蓋圣美，張中會(huì)，游佳偉，鄒玉峰，劉登勇,,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

豬肉作為一種傳統(tǒng)肉類食品，在肉及肉制品消費(fèi)中一直占主體地位，其摻假、造假相關(guān)問題也一直受到廣大消費(fèi)者的關(guān)注。豬肉摻假、造假的方法[1-2]可分為兩種：一種是以次充好，如用劣質(zhì)豬肉冒充優(yōu)質(zhì)豬肉；另一種是通過非法手段增加豬肉的質(zhì)量，如向豬肉中注水、注膠等。由于注水豬肉幾乎無需任何成本、獲利高且不存在任何技術(shù)門檻，在摻假、造假豬肉中較為常見。注水處理會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分流失，降低豬肉的食用價(jià)值，同時(shí)也加速了肉塊腐敗變質(zhì)的速度[3]。

傳統(tǒng)的水分含量測(cè)定方法，如干燥法、蒸餾法、卡爾·費(fèi)休法等，普遍存在操作繁瑣、測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)。因此，急需一種快速、有效檢測(cè)水分含量的方法。目前可用于測(cè)定/預(yù)測(cè)水分含量的方法有微波法[4]、生物電阻抗法[5]、光譜成像技術(shù)，如近紅外光譜成像技術(shù)[6-7]、多光譜成像技術(shù)[8]、高光譜成像技術(shù)[9-12]、低場(chǎng)核磁共振技術(shù)[13-14]等。低場(chǎng)核磁共振技術(shù)與其他檢測(cè)方法相比不僅具有檢測(cè)速度快、對(duì)樣品無損傷、無需預(yù)處理、實(shí)時(shí)獲得數(shù)據(jù)等特點(diǎn)，同時(shí)還能反映肉與肉制品中水分子的存在形式及分布狀態(tài)[15-16]。

目前低場(chǎng)核磁共振技術(shù)在肉品領(lǐng)域的應(yīng)用還多局限于對(duì)樣品的定性分析，在定量檢測(cè)方面如樣品中水分的定量檢測(cè)還相對(duì)較少。利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)所獲得的峰積分面積與樣品中所包含的氫質(zhì)子數(shù)有關(guān)[17]。因此，可將峰面積的變化應(yīng)用于樣品中水分含量的定量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)具體內(nèi)容如下：1）利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)，研究注射不同比例去離子水對(duì)豬肉內(nèi)部水分子弛豫特性的影響；2）探索水分含量與低場(chǎng)核磁共振技術(shù)水分子弛豫特性的關(guān)系，通過建立相關(guān)表達(dá)式，對(duì)未知樣品中的水分作出預(yù)測(cè)；3）對(duì)不同預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定最優(yōu)預(yù)測(cè)模型，并分析可能對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響的因素。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肉背最長(zhǎng)肌 遼寧錦州市大潤(rùn)發(fā)超市。

1.2 儀器與設(shè)備

PQ001型低場(chǎng)核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選擇10 條新鮮的豬肉背最長(zhǎng)肌，剔除肌肉表面的脂肪和結(jié)締組織，沿肌肉走向垂直方向?qū)⒚織l最長(zhǎng)肌分切成6 塊（6 cmh6 cmh4 cm）。對(duì)照組不做任何處理，實(shí)驗(yàn)組分別按肉樣質(zhì)量的5%、10%、15%、20%、25%注射去離子水。注水時(shí)每個(gè)樣品取9 個(gè)注水點(diǎn)，注水點(diǎn)與注水點(diǎn)間距2 cm，注水深度2 cm，使注水位點(diǎn)在樣品中均勻分布。注水完成后將肉樣于室溫條件下靜置30 min，使注射的水分在其中分布均勻。30 min之后用濾紙吸干肉樣表面水分，稱量質(zhì)量，樣品質(zhì)量相對(duì)于注水前增加的百分比，記為有效注水量。

1.3.2 注水豬肉水分子弛豫信息采集

用取樣器（內(nèi)徑1.0 cm）取高度為1.5 cm左右的樣品（每個(gè)樣品精確稱量至0.000 1 g）于核磁管中，加塞后放入低場(chǎng)核磁設(shè)備磁體腔中采集T2弛豫信息。每個(gè)待測(cè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值作為其有效值。每個(gè)注水比例均設(shè)置5 個(gè)平行，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)10 次，共獲取300 個(gè)樣品的水分弛豫信息。低場(chǎng)核磁共振技術(shù)測(cè)試參數(shù)[18]：重復(fù)采樣等待時(shí)間3.5 s；半回波時(shí)間150 μs；回波個(gè)數(shù)3 000；重復(fù)掃描次數(shù)16。

1.3.3 一元線性回歸（linear regression，LR）模型建立

稱取不同質(zhì)量的去離子水于色譜瓶中，之后將色譜瓶放入核磁管，采集去離子水的T2弛豫信息。以去離子水質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立去離子水質(zhì)量與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。低場(chǎng)核磁共振技術(shù)測(cè)試參數(shù)：重復(fù)采樣等待時(shí)間15 000 ms；半回波時(shí)間800 μs；回波個(gè)數(shù)13 000；重復(fù)掃描次數(shù)16。

1.3.4 PLSR、MLR模型的建立

所有的豬肉樣品分為校準(zhǔn)集、驗(yàn)證集兩組，注水比例為0%、5%、15%、25%的樣品作為校準(zhǔn)集，用來建立預(yù)測(cè)模型。注水比例10%、20%的樣品作為驗(yàn)證集，用來評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。取校準(zhǔn)集豬肉樣品的核磁數(shù)據(jù)作為自變量，水分含量作為因變量，用Unscrambler 9.7數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）、多元線性回歸（multiple linear regression，MLR）預(yù)測(cè)模型。取驗(yàn)證集豬肉樣品的核磁數(shù)據(jù)代入PLSR、MLR預(yù)測(cè)模型，得到驗(yàn)證集中豬肉水分含量的預(yù)測(cè)值。預(yù)測(cè)模型的評(píng)價(jià)從校準(zhǔn)集相關(guān)系數(shù)rc、均方根誤差（root mean square error，RMSEc）、驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)rp、RMSEp4 個(gè)方面考慮。相關(guān)系數(shù)r和RMSE分別根據(jù)式（1）和式（2）計(jì)算：

式中：r為相關(guān)系數(shù)；n為豬肉樣本數(shù)；yi為豬肉樣品真實(shí)水分含量；y為yi的平均值；i為豬肉樣品預(yù)測(cè)水分含量； 為i的平均值。

式中：yi為豬肉樣品真實(shí)水分含量；i為預(yù)測(cè)水分含量；n為樣本數(shù)。

1.3.5 水分含量的測(cè)定

參照GB 5009.3ü2016《食品中水分的測(cè)定》[19]。將待測(cè)樣品放入干燥至質(zhì)量恒定的稱量瓶，于105 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥4 h后，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱量，重復(fù)以上操作至質(zhì)量恒定。樣品中水分含量按式（3）計(jì)算：

式中：m0為烘干前豬肉樣品的質(zhì)量；m1為烘干至質(zhì)量恒定時(shí)樣品的質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用系統(tǒng)自帶反演軟件對(duì)CPMG衰減曲線進(jìn)行反演擬合，得到弛豫時(shí)間、峰面積、峰面積比等弛豫數(shù)據(jù)；采用SPSS 19.0對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；通過Unscrambler 9.7數(shù)據(jù)分析軟件建立預(yù)測(cè)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 注水豬肉有效注水量、水分含量

表1 豬肉注水量、水分含量的測(cè)定Table 1 Water injection ratio and water content of water-injected pork

從表1可以看出，有效注水量的變化率隨實(shí)際注水量的增加有所減小，當(dāng)實(shí)際注水量分別20%、25%時(shí)，有效注水量不再發(fā)生顯著性變化（P＜0.05）。這說明當(dāng)注水量小于20%時(shí)，肉塊對(duì)外來水分的吸附速率比較高，隨著注水比例進(jìn)一步增加，肉塊吸附水的速率下降[8]。25%組的有效注水量和20%組相比，雖然統(tǒng)計(jì)差異不顯著，但是仍然呈增加的趨勢(shì)。正常豬肉的平均水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.97%，注水后豬肉的平均水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在76.98%～79.25%之間，均明顯高于正常豬肉（P＜0.05）。

2.2 注射去離子水對(duì)豬肉水分子弛豫圖譜的影響

圖1 注水豬肉多組分?jǐn)M合橫向弛豫圖譜Fig. 1 Distribution of multi-exponentially fi tted T2 relaxation time spectra of water-injected pork

肉與肉制品中的水分子主要以自由水、不易流動(dòng)水和結(jié)合水3 種形式存在，對(duì)于不同存在形式的水分子，其流動(dòng)性也會(huì)存在一定差異，自由水流動(dòng)性最強(qiáng)、不易流動(dòng)水次之、結(jié)合水流動(dòng)性最差，而低場(chǎng)核磁共振技術(shù)中的橫向弛豫時(shí)間（T2值）可反映肉與肉制品中水分子流動(dòng)性的強(qiáng)弱[20-22]。結(jié)合水（T2b）的T2值在0～10 ms之間，不易流動(dòng)水（T21）的T2值在30～60 ms之間，而自由水（T22）的T2值在100～400 ms之間[23-24]。因此，根據(jù)T2值大小的不同，可以對(duì)肉與肉制品中水分子的存在形式作出定性判斷，而根據(jù)峰面積的大小則可以反映樣品中對(duì)應(yīng)組分水的多少[25]。如圖1所示，通過測(cè)量不同比例注水豬肉水分子的橫向弛豫時(shí)間發(fā)現(xiàn)，注水豬肉水分子橫向弛豫圖譜上存在4 個(gè)明顯的水分群，與注膠蝦[26]中水分分布情況一致。圖中4 個(gè)峰從左到右依次代表緊密結(jié)合水（T2b）、結(jié)合水（T2b’）、不易流動(dòng)水（T21）、自由水（T22）[27]。結(jié)果表明，與正常豬肉相比，注水豬肉不易流動(dòng)水、自由水對(duì)應(yīng)峰變化比較明顯。其中，不易流動(dòng)水的弛豫時(shí)間無顯著變化（P＞0.05），而峰面積比顯著減?。≒＜0.05），自由水的弛豫時(shí)間、峰面積比均顯著增加（P＜0.05）。

2.3 低場(chǎng)核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法預(yù)測(cè)豬肉中的水分含量

圖1可以直觀地反映注水豬肉中水分子的存在形式及分布狀態(tài)，但還不能根據(jù)弛豫圖譜對(duì)樣品中的水分進(jìn)行定量分析。多組分弛豫圖譜中信號(hào)峰的積分面積與樣品中所包含的氫質(zhì)子數(shù)有關(guān)[17]，因此可通過建立峰面積與水分含量關(guān)系模型對(duì)豬肉中的水分含量定量分析。

通過采集不同質(zhì)量去離子水的核磁信號(hào)，可得到去離子水質(zhì)量與峰面積的關(guān)系。隨著去離子水質(zhì)量的增加，峰面積也隨之增大。對(duì)峰面積（Y）與去離子水質(zhì)量（X）進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程E0：Y=14 084X+148.8，rc=1，可知去離子水質(zhì)量與峰面積具有較好的擬合性，說明利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)定量檢測(cè)樣品中的水分具有一定的可行性。

2.3.1 利用LR模型預(yù)測(cè)豬肉中的水分含量

圖2 根據(jù)豬肉中水分子的總峰面積（a）和不易流動(dòng)水與自由水峰面積（b）預(yù)測(cè)豬肉中的水分含量Fig. 2 Prediction of moisture content in pork based on total peak area (a)and peak areas of immobilized and free water (b)

分別選取豬肉樣品中水分子的總峰面積、不易流動(dòng)水和自由水峰面積之和代入回歸方程E0中，得到豬肉中水分含量的預(yù)測(cè)值y1、y2，水分含量的真實(shí)值x通過干燥法獲得。預(yù)測(cè)值y1、y2與真實(shí)水分含量x的關(guān)系如圖2所示。由圖2可知，基于總峰面積預(yù)測(cè)得到的豬肉水分含量與真實(shí)水分含量相關(guān)系數(shù)rp為0.31，而基于不易流動(dòng)水和自由水峰面積預(yù)測(cè)水分含量與真實(shí)水分含量相關(guān)系數(shù)rp為0.45，且后者相對(duì)于前者有較小的RMSEp值。由此可知，通過不易流動(dòng)水和自由水峰面積預(yù)測(cè)豬肉中的水分含量可得到相對(duì)較好的預(yù)測(cè)結(jié)果，這與陳琳莉等[28]在研究低場(chǎng)核磁共振法測(cè)定不同肉類水分含量中所得結(jié)果一致。

2.3.2 利用PLSR、MLR模型預(yù)測(cè)豬肉中的水分含量

圖3 注水豬肉PLSR模型建立（a）和驗(yàn)證（b）的散點(diǎn)分布圖Fig. 3 Scatter plots of training (a) and validation (b) set for PLSR model

通過LR模型對(duì)豬肉樣品中的水分含量進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，RMSEp值最小可以達(dá)到1.79%，而相關(guān)系數(shù)rp值最高僅為0.45，可見豬肉水分含量預(yù)測(cè)模型需經(jīng)進(jìn)一步的改進(jìn)。PLSR、MLR預(yù)測(cè)模型是比較常見的多元數(shù)據(jù)分析方法，其預(yù)測(cè)精度會(huì)隨著相關(guān)變量和觀察值的增加而提高。近年來，PLSR、MLR建模逐漸被應(yīng)用到食品領(lǐng)域[29-31]。本實(shí)驗(yàn)在LR模型的基礎(chǔ)之上，通過PLSR、MLR建模的方法對(duì)注水豬肉中的水分進(jìn)行定量檢測(cè)。

圖4 注水豬肉MLR模型建立（a）和驗(yàn)證（b）的散點(diǎn)分布圖Fig. 4 Scatter plots of training (a) and validation (b) set for MLR model

由圖3和圖4可以看出，PLSR、MLR校正集相關(guān)系數(shù)rc均在0.95以上，說明真實(shí)水分含量與預(yù)測(cè)水分量有較好的相關(guān)性，RMSEc值均在0.5%以下，說明模型有較高的預(yù)測(cè)精度。PLSR、MLR驗(yàn)證集結(jié)果表明，真實(shí)水分含量與預(yù)測(cè)水分含量相關(guān)系數(shù)rp均在0.85以上，RMSEp值均不超過0.60%，這說明低場(chǎng)核磁結(jié)合PLSR、MLR模型可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)注水豬肉中的水分含量。進(jìn)一步比較PLSR、MLR模型發(fā)現(xiàn)，無論是校準(zhǔn)集還是驗(yàn)證集，MLR模型都有更高的r和更小的RMSE，這說明MLR模型有相對(duì)較好的預(yù)測(cè)效果。

綜上所述，LR模型相對(duì)于PLSR、MLR而言，建模過程簡(jiǎn)單，但預(yù)測(cè)精度偏低。PLSR、MLR模型雖然需要采集一部分樣品的信息作為訓(xùn)練樣本，但預(yù)測(cè)精度相比LR模型有很大提高。進(jìn)一步比較PLSR、MLR模型發(fā)現(xiàn)，MLR模型的預(yù)測(cè)結(jié)果較好。

3 結(jié) 論

本研究表明，通過多組分弛豫圖譜可以直觀地反映正常豬肉、注水豬肉中水分分布的差異，而通過建立回歸預(yù)測(cè)模型則可對(duì)豬肉中的水分做定量檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，注水后不易流動(dòng)水峰面積比（P21）顯著減小，自由水弛豫時(shí)間（T22）、峰面積比（P22）顯著增加（P＜0.05）。基于水分質(zhì)量與峰面積關(guān)系所建立的LR模型（rc=1）對(duì)豬肉中的水分含量做了定量檢測(cè)，得到rp為0.31，RMSEp為4.02%，優(yōu)化后rp為0.45，RMSEp為1.79%。在此基礎(chǔ)上建立了PLSR、MLR預(yù)測(cè)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)水分含量預(yù)測(cè)精度比LR模型明顯提高，而通過比較PLSR、MLR兩種預(yù)測(cè)模型發(fā)現(xiàn)，MLR預(yù)測(cè)模型相對(duì)于PLSR模型有更好的預(yù)測(cè)結(jié)果（rp為0.90，RMSEp為0.57%）。綜上所述，低場(chǎng)核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)可作為注水豬肉定性、定量檢測(cè)的一種有效方法。