孟維一，古 瑾，姜 銳，張 晴，趙文濤，馬燕紅,*，趙奕昕，李瑩瑩，郭文萍

（1.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068；2.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100020）

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）、多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）和塑化劑（phthalic acid esters，PAEs）都是具有親脂性且易遠(yuǎn)距離遷移的持久性有機(jī)污染物，均具有一定的致癌、致畸和致突變作用，是環(huán)境和食品較為關(guān)注的污染物[1-3]，世界各國也對這些化合物制定了嚴(yán)格的限量要求[4-7]。PAHs、PCBs在環(huán)境中廣泛存在，能通過生物轉(zhuǎn)化等多種途徑進(jìn)入食物鏈，油脂在加工過程中的高溫反應(yīng)也是PAHs的主要來源；PAEs廣泛應(yīng)用于塑料生產(chǎn)加工中，塑料桶裝的食用植物油易通過接觸遷移受到PAEs污染。這3 類化合物含量水平已成為評價食用油質(zhì)量安全的重要指標(biāo)[8]，因此，建立一種高通量快速分析測定市售食用油中3 類污染物含量的方法尤為重要。

圖1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of the target compounds

目前，國內(nèi)外對食用油中污染物的研究雖已較多，但都是單獨分析其中一類，鮮見有同時檢測這3 類污染物的報道。這3 類污染物的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[9-16]、高效液相色譜法[17-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-24]等，其中，最常用的是氣相色譜-質(zhì)譜法。但由于食用油成分復(fù)雜，很多文獻(xiàn)報道的檢測方法存在基質(zhì)干擾大，導(dǎo)致檢出限高、靈敏度低和選擇性相對差等缺點。因此，建立選擇性更強(qiáng)、更靈敏、檢出限更低的痕量污染物檢測方法尤為重要。在質(zhì)譜檢測領(lǐng)域里，串聯(lián)質(zhì)譜是最靈敏和定量重現(xiàn)性最高的儀器，它的優(yōu)勢在于能夠提供足夠的化合物結(jié)構(gòu)信息用于定性分析，準(zhǔn)確可靠，由于在母離子碰撞前，樣本中共流出物產(chǎn)生的干擾離子已被排除，特征母離子和子離子的一一對應(yīng)性使排除干擾能力強(qiáng)。同時，定量時本底值低，檢測靈敏度高，特別適用于分析背景干擾嚴(yán)重、定性困難、被測化合物含量很低的樣品，是對復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量化合物進(jìn)行定性、定量分析最有效的手段[25]。

在結(jié)構(gòu)上，PAHs、PCBs和PAEs這3 類物質(zhì)母體均為苯環(huán)，有類似結(jié)構(gòu)（圖1），本實驗旨在建立一種同時檢測這3 類污染物的高通量方法。采用超聲輔助和固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）柱對樣品提取和凈化，建立氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法高通量同時測定食用油中的18 種鄰苯二甲酸酯類PAEs、16 種PAHs和7 種PCBs的檢測方法，為3 類污染物的檢測和食用油加工過程質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市購食用油包括玉米油、大豆油和芝麻油，其中大豆油包括兩個品牌，所有的樣品均在陰涼、避光處儲存。

乙腈、正己烷、甲醇、二氯甲烷、丙酮（均為色譜純） 美國J.T.Beaker公司；萘（naphthalene，N a P）、苊烯（a c e n a p h t h y l e n e，A c y）、苊（acenaphthene，Ace）、芴（fluorene，F(xiàn)lu）、菲（phenanthrene，Phe）、蒽（anthracene，Ant）、熒蒽（fluoranthene，F(xiàn)la）、芘（pyrene，Pyr）、苯并[a]蒽（benzo[a]anthracene，BaA）、屈（chrysene，CHR）、苯并[b]熒蒽（benzo[b]fluoranthene，BbF）、苯并[k]熒蒽（benzo[k]fluoranthene，BkF）、苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）、茚并[1,2,3-cd]芘（indeno[1,2,3-c,d]pyrene，IcdP）、二苯并[a,h]蒽（dibenz[a,h]anthrancene，DBahA）、苯并[ghi]苝（benzo[g,h,i]perylene，BghiP）、2,4,4’-三氯聯(lián)苯（2,4,4’-trichlorobiphenyl，PCB28）、2,2’,5,5’-四氯聯(lián)苯（2,2’,5,5’-tetrachlorobiphenyl，PCB52）、2,2’,4,5,5’-五氯聯(lián)苯（2,2’,4,5,5’-pentachlorobiphenyl，PCB101）、2,3’,4,4’,5-五氯聯(lián)苯（2,3,4,4’,5-pentachlorobiphenyl，PCB118）、2,2’,3,4,4’,5-六氯聯(lián)苯（2,2’,3,4,4’,5-he xachlorobiphenyl，PCB138）、2,2’,4,4’,5,5’-六氯聯(lián)苯（2,2’,4,4’,5,5’-hexachlorobiphenyl，PCB153）、2,2’,3,4,4’,5,5’-七氯聯(lián)苯（2,2’,3,4,4’,5,5’-heptachloro biphenyl，PCB180） 上海安譜公司；鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二烯丙酯（diallyl phthalate，DAP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）、鄰苯二甲酸二正丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯（bis(2-methoxyethyl) phthalate，DMEP）、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯（bis(4-methyl-2-pentyl)phthalate，BMPP）、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯（bis(2-ethoxyethyl) phthalate，DEEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（di-n-pentyl phthalate，DPP）、鄰苯二甲酸二己酯（di-n-hexyl phthalate，DHXP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（butyl benzyl phthalate，BBP）、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯（bis(2-butoxyethyl) phthalate，DBEP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP）、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯（bis(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP）、鄰苯二甲酸二苯酯（diphenyl phthalate，DPhP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DNOP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（diisononyl phthalate，DINP）、鄰苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DNP）德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE1300/TSQ8000EVO氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜 美國Thermo公司；KQ-700DV數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HGC-36A氮吹儀天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取18 種鄰苯二甲酸酯類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確到0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；準(zhǔn)確稱取16 種PAHs類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確到0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；準(zhǔn)確稱取7 種PCBs類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確到0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；以上41 種標(biāo)準(zhǔn)儲備液均于-18 ℃保存。

分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用丙酮配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用丙酮逐級稀釋為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3.2 儀器分析條件

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：DB-5石英毛細(xì)柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至200 ℃，以8 ℃/min升溫到290 ℃，保持2 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL；不分流。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃；質(zhì)譜掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（selective reaction monitor，SRM）模式。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 提取

稱取0.5 g油樣于玻璃離心管中，準(zhǔn)確加入2 mL正己烷飽和乙腈萃取劑，渦旋1 min，超聲提取15 min，以5 000 r/min離心3 min，收集上清液；再加入2 mL正己烷飽和乙腈萃取劑，渦旋1 min，以5 000 r/min離心3 min，重復(fù)提取2 次，合并3 次上清液，待凈化。

1.3.3.2 凈化

分別用5 mL二氯甲烷、5 mL乙腈活化SPE柱，將收集好的待凈化液上樣，接收管進(jìn)行收集，等待凈化液全部流入接收管后加入5 mL乙腈進(jìn)行洗脫，該部分液體也收集。收集完全后在接收管中加入1 mL丙酮，在氮吹濃縮儀上以40 ℃的溫度氮吹至干，用正己烷準(zhǔn)確定容至1.0 mL，待氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)以fs表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

圖2 萃取溶劑對回收率的影響Fig. 2 Effect of solvents on recovery of analytes

PAHs、PCBs和PAEs均為脂溶性化合物，由于食用油的基質(zhì)比較復(fù)雜，干擾物質(zhì)（如：甾醇、脂肪酸等大分子物質(zhì)）較多，為盡可能的降低基質(zhì)的干擾、同時盡可能地減少共萃物的出現(xiàn)，實驗對比了2 mL乙腈、2 mL乙腈飽和正己烷、2 mL正己烷飽和乙腈對萃取效果的影響，平行3 次實驗。由圖2可知，在只用乙腈作萃取溶劑時，一些PAHs和少部分PAEs的回收率都低于60%，萘的回收率最低，只有35%，這是因為在油脂的基質(zhì)中，干擾物質(zhì)有很多，只用乙腈提取時油脂與乙腈不相溶，油脂并沒有完全溶解，不能很好地將鄰苯二甲酸酯和PAHs完全提取出來。當(dāng)用乙腈飽和正己烷作萃取溶劑進(jìn)行提取時，絕大部分組分的回收率均提高。當(dāng)用正己烷飽和乙腈作萃取溶劑時，各組分的回收率基本均達(dá)到最高。有文獻(xiàn)報道，使用正己烷飽和乙腈作萃取劑，可有效去除脂肪[26]。這是因為乙腈是極性溶劑而正己烷是非極性溶劑，正己烷可以溶解油脂，使得乙腈可以更充分地與油脂接觸，食用油中的待測組分得到充分提取，同時能較好的降低基質(zhì)的干擾。因此，最終選取2 mL正己烷飽和乙腈作為萃取溶劑。

2.1.2 超聲輔助萃取時間的優(yōu)化

在稱樣量0.5 g、加入2 mL正己烷飽和乙腈萃取劑、渦旋1 min的條件下，考察10、15、20 min 3 個超聲萃取時間的影響，平行3 次實驗。由圖3可知，超聲時間為10 min時一些物質(zhì)的回收率較低。超聲時間為15 min和20 min時，各組分的回收率差別不大。因此，為減少耗時，最終選擇超聲輔助萃取時間為15 min。

圖3 萃取時間對回收率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on recovery of analytes

2.1.3 凈化方法的優(yōu)化

圖4 凈化方法對回收率的影響Fig. 4 Effect of purification methods on recovery of analytes

在相同的提取條件下，實驗對比了超低溫冷凍除脂法[8,27]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged,safe）法[28-32]和SPE法[33-34]凈化，平行3 次實驗。超低溫冷凍除脂法是樣品溶液經(jīng)提取后，將得到的待凈化液放于超低溫冰箱中，轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中以4 000 r/min離心5 min，取上清液待測。QuEChERS法是樣品溶液經(jīng)提取后，取1 mL待凈化液于玻璃離心管中，再加入50 mg的C18和50 mg的丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）粉末[35]，渦旋1 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液待測。由圖4可知，超低溫冷凍除脂雖然操作簡單，試劑用量小，也可有效地除脂，但并不能除去基質(zhì)中的雜質(zhì)和大分子物質(zhì)，被測物質(zhì)的回收率普遍偏低。QuEChERS法的凈化效果和SPE柱凈化效果相當(dāng)，但其空白對照組檢測出更多的PAHs和鄰苯二甲酸酯，影響測定的準(zhǔn)確性。SPE柱凈化法凈化效果好、回收率高。因此，最終選擇SPE柱凈化為前處理的凈化方法。

2.2 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件優(yōu)化

表1 41 種化合物的SRM參數(shù)Table 1 SRM parameters for 41 compounds

本研究將國標(biāo)中給出的選擇離子作為所要檢測的41 種化合物的母離子，碰撞能量在5～50 eV的范圍內(nèi)，以每5 eV的大小進(jìn)行遞增的方式進(jìn)行自動優(yōu)化。最終確定了SRM模式掃描條件如表1所示，并且得到SRM模式下的色譜圖，如圖5所示。

圖5 SRM掃描色譜圖Fig. 5 SRM chromatograms

2.3 線性范圍和檢出限

以峰面積對相應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，以3 倍信噪比確定各目標(biāo)化合物的方法檢出限，其線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見表2。檢出限均不大于2 μg/kg（除DINP外）。

表2 41 種化合物的線性范圍和檢出限Table 2 Linear ranges and detection limits of 41 compounds

續(xù)表2

2.4 方法精密度和回收率

表3 方法回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precision of the method (n= 6)

以大豆油作為空白樣品基質(zhì)，得到低、中、高3 個加標(biāo)水平的樣品，由于鄰苯二甲酸酯與PAHs、PCBs的響應(yīng)值相差較大，因此鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的加標(biāo)量高、中、低質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1 mg/kg；PAHs與PCBs的加標(biāo)量高、中、低質(zhì)量濃度為2、10、20 μg/kg。經(jīng)提取凈化后進(jìn)行添加回收實驗，平行測定6 次，測定結(jié)果如表3所示。

由表3可知，41 種化合物的高質(zhì)量濃度水平回收率在68.2%～123.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～12.3%；中質(zhì)量濃度水平回收率在62.7%～125.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～12.7%；低質(zhì)量濃度水平回收率在65.3%～128.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～13.6%。

2.5 實際樣品分析結(jié)果

圖6 樣品色譜圖Fig. 6 Chromatograms of real samples

應(yīng)用所建立的方法對超市里隨機(jī)抽取的玉米油、大豆油和芝麻油進(jìn)行檢測分析，如圖6所示。結(jié)果表明，被測油樣中鄰苯二甲酸酯、PAHs和PCBs這3 類物質(zhì)均未檢出或未超標(biāo)。

3 結(jié) 論

以氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜同時測定食用油中的18 種鄰苯二甲酸酯、16 種PAHs和7 種PCBs，通過對萃取溶劑、超聲時間和凈化方法的優(yōu)化，使得食用油樣品僅需一次提取和凈化，即可采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對41 種化合物進(jìn)行同時測定。在優(yōu)化實驗條件下，方法靈敏度較高，目標(biāo)化合物的回收率高，方法的精密度和準(zhǔn)確性良好，能夠滿足實際應(yīng)用的需要。所建立的方法可以滿足食用油中3 類污染物同時測定的分析要求。該方法有效、快速，大大節(jié)省了檢測成本和檢測時間，可為食用油的質(zhì)量安全監(jiān)管提供便利。