趙麗華 蓮花 康曉娜 烏蘭圖雅

腦是人體對缺氧最為敏感的器官，短期不完全性缺血只引起可逆性損害，而長時間的完全缺血或嚴(yán)重缺血會引起梗死，最明顯的組織學(xué)變化是腦水腫及腦細(xì)胞壞死。腦缺血-再灌注可造成腦功能嚴(yán)重受損。參麝活絡(luò)丸是由大活絡(luò)丸加減變化而成，由麝香、紅參、熟地黃、烏梢蛇(制)、羌活、全蝎、當(dāng)歸、蘄蛇(制)、茯苓、兩頭尖、白術(shù)(炒)、草烏(制)等中藥組成，其功效為舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)豁痰。臨床可用于治療腦缺血性中風(fēng)后遺癥。臨床人擬用量為4 g生藥/d(0.058 g生藥·kg-1·d-1，按70 kg體重計算)。本文對該劑進(jìn)行了與功能主治有關(guān)的主要藥效學(xué)試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體重180～200 g，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號：SCXK(蒙)2016-0001]。大鼠于實(shí)驗(yàn)動物屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，室溫20～25℃，光照時間08∶00～20∶00。實(shí)驗(yàn)過程遵循中華人民共和國科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要試劑與儀器 (1)藥物參麝活絡(luò)丸：口服，1丸/次，3次/d，規(guī)格：3 g/丸，1 g顆粒含0.45 g生藥(湖北明和藥業(yè)有限公司，批號：20160421)。尼莫地平片：口服，1～2片/次，3次/d；規(guī)格：30 mg(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BJ33125)。(2)試劑甲苯胺藍(lán)：批號528A027，北京Solarbio科技有限公司。青霉素:華北制藥股份有限公司，批號：F7038619。多聚甲醛:批號：F20161203,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。TMS-P超敏試劑盒:批號：1612031406，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。PBS磷酸緩沖液:批號：20160722，北京Solarbio科技有限公司。枸櫞酸鈉:枸櫞酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。細(xì)胞色素C、Apaf1、Caspase-9、Caspase-3，博士德生物。DAB顯色試劑盒:福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。水合氯醛：北京市旭東化工廠，批號20000530。(3)儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱:廈門醫(yī)療電子儀器廠。Nikon130285型光電顯微鏡。數(shù)字式pH值計:上海日島科學(xué)儀器有限公司。YG-280型烤片機(jī)：陽光神琦醫(yī)用科技有限公司。ZA120R4型萬分之一天平:上海贊維衡器有限公司。YG-280KX攤片機(jī):湖北孝感市陽光神琦醫(yī)用科技有限公司。Leica切片機(jī):德國(徠卡)生產(chǎn)。

1.3 動物分組 60只SPF級SD大鼠按體重分為假手術(shù)組、模型組、參麝活絡(luò)丸低劑量組(0.37 g生藥/kg)、參麝活絡(luò)丸中劑量組(0.74 g生藥/kg)、參麝活絡(luò)丸高劑量組(1.48 g生藥/kg)、尼莫地平片組(8.10 mg/kg)，每組10只。

1.4 模型制備 采用改良Zea-Longa線栓法造成大鼠腦缺血再灌注損傷模型。先用水合氯醛(10%)腹腔注射充分麻醉，給藥體積為3.5 ml/kg，分離并結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈。從頸外動脈刺插入栓線,將栓線向內(nèi)插入(18.0±2.0)mm,于分叉處結(jié)扎，缺血100 min 后，將栓線抽離，涂青霉素粉后縫合皮膚，制備腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組切開頸部皮膚,線栓插入頸動脈，但未深入到腦中動脈[1,2]。

1.5 給藥方案 參麝活絡(luò)丸低劑量組(0.37 g生藥/kg)、參麝活絡(luò)丸中劑量組(0.74 g生藥/kg)、參麝活絡(luò)丸高劑量組(1.48 g生藥/kg)、尼莫地平片組(8.1 mg/kg)，給藥體積為10 ml/kg，1次/d，連續(xù)7 d，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積蒸水10 ml/kg。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 神經(jīng)功能評分方法:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以空白大鼠行為學(xué)參考對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，Bederson的神經(jīng)行為學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)功能缺損癥狀，0分；提尾時對側(cè)肢體屈曲內(nèi)收，1分；一側(cè)推抵抗力下降，2分；自由活動時向癱疾側(cè)劃圈，3分；意識喪失4分[3]。

1.6.2 取材及尼氏染色:神經(jīng)功能評分后，各組大鼠用水合氯醛(10%)腹腔注射充分麻醉，給藥體積為3.5 ml/kg，開腹暴露心臟，灌注針刺入左心室，右心耳剪一小孔，先用0.9%氯化鈉溶液沖洗，至肝臟變白，再用4%多聚甲醛固定液(0.01 mol/L PBS配制，pH值7.4)灌流固定。斷頭開顱取腦將視交叉平面前后2～5 mm 處冠狀切開大腦，取中間部分置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。固定后的腦組織用酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。切片進(jìn)行尼氏染色后[4]，光鏡下觀察大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)及尼氏小體改變。

1.6.3 免疫組化檢測:按試劑盒說明方法進(jìn)行免疫組化染色檢測大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞色素C(Cytochrome-C，cyt-c)、凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1，Apaf1)、半胱氨酸蛋白酶-9(Cysteine aspartic acid specific protease-9，Caspase-9)、半胱氨酸蛋白酶 -3(Cysteine aspartic acid specific protease-3，Caspase-3)表達(dá)，用ImageJ軟件對免疫組化切片400倍放大圖片進(jìn)行灰度值分析。積分光密度值IOD計算方法：IOD=log[gv0/gv)]，gv0為背景灰度值，gv為目標(biāo)區(qū)灰度值。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠Bederson的神經(jīng)行為損傷評分比較 治療前各組與假手術(shù)組神經(jīng)行為損傷評分具有顯著性差異(P<0.01)，治療后模型對照與假手術(shù)組神經(jīng)行為損傷評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各治療組比模型對照組神經(jīng)行為損傷評分均顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 6組大鼠Bederson的神經(jīng)行為損傷評分比較 n=10,分，

注：與空白組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.01;自由度(5，54)，F(xiàn)=2 628.65，F(xiàn)=1 072.93

2.2 6組大鼠腦前額葉神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果 假手術(shù)組腦前額葉神經(jīng)元清晰，細(xì)胞核圓形或橢圓形，核仁清晰，胞漿染色均勻，包漿內(nèi)可見豐富的尼氏小體；模型組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，部分神經(jīng)元胞體皺縮，胞漿內(nèi)尼氏小體減少，核仁消失。參麝活絡(luò)丸組及陽性對照組大鼠腦前額葉神經(jīng)元病理改變減輕，與模型組比較有明顯改善。見圖1。

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圖1 大鼠腦前額葉神經(jīng)元顯微圖(尼氏染色×200)；A 假手術(shù)組；B 模型組；C 參麝活絡(luò)丸低劑量組；D 參麝活絡(luò)丸低劑量組；E 參麝活絡(luò)丸低劑量組；F 尼莫地平片組

2.3 6組大鼠腦前額葉神經(jīng)元cyt-c和Apaf1的表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較模型對照組cyt-c、Apaf1表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與模型對照組比較參麝活絡(luò)丸低劑量組、參麝活絡(luò)丸中劑量組、參麝活絡(luò)丸高劑量組cyt-c、Apaf1表達(dá)顯著性降低。見表2，圖2、3。

組別劑量cyt-cApaf1假手術(shù)組-0.26±0.030.31±0.04模型對照組-0.47±0.05?0.54±0.05?參麝活絡(luò)丸低劑量組0.37 g/kg0.41±0.06#0.45±0.10△參麝活絡(luò)丸中劑量組0.74 g/kg0.38±0.07△0.47±0.08△參麝活絡(luò)丸高劑量組1.48 g/kg0.36±0.10△0.47±0.05#尼莫地平片組8.10 mg/kg0.39±0.07△0.48±0.02△

注：與空白組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05,△P<0.01;自由度(5，54)，F(xiàn)=10.09，F(xiàn)=15.99

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圖2 大鼠腦前額葉神經(jīng)元cyt-c表達(dá)顯微圖(×200)；A 假手術(shù)組；B 模型組；C 參麝活絡(luò)丸低劑量組；D 參麝活絡(luò)丸中劑量組；E 參麝活絡(luò)丸高劑量組；F 尼莫地平片組

2.4 6組大鼠腦前額葉神經(jīng)元Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)結(jié)果比較 與假手術(shù)組比較模型對照組Caspase-9表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與模型對照組比較參麝活絡(luò)丸低劑量組、參麝活絡(luò)丸中劑量組、參麝活絡(luò)丸高劑量組Caspase-9表達(dá)顯著降低。與假手術(shù)組比較假手術(shù)組Caspase-3表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與模型組比較參麝活絡(luò)丸中、高劑量組Caspase-3表達(dá)顯著性降低。見表3，圖4、5。

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圖3 大鼠腦前額葉神經(jīng)元Apaf1表達(dá)顯微圖(×200)；A 假手術(shù)組；B 模型組；C 參麝活絡(luò)丸低劑量組；D 參麝活絡(luò)丸中劑量組；E 參麝活絡(luò)丸高劑量組；F 尼莫地平片組

組別劑量Caspase-9Caspase-3假手術(shù)組-0.22±0.080.19±0.07模型對照組-0.48±0.09?0.45±0.10?參麝活絡(luò)丸低劑量組0.37 g/kg0.40±0.07?0.37±0.13參麝活絡(luò)丸中劑量組0.74 g/kg0.35±0.08#0.36±0.10?參麝活絡(luò)丸高劑量組1.48 g/kg0.36±0.10#0.33±0.11?尼莫地平片組8.10 mg/kg0.34±0.09#0.33±0.09?

注：與空白組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.01;自由度(5，54)，F(xiàn)=9.75，F(xiàn)=6.91

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圖4 大鼠腦前額葉神經(jīng)元Caspase-9表達(dá)顯微圖(×200)；A 假手術(shù)組；B 模型組；C 參麝活絡(luò)丸低劑量組；D 參麝活絡(luò)丸中劑量組；E 參麝活絡(luò)丸高劑量組；F 尼莫地平片組

3 討論

腦缺血見于多種神經(jīng)疾病的病理過程中，如腦血管病、腦腫瘤等。可見頭暈或肢體麻木、活動不靈，肢體軟弱無力。腦血管病可分為血管壁病變，血液成分改變和血流動力學(xué)改變等。正常血管內(nèi)皮細(xì)胞是一層光滑的細(xì)胞群，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的損害可使內(nèi)皮細(xì)胞剝離，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生，使動脈管腔狹窄，動脈粥樣硬化斑塊脫落阻塞腦血管，引起腦組織局部動脈血流灌注減少，腦供血不足。血小板極易黏附在病變血管內(nèi)膜處，釋放出多種生物活性物質(zhì)，加速血小板的再聚集，極易形成動脈附壁血栓[5]。腦梗死會造成局部腦組織缺血、缺氧甚至軟化、壞死，進(jìn)而出現(xiàn)急性腦功能障礙的臨床表現(xiàn)征，臨床表現(xiàn)為頭昏、頭暈、肢體偏癱、偏身感覺減退、大小便失禁、步態(tài)不穩(wěn)、肢體無力，吞咽困難等。治療前各組比假手術(shù)組神經(jīng)行為損傷評分顯著增加，說明本研究已成功復(fù)制大鼠缺血再灌注損傷模型。治療后模型對照組比假手術(shù)組神經(jīng)行為損傷評分顯著增加，說明大鼠腦缺血再灌注損傷尚未自然恢復(fù)。參麝活絡(luò)丸各劑量組比模型對照組神經(jīng)行為損傷評分均顯著性降低，說明參麝活絡(luò)丸對大鼠腦缺血再灌注損傷模型具有顯著性的治療作用[7,8]。

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圖5 大鼠腦前額葉神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)顯微圖(×200)；A 假手術(shù)組；B 模型組；C 參麝活絡(luò)丸低劑量組；D 參麝活絡(luò)丸中劑量組；E 參麝活絡(luò)丸高劑量組；F 尼莫地平片組

腦缺血再灌注損傷時間越長，興奮性遞質(zhì)含量越低，腦組織超微結(jié)構(gòu)改變越明顯：線粒體腫脹，可見線粒體嵴斷裂、核染色質(zhì)凝集、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度腫脹，結(jié)構(gòu)明顯破壞，Nissl體完整性破壞。本研究中假手術(shù)組腦前額葉神經(jīng)元核仁清晰，胞漿染色均勻，包漿內(nèi)可見豐富的尼氏小體；模型組腦前額葉神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏小體減少，核仁消失。參麝活絡(luò)丸組大鼠腦前額葉神經(jīng)元病理改變與模型組相比有明顯改善。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡參與缺血再灌流所致的神經(jīng)元損傷，細(xì)胞凋亡使梗死區(qū)面積擴(kuò)大[9,10]。通常外源性細(xì)胞色素C不能進(jìn)入健康細(xì)胞，但在缺氧時，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞色素C便有可能進(jìn)入細(xì)胞及線粒體內(nèi)，增強(qiáng)細(xì)胞氧化，能提高氧的利用[11]。腦缺血再灌注損傷時線粒體腫脹，可見線粒體嵴斷裂，從線粒體中泄露出的細(xì)胞色素C有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[12]。釋放到細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下與凋亡相關(guān)因子(Apaf-1)結(jié)合形成多聚體，Apaf-1促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13,14]。本研究中參麝活絡(luò)丸中、高劑量組cyt-c、Apaf1、Caspase-9和Caspase-3表達(dá)比模型對照組顯著降低，說明參麝活絡(luò)丸可通過降低cyt-c、Apaf1、Caspase-9和Caspase-3表達(dá)而抑制腦缺血再灌注損傷所引起的神經(jīng)元凋亡，起到對大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用[15]。

參麝活絡(luò)丸可通過抑制cyt-c、Apaf1、Caspase-9、Caspase-3凋亡通路對腦中動脈阻塞-再灌注損傷模型產(chǎn)生治療作用，以上藥效學(xué)結(jié)果為參麝活絡(luò)丸在臨床上治療腦缺血再灌注損傷提供了試驗(yàn)依據(jù)。