptiaca)是多年生、兩年生或一年生肉質(zhì)寄生草本，可廣泛寄生于西瓜、甜瓜、向日葵、加工番茄等作物上，會(huì)吸收寄主養(yǎng)分、生長(zhǎng)激素和水分以維持自身生長(zhǎng)，導(dǎo)致寄主作物生長(zhǎng)緩慢、抵御病蟲(chóng)害能力降低、作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降、減產(chǎn)甚至絕收[1-2]。新疆維吾爾自治區(qū)是受分枝列當(dāng)肆虐最嚴(yán)重的地區(qū)之一，遍布南北疆各地，嚴(yán)重危害加工番茄種植加工產(chǎn)業(yè)，每年受分枝列當(dāng)影響的加工番茄種植面積約為7 000 hm2 [3]，個(gè)別地塊寄生率達(dá)100%，導(dǎo)致加工番茄絕收。

目前，分枝列當(dāng)主要防治措施有調(diào)整播期[4]、播種捕獲作物或誘捕作物[5]、土壤深耕[6]、培育抗性品種[7]、化學(xué)防治[8-9]等。然而，單一使用這些防治措施效果都不理想。調(diào)整播期和播種捕獲或誘捕作物雖然可以減輕列當(dāng)危害，但在一些地區(qū)由于氣候原因很難執(zhí)行；土壤深耕十幾年內(nèi)只能用一次，防治效果降低；培育抗性品種是防治分枝列當(dāng)?shù)挠行Т胧┲?，由于我?guó)對(duì)加工番茄抗分枝列當(dāng)品種選育的研究相對(duì)滯后，且抗性品種影響加工番茄部分指標(biāo)，形成成熟品種非常困難；化學(xué)防治不僅會(huì)污染土壤，而且劑量使用不當(dāng)也會(huì)影響寄主作物生長(zhǎng)[10]。微生物防治具有防治效果好[11]、環(huán)境友好、不易產(chǎn)生耐藥性、提高作物產(chǎn)量[12]、可在列當(dāng)出土前進(jìn)行防治[13]等特點(diǎn)，有利于發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)，越來(lái)越引起人們的重視。

生防菌是防治列當(dāng)?shù)闹匾椒ㄖ弧？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)廣泛應(yīng)用于植物病防治，并取得良好效果，但用于列當(dāng)防治的研究較少。了解枯草芽孢桿菌在大田中的代謝情況，有利于枯草芽孢桿菌對(duì)列當(dāng)?shù)姆乐螒?yīng)用。Biolog-ECO技術(shù)是根據(jù)微生物單一碳源代謝表型進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)數(shù)字化的平板圖像進(jìn)行顏色響應(yīng)來(lái)研究微生物的代謝功能多樣性[14-15]。顧美英等[16]通過(guò)Biolog-ECO技術(shù)分析不同腐爛病發(fā)病程度核桃根區(qū)土壤，發(fā)現(xiàn)腐爛病發(fā)病程度較重的土壤中微生物活性低于健康和腐爛病發(fā)病程度較輕的土壤。當(dāng)前，關(guān)于枯草芽孢桿菌在列當(dāng)田中代謝情況研究，鮮有報(bào)導(dǎo)。本研究選用枯草芽孢桿菌DNKAS菌株作為生防菌，通過(guò)皿內(nèi)種子發(fā)芽抑制試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其抗列當(dāng)性能，隨后為掌握大田中菌種施用的最佳劑量，從微生物群落系統(tǒng)功能角度，運(yùn)用Biolog-ECO 技術(shù)分析不同處理?xiàng)l件下的土壤微生物功能多樣性、碳源利用情況和微生物代謝多樣性的關(guān)系，為枯草芽孢桿菌更好地防治分枝列當(dāng)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)菌株為枯草芽孢桿菌DNKAS，由北京達(dá)農(nóng)生物科技有限公司提供；人工合成獨(dú)腳金內(nèi)酯類(lèi)似物GR24，購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司；DNKAS菌粉，由北京達(dá)農(nóng)生物科技有限公司生產(chǎn)，施用劑型為可濕性粉劑，活菌數(shù)達(dá) 1×1011CFU·g-1；黃腐酸鉀，購(gòu)自新疆雙龍腐植酸有限公司；番茄品種為‘TH1601’，由中糧吉木薩爾番茄公司提供；NA、NB和PDA培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)地點(diǎn)位于新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州吉木薩爾縣(N43°59′51″, E89°4′45″)，屬中溫帶大陸干旱氣候，冬季寒冷、夏季炎熱，降雨量少，晝夜溫差大，平均年日照時(shí)數(shù)為2 861.1 h，年平均氣溫7.0 ℃。品質(zhì)檢測(cè)所用材料為各處理的成熟加工番茄果實(shí)，所需樣品土壤采集自去除表層深10～20 cm的根際土壤，四分法采樣后放入PE袋中帶回，放入4 ℃冰箱保存，用于微生物及土壤理化性質(zhì)分析。

1.3 儀器與設(shè)備

SPX-420BF-2生化培養(yǎng)箱，上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司；1506Biolog-ECO 板和微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)，美國(guó) Biolog 公司；JP-150Y超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，無(wú)錫久平儀器有限公司；L6S分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；DFY300A搗碎機(jī)，無(wú)錫萊浦儀器設(shè)備有限公司；TD-380折射儀，上海雙旭電子有限公司；YS6060番茄紅素色差儀，深圳市三恩時(shí)科技有限公司；CT-6321 pH計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；HK2玻璃糖漿錘度計(jì), 濰坊祥意化工有限公司；MZ101體式顯微鏡，廣州市明美光電技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1皿內(nèi)芽管生長(zhǎng)抑制試驗(yàn) ①分枝列當(dāng)種子的表面消毒和預(yù)培養(yǎng)。將分枝列當(dāng)種子用質(zhì)量體積比1∶100的次氯酸鈉溶液和75%的乙醇中分別超聲清洗5.0 min。用無(wú)菌水沖洗至無(wú)色后將分枝列當(dāng)種子置于超凈工作臺(tái)自然晾干。先將直徑為8.0 mm的玻璃纖維濾紙片擺放于事先放有2層濕潤(rùn)普通定性濾紙的直徑為9.0 cm的培養(yǎng)皿中，隨后將己經(jīng)晾干的分枝列當(dāng)種子均勻撒于玻璃纖維濾紙片上，每個(gè)濾紙片上約40～70粒種子。將上述培養(yǎng)皿封口后置于25 ℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)5 d，待用。

②無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液制備。首先，將DNKAS菌株接種于NA培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h。隨后，挑取適量菌株接種至己滅菌、裝有50.0 mL NB培養(yǎng)基的200 mL三角瓶中。用培養(yǎng)膜封口后，將上述三角瓶放置于37 ℃、150 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng)，同時(shí)以不接種微生物的NB液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。振蕩培養(yǎng)18 h后，取三角瓶中的培養(yǎng)液30 mL，5 500 r·min-1離心7 min，離心后的菌液經(jīng)0.45 nm微孔濾膜過(guò)濾。過(guò)濾后瓶中的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液視為原液。將無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。

③菌體水提取液制備。離心后的菌體加無(wú)菌水至30 mL，經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎，粉碎后的菌液經(jīng)0.45 nm的微孔膜過(guò)濾視為原液，原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。

④菌體甲醇提取液制備。離心后的菌體加甲醇至30 mL, 經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎，粉碎后的菌液經(jīng)0.45 nm的微孔膜過(guò)濾視為原液，原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。

列當(dāng)芽管長(zhǎng)度用明美顯微鏡成像系統(tǒng)自帶測(cè)量軟件進(jìn)行測(cè)量。

⑤分枝列當(dāng)種子芽管萌發(fā)試驗(yàn)。萌發(fā)試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，分別為0.1 mg·L-1GR24(GR24)、無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液(CF)、菌體甲醇提取液(BM)和菌體水提取液(BW)，其中，GR24為分支列當(dāng)種子的萌發(fā)刺激物；菌體甲醇提取液為，取30 μL菌體甲醇提取液，待甲醇揮發(fā)后，加30 μL無(wú)菌水。同時(shí)，將無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液、菌體水提取液和菌體甲醇提取液分別稀釋為1、10、100、1 000倍。將一片直徑為8.0 mm的玻璃纖維濾紙片擺放于培養(yǎng)皿中，依次添加30 μL種子萌發(fā)處理液和1片己經(jīng)預(yù)培養(yǎng)好的分枝列當(dāng)種子片于上述玻璃纖維濾紙片上。培養(yǎng)皿中部放1張對(duì)折3次的濕潤(rùn)濾紙片保濕，然后將培養(yǎng)皿用封口膜封口。各處理6片重復(fù)。隨后將培養(yǎng)皿置于25 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，9 d后，用顯微鏡觀察分枝列當(dāng)種子芽管生長(zhǎng)情況。

1.4.2田間小區(qū)試驗(yàn) 設(shè)置清水對(duì)照(CK)、3 kg·hm-2DNKAS菌劑(D3)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌劑(D4.5)、6 kg·hm-2DNKAS菌劑(D6)、9 kg·hm-2DNKAS菌劑(D9)、12 kg·hm-2DNKAS菌劑(D12)、7.5 kg·hm-2黃腐酸鉀(FA-K)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌劑+7.5 kg·hm-2黃腐酸鉀(D4.5+ FA-K) 共8個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，共計(jì)27個(gè)小區(qū)，各小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列。每小區(qū)長(zhǎng)70 m，寬1.5 m，面積 105 m2。各藥劑分4次隨水滴灌，時(shí)間分別為5月6日(番茄移栽時(shí))、5月27日、6月7日、6月27日。待番茄生長(zhǎng)中期分枝列當(dāng)出土后，每小區(qū)全部采樣，調(diào)查分枝列當(dāng)發(fā)生情況，計(jì)算寄生強(qiáng)度和防效。8月12日采收時(shí)，每小區(qū)取4.5 m2測(cè)產(chǎn)。

寄生數(shù) = 鮮活分枝列當(dāng)數(shù)+枯死分枝列當(dāng)數(shù)

寄生強(qiáng)度 = 分枝列當(dāng)總株數(shù) / 被寄生的寄主株數(shù)

防治效果 =(對(duì)照寄生度-處理寄生度)/對(duì)照寄生度×100%

選擇色澤均勻、大小均一、成熟度一致的番茄紅色果實(shí)，每小區(qū)隨機(jī)取15個(gè)，每個(gè)果實(shí)縱切成4等份，各取其中的1/4放入搗碎機(jī)，以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速1 min勻漿，用于測(cè)定相關(guān)指標(biāo)?？扇苄怨绦挝锖坎捎谜凵鋬x法[17]測(cè)定；可滴定酸含量采用NaOH滴定法[18]測(cè)定；a/b色差值采用番茄紅素色差儀[19]測(cè)定；粘度采用旋轉(zhuǎn)粘度測(cè)定法[20]；pH采用pH計(jì)測(cè)定；霉菌數(shù)采用稀釋平板涂布法[21]測(cè)定。

1.4.3土壤微生物群落碳源代謝利用測(cè)定 根際土壤微生物采用Biolog-ECO微平板方法[22]進(jìn)行，并適當(dāng)調(diào)整。選取防效效果好的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理，分別稱(chēng)取各類(lèi)土樣5 g，加入到裝有50 mL滅菌的無(wú)菌水中，置于28 ℃搖床上180 r·min-1振蕩30 min，使土壤充分混勻后靜置15 min，采用梯度稀釋法將土壤懸液稀釋至1 000倍。取上述土壤稀釋液150 μL接種到生態(tài)板中，并將接種好的Biolog-ECO板放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168 h時(shí)，用Biolog鑒定系統(tǒng)測(cè)定590 nm波長(zhǎng)下的吸光度，將測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行每孔平均顏色變化率(average well color development, AWCD)分析。

AWCD=∑(Ci-R)/31

式中，Ci是每個(gè)孔的吸光度，R是板內(nèi)控制孔的吸光度。

選擇Biolog-Eco微平板培養(yǎng)120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理的培養(yǎng)土壤懸液，進(jìn)行6大類(lèi)碳源利用情況分析；同時(shí)對(duì)土壤微生物檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行微生物群落功能多樣性分析，用Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和McIntosh 指數(shù)來(lái)表征。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)預(yù)處理利用Microsoft Excel 2016，方差分析采用SPSS 19.0軟件，采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA)、Duncan法和Bonferroni法進(jìn)行多重比較分析。主成分分析、多樣性指數(shù)分析采用DPS v9.50軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)分枝列當(dāng)芽管生長(zhǎng)的影響

由表1可以看出，無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液(CF)、菌體甲醇提取液(BM)和菌體水提取液(BW)處理的分枝列當(dāng)芽長(zhǎng)均隨稀釋倍數(shù)的的升高而變長(zhǎng)，同一種處理液的原液、10倍、100倍和1 000倍處理間均差異顯著。在稀釋倍數(shù)為1×、10×和100×?xí)r，CF、BM、BW三種處理溶液間均表現(xiàn)為BW和BM的分枝列當(dāng)芽長(zhǎng)顯著高于CF，表明CF的分枝列當(dāng)芽長(zhǎng)抑制效果優(yōu)于BW和BM，稀釋倍數(shù)為1×、10×、100×的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液的分枝列當(dāng)芽長(zhǎng)抑制率分別為100%、83.85%和52.02%；稀釋倍數(shù)為1×、10×、100×的甲醇提取液的分枝列當(dāng)芽長(zhǎng)抑制率分別為83.07%、51.93%和34.19%；稀釋倍數(shù)為1×、10×和100×的水提取液的分枝列當(dāng)芽長(zhǎng)抑制率分別為72.40%、50.87%和27.81%；在稀釋倍數(shù)為1 000×?xí)r，CF、BM、BW三種處理溶液的分枝列當(dāng)芽長(zhǎng)無(wú)顯著差異，且與GR24處理間無(wú)差異顯著，即1 000×的CF、BM和BW處理對(duì)于分枝列當(dāng)芽長(zhǎng)無(wú)抑制作用。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌DNKAS可以抑制分枝列當(dāng)芽管生長(zhǎng)，其中，無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液抑制效果最好，甲醇提取液次之，水提取液最弱。進(jìn)一步證明，生防菌DNKAS對(duì)分枝列當(dāng)抑制效果最佳的物質(zhì)可能為細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物，其次是胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)，胞內(nèi)水溶性物質(zhì)抑制效果最差。

表1 不同處理的分枝列當(dāng)芽長(zhǎng)Table 1 Length of Orobanche aegyptiaca germ tube in different treatments (μm)

2.2 不同處理的小區(qū)防治效果

分枝列當(dāng)?shù)男^(qū)防治效果結(jié)果(表2)顯示，各處理均能顯著降低分枝列當(dāng)?shù)募纳鷶?shù)和寄生度，均具有良好的防治效果。其中，D12、D9、D6、D4.5、FA-K和D4.5+FA-K處理的防治效果分別為52.33%、47.89%、35.66%、28.03%、41.44%和47.22%，分枝列當(dāng)寄生數(shù)分別降低52.36%、47.92%、35.65%、24.05%、41.44%、47.24%，寄生度分別降低52.20%、47.79%、35.66%、28.30%、41.17%、47.42%；6個(gè)處理間無(wú)顯著差異。D3的防治效果為24.09%，寄生數(shù)與CK相比無(wú)顯著差異，但寄生度較CK顯著降低了24.26%。可見(jiàn)，隨著菌劑劑量的加大，分枝列當(dāng)寄生數(shù)量和寄生度均有明顯下降，防治效果有所提高。與FA-K相比，D4.5+FA-K的防治效果提高了14%，而寄生數(shù)和寄生度降低約10%，但是無(wú)顯著差異。與D4.5相比，D4.5+FA-K的防治效果顯著提高48.98%，寄生數(shù)和寄生度分別降低26.51%和26.67%，但是無(wú)顯著差異。

表2 不同處理的分枝列當(dāng)防治效果Table 2 Control effectes of Orobanche aegyptiaca in field experiment of different treatments

2.3 不同處理對(duì)小區(qū)產(chǎn)量的影響

不同處理的小區(qū)產(chǎn)量結(jié)果(圖1)表明，各處理的加工番茄小區(qū)產(chǎn)量均顯著高于CK處理，均具有增產(chǎn)效果。其中，D4.5+FA-K處理的產(chǎn)量最高，為136 665 kg·hm-2，顯著高于D3、D4.5、D6、FA-K和CK處理，但是與D9、D12沒(méi)有顯著差異。D4.5+FA-K、D9和D12三個(gè)處理的產(chǎn)量較CK分別增加60.25%、56.48%和43.52%。純菌劑處理中，D12的產(chǎn)量最高，為133 445 kg·hm-2，與D9和D6間無(wú)顯著差異。D4.5、D3和FA-K處理的產(chǎn)量雖在幾個(gè)處理中最低，但是仍顯著高于CK處理，分別比CK顯著增加31.89%、22.96%和17.68%，可見(jiàn)，番茄產(chǎn)量與菌劑施用量存在一定的正相關(guān)關(guān)系。D4.5+FA-K與 FA-K相比顯著增產(chǎn)17.26%，與D4.5相比，產(chǎn)量顯著提高21.51%，表明黃腐酸鉀和菌劑混合施用，比單一施用黃腐酸鉀效果更好。

注：不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different lowercase letters indicate statistically significant differences between different treatments at P<0.05 level.圖1 不同處理的小區(qū)產(chǎn)量Fig.1 Yield of plot in different treatments

2.4 不同處理對(duì)加工番茄果實(shí)品質(zhì)的影響

番茄果實(shí)的品質(zhì)性狀檢測(cè)結(jié)果(表3)顯示，各處理中，可溶固形物含量在4.5～5.0之間，粘稠度小于15，pH均在4.6以下，霉菌數(shù)為2，色差均大于2.0，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[23]。表明添加菌劑和黃腐酸均未對(duì)果品產(chǎn)生不良影響。

表3 不同處理的番茄品質(zhì)Table 3 Tomato quality indexes of processing tomato in different treatments

2.5 不同處理的根際土壤微生物功能多樣性

2.5.1根際土壤微生物群落的AWCD值

AWCD值越高，說(shuō)明土壤微生物群落的代謝活性越旺盛。不同時(shí)間不同處理的AWCD值結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)，5個(gè)處理的AWCD值整體隨時(shí)間推移的變化趨勢(shì)一致，在培養(yǎng)24～120 h時(shí)，呈升高趨勢(shì)，120 h時(shí)達(dá)到峰值，表明此階段的土壤微生物數(shù)處于對(duì)數(shù)期，活性增加較快，利用碳源能力強(qiáng)；培養(yǎng)120 h之后，AWCD值逐漸下降，說(shuō)明各個(gè)處理的微生物生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，并且D9、D12、FA-K和D4.5+FA-K處理的微生物數(shù)量均高于CK處理。不同處理的AWCD值存在一定差別。從0～168 h的AWCD值來(lái)看，土壤微生物群落代謝活性在120 h最高。與CK相比，D4.5+FA-K、FA-K、D12和D9處理的微生物活性依次增加了18.6%、10.2%、8.8%和3.4%。

圖2 不同處理的根際土壤微生物群落的AWCDFig.2 Microbial community AWCD of rhizosphere soil in different treatments

2.5.2根際微生物群落的碳源利用 根據(jù)不同處理AWCD值的變化情況，選擇120 h的根際土壤進(jìn)行6類(lèi)碳源的微生物利用分析，結(jié)果(圖3)顯示，D12處理的胺類(lèi)、酚酸類(lèi)、氨基酸和碳水化合物類(lèi)利用情況高于D9，然而兩處理只有氨基酸利用情況低于CK。D12多聚物和羧酸類(lèi)利用情況低于D9，但唯獨(dú)D12處理的羧酸類(lèi)利用情況低于CK。D4.5+FA-K處理的6類(lèi)碳源利用率均明顯高于FA-K，且D4.5+FA-K和FA-K處理的胺類(lèi)、酚酸類(lèi)、多聚物類(lèi)和碳水化合物類(lèi)利用情況均高于CK。D4.5+FA-K處理的羧酸類(lèi)和氨基酸利用情況高于CK，但FA-K處理的羧酸類(lèi)和氨基酸利用情況低于CK。

圖3 不同處理的根際土壤微生物群落對(duì)6類(lèi)碳源的利用占比Fig.3 Utilization percentage of 6 types carbon sources by microbial communities of rhizosphere soil in different treatments

2.5.3根際微生物群落的微生物多樣性指數(shù)

優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)是常用的群落多樣性分析指標(biāo)。優(yōu)勢(shì)度指數(shù)反映各物種的種群數(shù)量變化情況，指數(shù)越大，說(shuō)明群落內(nèi)物種數(shù)量分布越不均勻，優(yōu)勢(shì)種的地位越突出。豐富度指數(shù)用于表征微生物群落的種類(lèi)多樣性。均勻度指數(shù)用以反映土壤利用碳源種類(lèi)和程度差異，均勻度越大表明微生物種群對(duì)碳源利用差異越大。對(duì)培養(yǎng)120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理的AWCD值，進(jìn)行微生物多樣性分析，結(jié)果(表4)顯示，D12、FA-K和D4.5+FA-K處理的豐富度指數(shù)較高，顯著高于CK處理，但3個(gè)處理間無(wú)顯著差異。D9的豐富度指數(shù)與CK間無(wú)顯著差異，D4.5+FA-K的豐富度指數(shù)與FA-K無(wú)顯著差異。不同處理間的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和均勻度指數(shù)均無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，DNKAS菌劑和黃腐酸鉀均可增加根際土壤的微生物種類(lèi)，但是對(duì)于建立菌群優(yōu)勢(shì)地位和碳源的利用程度沒(méi)有影響。

表4 不同處理根際土壤的微生物多樣性指數(shù)Table 4 Microbial community diversity indexes in different treatmments

3 討論

目前，對(duì)于列當(dāng)?shù)奈⑸锓乐沃饕\(yùn)用列當(dāng)病原菌，能取得良好的防治效果。王亞嬌等[24]從感病的列當(dāng)中分離出尖孢鐮刀菌Br-2，大田試驗(yàn)顯示對(duì)彎管列當(dāng)防治率高達(dá)58.27%。吳元華等[25]將自主分離純化得到的生防鐮刀菌用于煙田列當(dāng)防治試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不僅可以推遲列當(dāng)出土?xí)r間，還能達(dá)到62.44%的防治率。對(duì)土傳病害拮抗菌進(jìn)行列當(dāng)防治的研究較少。枯草芽孢桿菌對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，具有可在植物或土壤上大量繁殖和定植、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)位點(diǎn)和空間位點(diǎn)、誘導(dǎo)抗性、促生和增產(chǎn)等特性，廣泛用于植物病害防治[26]，擁有作為列當(dāng)生防菌的潛力。阻止列當(dāng)芽管伸長(zhǎng)，是列當(dāng)防治的主要方式之一。本研究表明，枯草芽孢桿菌DNKAS的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液、菌體甲醇提取液、菌體水提取液對(duì)分枝列當(dāng)?shù)难抗苌L(zhǎng)具有顯著抑制作用。Barghouthi和Salman[27]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌QUBC16的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液可有效減少分枝列當(dāng)芽管長(zhǎng)度，與本研究結(jié)果一致。本研究中，無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液對(duì)芽管生長(zhǎng)抑制效果最佳，說(shuō)明細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物中有效物質(zhì)起主要作用。然而是何種物質(zhì)，還需進(jìn)一步探究。

列當(dāng)?shù)募纳鷶?shù)量和寄主作物產(chǎn)量是評(píng)判生防菌防治效果的關(guān)鍵指標(biāo)。已有研究表明，密旋鏈霉菌[12]和灰黃青霉[28]均可減少分枝列當(dāng)萌發(fā)率，使列當(dāng)寄生數(shù)下降，寄主作物產(chǎn)量增加。田間小區(qū)試驗(yàn)表明，枯草芽孢桿菌DNKAS通過(guò)降低分枝列當(dāng)寄生數(shù)量，使加工番茄增產(chǎn)。結(jié)合皿內(nèi)試驗(yàn)和田間小區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌DNKAS通過(guò)抑制分枝列當(dāng)芽管生長(zhǎng)，減少芽管與加工番茄根部接觸的概率，進(jìn)而降低分枝列當(dāng)出土數(shù)量，提高防治效果, 減輕分枝列當(dāng)對(duì)加工番茄寄生的影響，使加工番茄增產(chǎn)。原因除了枯草芽孢桿菌可以減輕分枝列當(dāng)?shù)奈：?，還可能與枯草芽孢桿菌具有抗病、促生作用有關(guān)?；谔镩g小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果，枯草芽孢桿菌DNKAS的單次施用量低于4.5 kg·hm-2，不能形成優(yōu)勢(shì)菌群，而高于12 kg·hm-2，菌劑成本太高，綜合考慮認(rèn)為，合理的使用劑量為9～12 kg·hm-2。為降低人工成本和時(shí)間成本，建議用隨水滴灌藥劑進(jìn)行防治。

Biolog-ECO微平板法是研究微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境影響的重要方式。研究[29]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Bs-15可使板栗土壤中微生物活性增加，顯著提高優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)。本研究的Biolog-ECO微平板試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀均可增加土壤微生物活性、碳源總利用率、微生物數(shù)量和種類(lèi)；同時(shí)，枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀枯草芽孢桿菌DNKAS的微生物豐富度指數(shù)高于CK，而優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和均勻度指數(shù)與CK無(wú)顯著差異。表明枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀均具有調(diào)整土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，使土壤中微生態(tài)功能更加趨于穩(wěn)定的功能[29-30]。

目前，黃腐酸鉀在國(guó)內(nèi)主要用于作物增產(chǎn)、提升品質(zhì)和改良土壤，本研究發(fā)現(xiàn)黃腐酸鉀可用于列當(dāng)?shù)姆乐?。研究表明，黃腐酸鉀具有促生、抗病、抗旱、提高過(guò)氧化物酶酶活等作用[31]，而根部土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變和過(guò)氧化物酶活性的升高，對(duì)列當(dāng)寄生和生長(zhǎng)有抑制作用[32]。因此，黃腐酸鉀可以減少分枝列當(dāng)?shù)募纳l(fā)生，促進(jìn)加工番茄增產(chǎn)。