謝春花，柳 雙，王敏思，王霞琳，王 珅，張志軍，宋 洋,*

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津），天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

喹乙醇（olaquindox，OLA）是一種化學(xué)合成的生長(zhǎng)促進(jìn)劑而不是抗生素藥物，可促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)合成代謝，提高飼料能量利用率，因此加快了生長(zhǎng)發(fā)育，提高了個(gè)體瘦肉率[1-3]。盡管當(dāng)時(shí)缺乏毒性和潛在機(jī)制的證據(jù)，OLA仍被廣泛用作豬的飼料添加劑，以提高飼料轉(zhuǎn)化效率[4-6]。近年來(lái)，在水產(chǎn)飼料中，OLA曾被稱為“水產(chǎn)養(yǎng)殖瘦肉精”[7-8]。研究表明，大劑量的OLA可對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性作用，并且OLA在體內(nèi)累積，當(dāng)在動(dòng)物體內(nèi)積累到一定程度時(shí)，會(huì)對(duì)動(dòng)物和人類造成致畸、致癌和致突變作用。然而，該藥物的毒性根據(jù)動(dòng)物的種類不同變化很大。OLA對(duì)家禽和魚(yú)類具有顯著的毒性[9]和特定的遺傳毒性[10]。因此，歐盟自1999年以來(lái)完全禁止使用OLA[11-12]。2018年1月11日，農(nóng)業(yè)部第2638號(hào)公告公布，自2018年5月1日起，限制使用OLA[13]。澳大利亞允許豬和禽肉中OLA的最大殘留限量為300 μg/kg[14]。在日本，豬肉、雞肉和其他動(dòng)物的OLA最大殘留限量控制在300 μg/kg之內(nèi)。

目前表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)被廣泛用于食品安全檢測(cè)。Karczmarczyk等[15]研究了一種基于競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定的策略，使用與酶（堿性磷酸酶）結(jié)合的二抗作為標(biāo)記，改良的金絲網(wǎng)印刷電極（screen-printed gold electrode，AuSPE）對(duì)霉菌毒素（赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素M1）進(jìn)行伏安檢測(cè)，檢出限到μg/L級(jí)別。Amjadi等[16]建立了基于銀納米棱柱（Ag nanoprisms，AgNPRs）的形態(tài)轉(zhuǎn)化開(kāi)發(fā)了一種靈敏的比色探針檢測(cè)超痕量Se（IV），檢出限為1.2 μg/L。該方法用于水和食品樣品的分析。Song Yang等[17]使用PH-BSA固定的傳感器芯片的SPR免疫測(cè)量蘋果、桃子、卷心菜等樣品中的亞胺硫磷殘留量，樣品的最低檢出限為1.6 ng/L。趙芳等[18]采用表面自組裝技術(shù)在金膜的表面修飾羧基基團(tuán)，將玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）抗原與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）偶聯(lián)物（ZENBSA）通過(guò)共價(jià)鍵固定在芯片的表面，采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)樣品中的玉米赤霉烯酮毒素，檢出限為8.2 μg/L。Pan Mingfei等[19]基于抑制形式制備了可重復(fù)的SPR免疫傳感器，用于穩(wěn)定和靈敏地檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的4 種磺胺類藥物，對(duì)純牛奶、雞蛋、雞肉、牛肉與魚(yú)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)周期可在不到5 min內(nèi)完成，每個(gè)SPR芯片可重復(fù)使用300 個(gè)分析周期。Zhang Lili等[20]以4-乙烯基苯硼酸為功能單體，聚乙二醇丙烯酸酯和2,2’-偶氮異丁基脒鹽酸鹽為交聯(lián)劑和引發(fā)劑，制備了卡那霉素分子印跡SPR傳感器對(duì)奶粉和蜂蜜中的卡那霉素進(jìn)行檢測(cè)。與非印跡傳感器相比，印跡傳感器對(duì)卡那霉素具有更好的印跡效果和選擇性。潘明飛等[21]針對(duì)花生中高毒污染物黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1），開(kāi)發(fā)一種可再生循環(huán)使用的抑制型SPR免疫傳感器。該實(shí)驗(yàn)檢出限（IC15）為0.004 9 μg/L，靈敏度（IC50）達(dá)到0.025 μg/L；對(duì)花生樣品中AFB1的檢出限（IC15）和靈敏度（IC50）分別達(dá)到0.13 μg/kg和0.74 μg/kg。

用于檢測(cè)OLA免疫分析方法研究[22-24]有很多。Zhao Dan等[25]開(kāi)發(fā)了用于測(cè)定動(dòng)物飼料樣品中OLA的高靈敏度和特異性間接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。OLA由N’N-羰基二咪唑激活并與BSA和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）偶聯(lián)。發(fā)現(xiàn)兩種抗血清的靈敏度和特異性非常相似，IC50值分別為16 ng/mL和19 ng/mL。Zhao Dongyan等[26]通過(guò)使用親水性分子印跡薄膜引入了一種替代生物抗體的新方法，開(kāi)發(fā)了一種快速、新型的直接競(jìng)爭(zhēng)仿生ELISA法測(cè)定雛雞飼料中的OLA。在最佳條件下，靈敏度（IC50）和檢出限（IC15）分別為（700f60）μg/L和（17.0f1.6）μg/L。Le Tao等[27]開(kāi)發(fā)了免疫色譜（immunochromatography，ICG）條帶，用于同時(shí)定量測(cè)定動(dòng)物飼料中的5 種喹喔啉-1,4-二氧化物。為此目的，將具有基團(tuán)特異性喹喔啉-1,4-二氧化物的多克隆抗體（PcAb）與膠體金顆粒綴合，作為ICG條帶的檢測(cè)試劑以測(cè)試喹喔啉-1,4-二氧化物。該方法在5～10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了喹喔啉-1,4-二氧化物的半定量檢測(cè)。喹烯酮、喹賽多、卡巴氧、痢菌凈和OLA條帶的視覺(jué)下檢出限分別為10、15、15、20 ng/mL和20 ng/mL。使用ICG條帶讀數(shù)器，對(duì)于喹烯酮、喹賽多、卡巴氧、痢菌凈和OLA，分別計(jì)算IC50為9.1、13.5、16.6、20.2 ng/mL和21.3 ng/mL。Pei Xingyao等[28]建立了一種簡(jiǎn)單、快速、超靈敏、定量的金免疫層析法，用于分析動(dòng)物飼料樣品和地表水樣品中的OLA，優(yōu)化方法的IC50為飼料3.35 μg/L，環(huán)境水0.35 μg/L。Peng Tao等[29]基于熒光微球的ICG法已被建立用于同時(shí)檢測(cè)環(huán)境水和動(dòng)物食品中的5 種經(jīng)典喹喔啉。在最佳條件下，它在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)5 種喹喔啉的定性和定量檢測(cè)。環(huán)境水和動(dòng)物食品中5 種喹喔啉的目測(cè)檢出限分別為5～15 μg/L和100～250 μg/kg。

本實(shí)驗(yàn)擬建立一種基于SPR的免疫傳感器，用于高效靈敏地檢測(cè)動(dòng)物飼料和水產(chǎn)養(yǎng)殖水中的OLA。基于全抗原芯片的SPR免疫傳感器，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定。此外，針對(duì)芯片的壽命，對(duì)同源的單、多克隆OLA抗體結(jié)合芯片的穩(wěn)定性進(jìn)行比較。該實(shí)驗(yàn)可為實(shí)際樣品中OLA的檢測(cè)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飼料樣品 天津市購(gòu)；水樣由天津市多個(gè)飼養(yǎng)池采集。

OLA（純度99%）、喹烯酮（純度99.6%）、卡巴多（純度98.8%）、鹽酸克倫特羅（純度98%）、氯霉素（純度99.9%） 美國(guó)Sigma Aldrich公司；乙酰甲喹（純度97%） 加拿大TRC公司；1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基-琥珀酰亞胺（N-hydroxy-succinimide，NHS）、1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亞胺（ethanolamine, 1-ethyl-3-(3-(di methylamino)propyl) carbodiimide，EDC）、乙醇胺（ethanolamine，EA）、10 mmol/L乙酸鹽、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、甘氨酸（Gly）-HCl（10 mmol/L）、HCl、NaOH Harmonia Testing Technology天津股份有限公司。用PBS制備1.0h102mg/L OLA儲(chǔ)備溶液并在25 ℃貯存。其他用甲醇稀釋至500 mg/L的結(jié)構(gòu)類似物，在4 ℃貯存。

OLA-OVA質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL，抗OLA抗體（單克隆和多克隆抗體）質(zhì)量濃度均為4.3 mg/mL，由天津師范大學(xué)動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

BIAcore 3000 SPR儀 美國(guó)GE公司；羧甲基化葡聚糖CM5芯片 德國(guó)Xantec公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Thermo Finnegan公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

將處理過(guò)的CM5芯片放入SPR儀器中。在基線穩(wěn)定后，使用10 mmol/L PBS作為運(yùn)行緩沖液。將NHS和EDC混合物注入儀器中以激活CM5芯片表面上的葡聚糖，注入OLA-OVA進(jìn)行抗原的固定化。CM5芯片表面的葡聚糖活化后暴露出大量的羧基可以與OLA-OVA蛋白的氨基形成肽鍵，從而使OLA-OVA固定于芯片表面，用EA溶液封閉未結(jié)合的羧基位點(diǎn)?？瞻淄ǖ酪沧鱿鄳?yīng)的處理。當(dāng)目標(biāo)抗體流過(guò)芯片表面時(shí)，抗體將特異性地與OLA-OVA結(jié)合，每次結(jié)合后用適合的再生液再生，再生液可以將結(jié)合的抗體與抗原斷開(kāi)，記錄結(jié)合抗體后SPR信號(hào)的變化。流程如圖1所示。

圖1 SPR免疫傳感器實(shí)驗(yàn)原理Fig. 1 Schematic demonstration of the principle of the SPR immunosensor

1.3.2 SPR方法建立

1.3.2.1 預(yù)富集與抗原固定

在激活芯片之前，進(jìn)行預(yù)富集實(shí)驗(yàn)以確定OLA-OVA稀釋劑的pH值和質(zhì)量濃度，以提高偶聯(lián)效率并降低配體消耗。原理參考Lu Yang等[30]。預(yù)富集可以確定抗原OLAOVA的最佳質(zhì)量濃度和pH值條件。在該實(shí)驗(yàn)中，分別用pH 5.0、4.5和4.0的乙酸鈉緩沖液將OLA-OVA稀釋200、100、50、25 倍和10 倍。PBS作為運(yùn)行緩沖液，流速為10 μL/min，分別將不同的處理抗原以每次10 μL的體積注入反應(yīng)池中，每次反應(yīng)后，用50 mmol/L NaOH溶液進(jìn)行沖洗，觀察響應(yīng)值，確定抗原稀釋液pH值及質(zhì)量濃度。

EDC/NHS混合注入70 μL，活化芯片表面，將預(yù)富集選好的最適抗原質(zhì)量濃度及pH值的抗原固定于芯片表面，PBS為運(yùn)行緩沖液，流速10 μL/min，每次注入10 μL，根據(jù)固定的效果決定抗原固定量，用70 μL的EA封閉未偶聯(lián)抗原的羧基，穩(wěn)定基線10 min。

1.3.2.2 結(jié)合實(shí)驗(yàn)

使用10 mmol/L PBS作為運(yùn)行緩沖液。將抗體分別稀釋1 000、800、600、400 倍和200 倍，設(shè)置流速為20 μL/min，注射量為60 μL，解離時(shí)間為300 s，注入儀器與芯片表面的OLA-OVA進(jìn)行結(jié)合。通過(guò)響應(yīng)值判斷結(jié)合程度，從而確定抗體的最佳質(zhì)量濃度。每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3 次注射，每次結(jié)合后用再生溶液進(jìn)行再生，同時(shí)選擇最佳再生溶液。在相同條件下，在注射抗體之前注射PBS作為對(duì)照組。

1.3.2.3 競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

用PBS稀釋OLA，使質(zhì)量濃度為128、64、32、12、6、4、2、6 μg/L和0.1 μg/L。使用10 mmol/L PBS作為運(yùn)行緩沖液，速率為20 μL/min。不同質(zhì)量濃度OLA標(biāo)準(zhǔn)品和抗體以體積比1∶1混合，注射體積為60 μL，解離時(shí)間為300 s。通過(guò)響應(yīng)值繪制OLA-OVA和OLA與OLA-Ab的結(jié)合曲線。每個(gè)OLA質(zhì)量濃度重復(fù)3 次。

1.3.3 芯片的再生

芯片再現(xiàn)性是驗(yàn)證所建立的方法是否實(shí)用的重要評(píng)估參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)比較4 種再生溶液：pH 2.2 Gly-HCl、pH 2.0 Gly-HCl、500 mmol/L NaCl和2.5 mmol/L NaOH。在每次結(jié)合實(shí)驗(yàn)后，分別重復(fù)注射4 種再生溶液2 次。觀察并比較SPR響應(yīng)的變化，選擇最佳再生液。

1.3.4 交叉反應(yīng)

所有結(jié)構(gòu)類似物用PBS稀釋至5 000、1 000、200、40、8 μg/L和1.6 μg/L。本實(shí)驗(yàn)選擇的OLA結(jié)構(gòu)類似物為喹烯酮、卡巴多、鹽酸克倫特羅、氯霉素和乙酰甲喹。用IC50計(jì)算交叉反應(yīng)率，如下式所示：

1.3.5 樣品前處理

飼料從當(dāng)?shù)氐某匈?gòu)買，養(yǎng)殖水從天津的水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)采集。在加標(biāo)和回收實(shí)驗(yàn)之前，通過(guò)HPLC驗(yàn)證每個(gè)測(cè)試樣品不含有OLA。

水樣：（避光）取2 mL的水樣于4 mL的離心管中，加入OLA儲(chǔ)備液，使最終質(zhì)量濃度為5、20 μg/L和40 μg/L。超聲波60 ℃加熱振蕩15 min，然后過(guò)0.22 μm濾膜待測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度3 個(gè)平行。

飼料樣品：（避光）稱取1 g飼料于10 mL的離心管中，加入OLA儲(chǔ)備液至5、20、40 μg/kg，加入2 mL水，60 ℃超聲波加熱15 min，以6 000 r/min離心10 min，取上清液。將上清液過(guò)0.22 μm濾膜后于4 ℃保存待測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度3 個(gè)平行。

1.3.6 樣品測(cè)定

樣品來(lái)自不同的超市與水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。樣品處理同1.3.5節(jié)，不需添加OLA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，處理后于4 ℃保存待測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理及圖表繪制

每組數(shù)據(jù)的平行組均為3 組，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果均為平均值，關(guān)于SPR的直接響應(yīng)值結(jié)果，在SPR儀上使用專門的軟件Biacore進(jìn)行圖表繪制，其他圖表用Origin進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 芯片預(yù)富集和抗原固定化

預(yù)富集實(shí)驗(yàn)中，用pH 4.0乙酸鈉稀釋時(shí)，抗原固定的效果明顯高于其他pH值，抗原稀釋10 倍時(shí)，結(jié)合量與稀釋25 倍沒(méi)有明顯的增加，結(jié)果表明，OLA-OVA用pH 4.0乙酸鈉緩沖液稀釋，OLA-OVA的最佳稀釋倍數(shù)為25 倍。選擇原則是條件盡可能溫和且成本低。

用EDC/NHS激活芯片。用pH 4.0的乙酸鈉溶液將OLA-OVA稀釋25 倍，以與芯片表面上的羧基結(jié)合。當(dāng)注射體積為60 μL時(shí)，結(jié)合趨勢(shì)基本保持不變。圖2顯示了綁定OLA-OVA到芯片表面的結(jié)果。

圖2 芯片表面抗原的結(jié)合Fig. 2 Binding of antigen on the chip surface

2.2 抗體結(jié)合質(zhì)量濃度的確定

將不同質(zhì)量濃度的OLA-Ab與已結(jié)合到芯片表面的OLA-OVA進(jìn)行結(jié)合。通過(guò)分析相應(yīng)的響應(yīng)值圖，當(dāng)抗體稀釋200～400 倍，結(jié)合趨勢(shì)減慢。為降低成本，確定OLA-Ab的最佳結(jié)合質(zhì)量濃度為10.8 mg/L（抗體稀釋400 倍）。每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次，每次結(jié)合后要進(jìn)行芯片的再生，結(jié)合結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同質(zhì)量濃度的抗體與OLA-OVA結(jié)合Fig. 3 Binding of different concentrations of antibodies to OLA-OVA

2.3 再生液的確定

如圖4所示，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，不同pH值的Gly-HCl不能將抗體與抗原分離，基線不能回到起始值，再生效果不理想；NaCl基線可以，但每次再生效果不穩(wěn)定；NaOH再生效果良好，基線基本平坦，結(jié)合水平基本穩(wěn)定，因此確定2.5 mmol/L NaOH溶液是最合適的再生劑。

圖4 不同再生劑的結(jié)果Fig. 4 Regeneration efficiencies of different regenerants

2.4 OLA標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

傳感器的檢測(cè)原理基于分析物與其抗原的間接競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)。將抗體與OLA混合，混合物注入傳感器芯片中。通過(guò)SPR檢測(cè)與OLA-OVA結(jié)合的抗體，從而將SPR獲得的響應(yīng)與OLA質(zhì)量濃度相關(guān)聯(lián)。在該實(shí)驗(yàn)中，將OLA-Ab（10.8 mg/L）與等體積不同質(zhì)量濃度的OLA混合，注入反應(yīng)池。為OLA-OVA與0、0.6、2、4、6、12、32、64、128 μg/L OLA之間競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 OLA與OLA-OVA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果Fig. 5 Results of competition between OLA and OLA-OVA

圖6顯示了抑制程度和OLA質(zhì)量濃度之間的依賴性曲線，證明了OLA對(duì)OLA-Ab和OLA-OVA之間結(jié)合反應(yīng)的抑制。抑制程度取決于與OLA-Ab混合的游離OLA質(zhì)量濃度的線性變化。在最佳條件下，線性檢測(cè)范圍為0.5～64.0 μg/L OLA，檢出限為0.5 μg/L（RSN=3），檢測(cè)時(shí)間為10 min。

圖6 OLA的SPR檢測(cè)擬合性曲線Fig. 6 Standard curve for SPR detection of OLA

2.5 特異性確定

用SPR方法測(cè)定抗體與OLA及其結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)評(píng)估抗體的特異性。從表1可以看出，OLA抗體與OLA結(jié)構(gòu)類似物（喹烯酮、卡巴多、鹽酸克倫特羅、氯霉素和乙酰甲喹）的交叉率均小于5%，表明該抗體可以特異性地識(shí)別OLA。

表1 SPR中OLA與OLA結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)Table 1 Cross-reactivity of OLA with analogues in SPR

2.6 樣品檢測(cè)結(jié)果

基質(zhì)效應(yīng)包括飼料中的維生素、蛋白質(zhì)、脂肪和水產(chǎn)養(yǎng)殖水中的固體雜質(zhì)和微生物。對(duì)于含有蛋白質(zhì)和脂肪的魚(yú)飼料和雞飼料樣品，通過(guò)離心、稀釋和超濾可以簡(jiǎn)單地減少基質(zhì)干擾。對(duì)于含有固體雜質(zhì)和微生物的魚(yú)養(yǎng)殖水和蝦養(yǎng)殖水樣，可以通過(guò)濾膜消除基質(zhì)效應(yīng)。

在養(yǎng)殖水和飼料樣品中加入5、20、40 μg/L OLA標(biāo)準(zhǔn)品。如表2所示，養(yǎng)殖水樣：回收率為84.7%～99.3%，變異系數(shù)（coefficients of variation，CV）為1.2%～8.3%。飼料樣品：回收率為89.3%～93.4%，CV為2.3%～10.1%。實(shí)驗(yàn)測(cè)得魚(yú)飼料、雞飼料、魚(yú)養(yǎng)殖水、蝦養(yǎng)殖水中的測(cè)定靈敏度分別為8.9、8.7、5.5 μg/L和5.9 μg/L。證明該方法可以用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

表2 SPR生物傳感器在3 個(gè)水平下的樣品回收率實(shí)驗(yàn)（n= 3）Table 2 Recoveries for samples at three spiked concentration levels (n= 3)

為驗(yàn)證該方法，同時(shí)用HPLC對(duì)樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，SPR與HPLC這2 種方法的檢測(cè)結(jié)果呈線性關(guān)系，線性方程式為y=0.983 5x+0.152 8，相關(guān)系數(shù)為0.997 2，表明兩種方法有較高的一致性。

建立的SPR方法用于檢測(cè)不同來(lái)源實(shí)際樣品水產(chǎn)養(yǎng)殖水和飼料中OLA的含量。多次檢測(cè)結(jié)果，在魚(yú)養(yǎng)殖水中，OLA質(zhì)量濃度為5.0 μg/L，雞飼料中OLA質(zhì)量濃度為6.1 μg/L；蝦養(yǎng)殖水與魚(yú)飼料中均未檢測(cè)到OLA，結(jié)果如表3所示。

表3 SPR方法檢測(cè)實(shí)際樣品的結(jié)果（n=3）Table 3 Results for detection of OLA in actual samples with SPR (n= 3)

2.7 芯片重復(fù)性

實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)合同源單、多克隆OLA抗體的芯片使用率進(jìn)行了對(duì)比，表4表明，單克隆抗體的親和性高于多克隆抗體，檢測(cè)時(shí)間比較短，但結(jié)合同源多克隆OLA-Ab的芯片用2.5 mmol/L NaOH溶液再生60 次，活性衰減只有2.5%，而結(jié)合單克隆抗體的芯片同樣再生15 次，芯片的活性衰減已經(jīng)為11.7%，檢出限與靈敏度也是多克隆抗體芯片比較好，因此，結(jié)合同源多克隆OLA-Ab，穩(wěn)定性和芯片回收率較好，該實(shí)驗(yàn)芯片具有良好的重復(fù)性，可重復(fù)使用。

表4 多克隆OLA-Ab與單克隆OLA-Ab的對(duì)比Table 4 Comparison of polyclonal OLA-Ab with monoclonal OLA-Ab

雖然單克隆抗體的親和力更強(qiáng)，但多克隆抗體可以識(shí)別多個(gè)表位，即使少量抗原表位被破壞或抗原的構(gòu)象發(fā)生變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不會(huì)受到影響，同時(shí)成本比較低，目前大多研究中均使用多克隆抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在我們的工作中，使用多克隆OLA-Ab。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)了一種固定在CM5芯片表面的OLA-OVA的SPR生物傳感器，用于檢測(cè)飼料和水樣中的OLA。該方法可以在樣品中檢測(cè)OLA時(shí)實(shí)現(xiàn)高效、快速、簡(jiǎn)便。樣品檢測(cè)可在10 min內(nèi)完成，包括結(jié)合180 s、解離300 s和再生60 次。OLA質(zhì)量濃度在0.5～64 μg/L內(nèi)有良好的線性，建立了SPR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)合同源多克隆OLA-Ab，SPR芯片良好的穩(wěn)定性，可以重復(fù)使用60 個(gè)循環(huán)，響應(yīng)值衰減小于5%。研究SPR對(duì)雞飼料、魚(yú)飼料、魚(yú)養(yǎng)殖水和蝦養(yǎng)殖水中OLA定量的測(cè)定，回收率為84.7%～99.3%，CV為1.2%～10.1%（n=3），并且該SPR方法與HPLC方法具有良好的一致性。而該方法的靈敏度是Zhao Dan等[25]采用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)OLA的3～4 倍，且成本低、時(shí)間短；是Zhao Dongyan等[26]采用新型的直接競(jìng)爭(zhēng)仿生ELISA法測(cè)定雛雞飼料中的OLA的136～161 倍；也比Le Tao等[27]開(kāi)發(fā)的ICG條帶檢測(cè)法更靈敏，是它的4 倍；比Peng Tao等[29]基于熒光微球的ICG法建立的用于同時(shí)檢測(cè)環(huán)境水和動(dòng)物食品中OLA的方法，用的時(shí)間更短，檢測(cè)更加靈敏。該SPR方法可用于全面快速和選擇性檢測(cè)飼料和水樣品中OLA。