方志青，李婷婷，王 婭，林 野

(1 貴州民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2 貴州省疾病預(yù)防控制中心理化科，貴州 貴陽 550004)

豆芽，又稱芽苗菜，其營養(yǎng)豐富、美味可口且價格低廉是人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｊ车氖称?，常見的有黃豆芽、綠豆芽等。豆芽的培植常使用植物生長調(diào)節(jié)劑，可以使豆芽粗壯無根、提高產(chǎn)量和縮短生長周期，長期以來被國內(nèi)外豆芽生產(chǎn)者應(yīng)用[1-3]。植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant growth regulator，PRGs)包括經(jīng)人工合成的對植物的生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用的化合物或從生物中提取的天然植物激素，用于調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的一類農(nóng)藥[4-7]。因其在農(nóng)作物的生長、開花、結(jié)果以及矮化植物、縮短水果蔬菜的成熟期等方面發(fā)揮了巨大的作用，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，能夠調(diào)節(jié)果蔬生長，達(dá)到增產(chǎn)、豐收等目的[8-10]。但長期食用會對人體內(nèi)分泌和代謝平衡造成影響，通常會導(dǎo)致消費者骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤等疾病，而且易造成兒童早熟等癥狀[11-12]。由于盲目濫用和超量使用植物生長激素而造成的食品安全問題時有發(fā)生，目前是食品安全領(lǐng)域的一個重大問題。本研究針對豆芽生產(chǎn)過程中可能使用的3種植物生長調(diào)節(jié)劑，采用氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法對貴陽省市售豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑進行了殘留監(jiān)測，以期為豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量對居民健康的影響提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 樣品來源

隨機購置于各大超市、農(nóng)貿(mào)市場豆芽樣品合計107份，其中綠豆芽36份，黃豆芽71份。所有樣品裝入食品保鮮袋內(nèi)后-20 ℃凍藏備用。

1.2 儀器與試劑

p管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，Thermo Fisher公司)；GX-274固相萃取儀，美國吉爾森；MCS固相萃取柱(500 mg/6 mL)，Waters公司；Milli-Q AdvantageA10超純水儀，美國密理博；SIGMA3-18KS冷凍離心機，德國SIGMA；IKA MS-3漩渦混合儀，德國IKA公司；TTL-DCII型氮吹儀，北京同泰聯(lián)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Heidolph Laborota 4001 ellicient。

甲醇、乙酸乙酯、正己烷、甲酸、乙腈(色譜純)；鹽酸(優(yōu)級純)；無水硫酸鈉、三氟化硼乙醚溶液(分析純)；4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)，分別稱取3種標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g(精確至0.0001 g)用甲醇溶解并定容至25 mL，得到1.0 mg/mL 3種植物生長調(diào)節(jié)劑儲備液。使用時分別吸取各儲備液1.0 mL甲醇定容至100 mL，得到10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，4 ℃保存。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品提取

稱取試樣10.0 g(精確至0.0001 g)于具塞離心管中，加入20.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.5%甲酸乙腈溶液，漩渦混勻2 min，超聲提取30 min，置于離心機中8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的具塞離心管中，然后加入3.00 g NaCl(使其飽和結(jié)晶)，漩渦混勻，超聲10 min，冷卻后8000 r/min離心5 min，吸出乙腈層，用無水Na2SO4脫水過濾至圓底燒瓶內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干后加入2.0 mL甲醇超聲溶解。取1.0 mL甲醇樣液加入9.0 mL 40 mmol/L HCl，超聲混勻，轉(zhuǎn)移至離心管8000 r/min離心5 min，上清液待凈化。

1.3.2 樣品凈化

取預(yù)先加5.0 mL 甲醇、5.0 mL水、5.0 mL 40 mmol/L的HCl活化的MCS柱(500 mg/6 mL)，將1.3.1中待凈化的上清液過MCS柱后收集，待樣品過柱后，用5.0 mL水淋洗除雜，真空抽干柱內(nèi)液體后加入5.0 mL甲醇洗脫收集，合并收集液于10.0 mL試管中50 ℃下用氮氣吹干待衍生。

1.3.3 樣品衍生

在試管內(nèi)加入1.0 mL 10%三氟化硼甲醇衍生溶液，渦旋混勻，70 ℃加熱衍生30 min，冷卻至室溫后加入1.0 mL乙酸乙酯/正己烷混合溶液(V/V=1:4)和2.0 mL超純水，渦旋混勻，4000 r/min離心5 min，取有機相待氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

分別吸取50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、1000 μL 10.0 μg/mL植物生長調(diào)節(jié)劑混合使用液甲醇定容1.0 mL，參照1.3.3樣品衍生方法衍生，提取獲得0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、10.0 μg/mL植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，GC-MS/MS測定。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：TG-5MS毛細(xì)管色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm，載氣：高純氦氣(≥99.99%)，柱流量：1.0 mL/min，進樣口溫度：250 ℃，柱溫：程序升溫，初始溫度80 ℃保持2 min，20 ℃/min升溫至290 ℃保持5 min，不分流進樣，進樣量：1.0 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式：EI源，70 eV，離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：280 ℃，檢測方式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器測定條件優(yōu)化

表1 3種植物生長調(diào)節(jié)劑的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

圖1 3種植物生長調(diào)節(jié)劑總離子流圖(a)和二級質(zhì)譜圖(b)

為減少基質(zhì)干擾，降低檢出限，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)對10.0 μg/mL 3種植物生長調(diào)節(jié)劑進行分析，首先通過全掃描確定4-CPA、IAA和IBA的母離子，采用子離子掃描方式進行二級質(zhì)譜分析，進一步優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使各分析化合物的響應(yīng)最大化，優(yōu)化后3種植物生長調(diào)節(jié)劑的母離子、子離子及其碰撞能量見表1，總離子流圖和二級質(zhì)譜圖見圖1所示。

2.2 方法的線性范圍、定量限和檢出限

以3種植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度(μg/mL)(x)和其定量離子峰面積(y)進行線性回歸計算。結(jié)果顯示：3種植物生長調(diào)節(jié)劑在0.5～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)0.9959～0.9994(見表2)。同時，以定量離子信噪比(S/N)的3倍和10倍作為方法的檢出限和定量限，計算本方法檢出限為6.0～9.0 μg/kg、定量限為12.0～23.0 μg/kg(見表2)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

分別以回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示方法的準(zhǔn)確度、精密度。在陰性樣品中分別按高、中、低三個不同加標(biāo)水平加入PGRs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”樣品處理方法進行提取、凈化和衍生后測定其含量并計算回收率。每個濃度水平進行6次加標(biāo)回收測定并計算精密度。結(jié)果表明：加標(biāo)回收率范圍在82.1%～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<8%(見表3)。

表3 方法的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4 樣品檢測

采用本文建立的方法對貴陽市市售黃豆芽、綠豆芽等107份豆芽樣品中的植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量進行了測定。其中4-CPA檢出率為7.6%，含量在0.011～0.59 mg/kg范圍，IAA出率為31.2%，含量在0.01～3.36 mg/kg范圍，IBA出率為2.1%，含量在0.01～0.17 mg/kg范圍。IAA是刺激植物生長發(fā)育最具代表性且最常用的內(nèi)源激素，因此解釋了IAA的檢出率最高。目前我國的國家食品安全風(fēng)險監(jiān)測工作要求豆芽中不得檢出4-CPA、IAA、IBA等植物生長調(diào)節(jié)劑，本研究較高的檢出率說明，市場上植物生長調(diào)節(jié)劑濫用現(xiàn)象依然存在，有待進一步的監(jiān)管和規(guī)范。

3 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化前處理方法建立了同時測定豆芽中4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸殘留量的GC-MS/MS方法，方法在0.5～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為6.0～9.0 μg/kg、定量限為12.0～23.0 μg/kg，3個不同濃度水平下加標(biāo)回收率為82.1%～106%，能夠滿足于豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的定性和定量檢測。且應(yīng)用該方法測定了貴陽市107份豆芽樣品中3種植物生長調(diào)節(jié)劑的測定，其中IAA檢出率較高，說明市場上植物生長調(diào)節(jié)劑濫用現(xiàn)象依然存在，有待進一步的監(jiān)管和規(guī)范。