洪偉，萬(wàn)雯，崔古貞，官志忠，齊曉嵐，禹文峰

·綜 述·

艱難梭菌基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展

洪偉1,2，萬(wàn)雯3，崔古貞4，官志忠1,2，齊曉嵐1,2，禹文峰1,2

1貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004 2貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004 3貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004 4貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004

艱難梭菌是一種革蘭氏陽(yáng)性、產(chǎn)芽孢、專(zhuān)性厭氧細(xì)菌，是醫(yī)院相關(guān)性腹瀉的主要病原體。近年來(lái)，隨著強(qiáng)毒株的出現(xiàn) (如核糖體027型)，其流行性與致死率逐年上升，因此對(duì)艱難梭菌生理、生化特征及致病機(jī)制的研究受到廣泛重視。艱難梭菌生理、生化特征及致病機(jī)制研究又以建立其穩(wěn)定、高效的基因編輯方法為必要前提。借助基因編輯工具，研究者可以擾動(dòng)艱難梭菌核心生物學(xué)過(guò)程，在分子水平研究其分子致病機(jī)制如ClosTron技術(shù)在艱難梭菌毒素A (Toxin A) 和毒素B (Toxin B) 與其致病力關(guān)系的研究中起到了關(guān)鍵作用。文中以時(shí)間為主線綜述了艱難梭菌基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程和最新進(jìn)展，并對(duì)艱難梭菌基因編輯技術(shù)未來(lái)的研究方向進(jìn)行展望。

艱難梭菌，艱難梭菌感染，基因編輯，基因功能研究，致病機(jī)制

1953年Hall與O’Toole首次從新生兒糞便樣本中分離到艱難梭菌[1]。艱難梭菌是一種革蘭氏陽(yáng)性、產(chǎn)芽孢、專(zhuān)性厭氧棒狀桿菌。20世紀(jì)70年代末，研究者確認(rèn)艱難梭菌導(dǎo)致20%–25%的抗生素相關(guān)性腹瀉[2]。艱難梭菌感染(infection，CDI) 的主要癥狀有腹瀉、腹痛、發(fā)燒、中毒性巨結(jié)腸、腸道穿孔等[3]。從2000年開(kāi)始，北美、歐洲、亞洲CDI發(fā)病率和致死率明顯增加[4]。如2002年艱難梭菌強(qiáng)毒株的出現(xiàn)(核糖體BI/NAP1/027型，同時(shí)產(chǎn)生毒素A、毒素B和二元毒素)，導(dǎo)致CDI在歐洲大面積暴發(fā)，其致病率與致死率顯著提高[3,5]。如今，在北美和歐洲，每10 000例住院病人中，就有7例CDI患者。CDI已成為醫(yī)院獲得性感染中的首要疾病[6-7]。在全球CDI防控形勢(shì)嚴(yán)峻的前提下，2013年美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心將艱難梭菌與抗碳青霉烯的腸桿菌及耐藥性淋病奈瑟菌并列為3種最緊急的多重耐藥病原微生物[8-9]。

隨著CDI致病率的逐年提高，研究人員想要通過(guò)建立艱難梭菌基因編輯系統(tǒng)，以研究其生理、生化特征和致病機(jī)制。2003年，Roberts等在艱難梭菌中建立的基于Tn916的反義RNA干擾技術(shù)，揭示了細(xì)胞壁結(jié)合蛋白66 (Cell wall protein 66，Cwp66)對(duì)艱難梭菌的細(xì)胞黏附能力的貢獻(xiàn)[10]。2007年，Heap等基于乳酸球菌()基因(Ll.ltrB) 二型內(nèi)含子建立了ClosTron基因失活方法。應(yīng)用該方法Heap等揭示了(The master regulator of sporulation)、(Spore cortex-lytic enzymes)基因在艱難梭菌芽孢產(chǎn)生中的調(diào)控作用[11-13]，驗(yàn)證了毒素A與毒素B都具有細(xì)胞毒性和致病能力[14]，修正了毒素A不能單獨(dú)引起腸炎的結(jié)論[15]。2010年，基于隨機(jī)突變技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了基因?qū)τ谄D難梭菌芽孢產(chǎn)生具有貢獻(xiàn)[16]。2012年，基于尿嘧啶合成缺陷突變株(Δ) 的基因敲除方法的建立，修正了負(fù)調(diào)控毒素基因表達(dá)的假說(shuō)[17]。2013年，基于Δ基因的非等長(zhǎng)同源臂偶聯(lián)等位交換(Allele-coupled exchange，ACE) 技術(shù)的建立，使得基因的功能得以揭示[18-19]。除此之外，基因與毒素基因表達(dá)調(diào)控關(guān)系的闡明[20]、鞭毛蛋白編碼基因在艱難梭菌中的多基因調(diào)控功能的闡明[21]，以及艱難梭菌疫苗的研發(fā)[22]，都是以基因編輯技術(shù)的建立為前提。由此可見(jiàn)，艱難梭菌基因編輯技術(shù)的建立對(duì)于研究其生理、生化特征和致病機(jī)制至關(guān)重要。

艱難梭菌基因編輯技術(shù)經(jīng)歷了反義RNA干擾技術(shù)、ClosTron技術(shù)、轉(zhuǎn)座子隨機(jī)基因失活技術(shù)、ACE技術(shù)和CRISPR-Cas技術(shù)等不同發(fā)展階段(圖1)。文中以時(shí)間為主線，綜述艱難梭菌基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展并展望未來(lái)的發(fā)展方向。

圖1 艱難梭菌基因編輯技術(shù)的不同發(fā)展階段[10-11, 16, 19, 23-30]

1 艱難梭菌基因編輯的前提條件(2002– 2004年)

實(shí)現(xiàn)艱難梭菌基因編輯需3個(gè)前提條件： 1) 基因組序列測(cè)定完成[31]；2) 建立可在大腸桿菌-艱難梭菌中穿梭復(fù)制的質(zhì)粒系統(tǒng)；3) 突破限制性?xún)?nèi)切酶屏障，建立外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法，詳述如下。

1.1 基因組序列信息

基因組序列信息包含：基因序列、基因注釋和基因排列方式等信息，是基因編輯技術(shù)建立的重要前提。2006年，Mohammed等發(fā)表了艱難梭菌630菌株(630，630)的全基因組序列[31]，該研究發(fā)現(xiàn)630基因組中包含大量可移動(dòng)的基因元件(11%)，這些可移動(dòng)基因元件可能與抗生素抗性、菌株毒力、與宿主相互作用等機(jī)制具有密切關(guān)系。2015年，Eijk等測(cè)定了630Δ(紅霉素敏感) 菌株的全基因組序列，該菌株基因組與630菌株共有71個(gè)位點(diǎn)不同，包括8個(gè)刪除突變、10個(gè)插入突變和50個(gè)堿基替換突變等不同突變形式[32]。630與630Δ菌株基因組序列的公布，為后續(xù)基因編輯技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1.2 建立可在大腸桿菌-艱難梭菌中穿梭復(fù)制的質(zhì)粒系統(tǒng)

2002年，Purdy等發(fā)現(xiàn)了630內(nèi)源質(zhì)粒pCD6，該質(zhì)粒大小為6 829 bp，GC含量為24.5%，包含5個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，)：、、、和(圖2)[23, 33]。大小為3 994 bp，編碼復(fù)制蛋白，其下游有一段重復(fù)序列，可驅(qū)動(dòng)質(zhì)粒在630中復(fù)制。編碼未知功能肽段且不是復(fù)制必需的。和也位于復(fù)制區(qū)域，但是功能未知。編碼長(zhǎng)度為187個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與胞壁酰五肽羧肽酶有相似性，推測(cè)參與細(xì)胞壁的生物合成。Purdy等使用pCD6復(fù)制子 () 構(gòu)建了pMTL9301質(zhì)粒，該質(zhì)粒在艱難梭菌中的轉(zhuǎn)化效率較高(5.7×10–5轉(zhuǎn)化子/質(zhì)粒供體)。連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)表明，pMTL9301在艱難梭菌中可以穩(wěn)定復(fù)制。在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中連續(xù)32次傳代后，僅有8%的克隆丟失質(zhì)粒。相比之下，pMTL9401 (pB102復(fù)制子) 在同樣的培養(yǎng)條件下，有96%的菌體丟失了質(zhì)粒[23]。因此pCD6復(fù)制子被用于構(gòu)建大腸桿菌-艱難梭菌穿梭質(zhì)粒[34]。該質(zhì)?？稍诖竽c桿菌(CA434) 協(xié)助質(zhì)粒 (Helper plasmid) 的幫助下，通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)入艱難梭菌中，并可在其中穩(wěn)定復(fù)制[23]。

圖2 pCD6質(zhì)粒圖譜

1.3 突破限制性?xún)?nèi)切酶屏障，建立外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法

限制性酶修飾系統(tǒng)(Restriction/modification system，RM系統(tǒng))是一種微生物應(yīng)對(duì)外源DNA入侵的防御機(jī)制[35]。RM系統(tǒng)由限制性?xún)?nèi)切酶和DNA甲基化酶組成。DNA甲基化酶通過(guò)對(duì)自身DNA的甲基化，保護(hù)其免受自身限制性?xún)?nèi)切酶切割，否則則被限制性?xún)?nèi)切酶降解。實(shí)現(xiàn)外源DNA轉(zhuǎn)化艱難梭菌的前提條件是突破其固有的RM系統(tǒng)，可以通過(guò)兩種方式實(shí)現(xiàn)：1) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化之前，在體外修飾或刪除質(zhì)粒中的限制性?xún)?nèi)切酶切割位點(diǎn)，從而保護(hù)外源質(zhì)粒不受內(nèi)源性的限制性?xún)?nèi)切酶切割[23]；如pMTL9301質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化3和6菌株之前，質(zhì)粒上的Ⅰ位點(diǎn)被同義突變，從而避免了3和6菌株的RM系統(tǒng)對(duì)質(zhì)粒的切割[23]；2) 失活宿主菌株內(nèi)部的RM系統(tǒng)。如在解纖維梭菌中敲除2866基因(該基因編碼Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶)[36]；在丙酮丁醇梭菌ATCC 824和DSM 1731菌株中失活基因后(編碼Ⅱ型限制性?xún)?nèi)切酶)，外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率顯著提高[37, 38]。在巴氏梭菌24 ()菌株中采用類(lèi)似的方法，也獲得了較高的外源DNA轉(zhuǎn)化效率[39]。

不同艱難梭菌的限制性酶修飾系統(tǒng)具有明顯的差異，如在6菌株中存在兩種RM系統(tǒng)：96Ⅰ/M.96Ⅰ(5′-GGNMCC-3′) 與Ⅰ/M.Ⅰ(5′-GMATC-3′)，而3只有Ⅱ型限制性?xún)?nèi)切酶Ⅰ，該酶識(shí)別并切割5′-CATCG-3′序列。另外，630菌株中并未發(fā)現(xiàn)RM屏障[23]。隨著基因組測(cè)序和分析技術(shù)的進(jìn)步，出現(xiàn)了計(jì)算機(jī)程序輔助的RM系統(tǒng)預(yù)測(cè)方法，如REBASE (http://rebase.neb.com/rebase/) 網(wǎng)站預(yù)測(cè)了常見(jiàn)微生物的RM系統(tǒng)編碼信息。研究者可以通過(guò)該網(wǎng)站查詢(xún)某菌株RM系統(tǒng)信息，從而有針對(duì)性地失活其RM系統(tǒng)。綜上所述，在測(cè)定了艱難梭菌全基因組序列、獲得了艱難梭菌復(fù)制元件和揭示了艱難梭菌不同菌株的RM系統(tǒng)后，基本具備了建立艱難梭菌基因編輯方法的3個(gè)前提。

2 基于Tn916的反義RNA技術(shù)(2003年)

2003年Roberts等利用來(lái)源于枯草芽孢桿菌的Tn916轉(zhuǎn)座子，攜帶一段反義RNA編碼序列下調(diào)基因的表達(dá)。Cwp66蛋白含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端與枯草芽孢桿菌CwlB (Peptidoglycan recognition domain) 具有同源性；C端結(jié)構(gòu)域定位在細(xì)胞膜的表面[40]，因此推測(cè)其與艱難梭菌細(xì)胞黏附功能有關(guān)。Tn916是一種廣宿主結(jié)合轉(zhuǎn)移元件，并為宿主提供四環(huán)素抗性(TcR) 決定基因[41]。該轉(zhuǎn)座子可在破傷風(fēng)梭菌[42]和丙酮丁醇梭菌[36]基因組中跳躍，且跳躍位點(diǎn)具有明顯的偏好性[43]。利用該特性，Roberts等首先克隆并改造了Tn916轉(zhuǎn)座子，在其中加入了基因反義RNA表達(dá)框。將該改造后的轉(zhuǎn)座子作為供體結(jié)合轉(zhuǎn)移至630菌株，從而嘗試降低基因的表達(dá)量(圖3)[10]。然而，該研究并沒(méi)有顯著降低Cwp66蛋白的表達(dá)和改變艱難梭菌對(duì)細(xì)胞的粘附能力，作者推測(cè)可能的原因是：1) Cwp66蛋白本身可能并不參與艱難梭菌與細(xì)胞的黏附過(guò)程；2) 基于Tn916的反義RNA并未發(fā)揮作用。除此之外，基于Tn916轉(zhuǎn)座子的反義RNA技術(shù)還具有如下局限性：1) Tn916在基因組中 的插入位點(diǎn)具有較強(qiáng)的偏好性，使得該技術(shù)并 不適合用于隨機(jī)突變和理性靶向突變；2) 該技術(shù)產(chǎn)生的反義RNA的量對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)能力有限。

3 ClosTron技術(shù)(2007年)

2007年，梭菌基因編輯的先驅(qū)Minton研究組，Heap等將來(lái)源于乳酸球菌基因的Ll.ltrB二型內(nèi)含子與穿梭質(zhì)粒融合，開(kāi)發(fā)了首個(gè)能夠在梭菌中通用的基因失活工具——ClosTron，該系統(tǒng)借助二型內(nèi)含子可重編碼的“歸巢(Retrohoming)”效應(yīng)[44-45]，成功地在艱難梭菌、丙酮丁醇梭菌和生孢梭菌等菌株中實(shí)現(xiàn)了靶向基因失活(圖4)[12,24-27]。該研究組在接下來(lái)的工作中進(jìn)一步改進(jìn)了ClosTron系統(tǒng)，如在ClosTron質(zhì)粒上加入了轉(zhuǎn)座激活篩選基因(Retrotransposition- activated marker，RAM)，從而提高了突變株的篩選效率[46]；建立了免費(fèi)的引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站http://clostron.com，提高打靶效率；在質(zhì)粒載體構(gòu)建過(guò)程中加入藍(lán)白斑篩選標(biāo)記，從而提高載體構(gòu)建和篩選的效率[25]。

圖3 基于Tn916的反義RNA敲降cwp66基因表達(dá)[10]

ClosTron技術(shù)可在10–14 d內(nèi)快速獲得靶基因失活突變株，因此極大地提高了梭菌屬細(xì)菌突變株構(gòu)建效率。該技術(shù)目前仍是艱難梭菌突變株構(gòu)建的主要工具，并被深度開(kāi)發(fā)為艱難梭菌必需基因檢測(cè)手段[47]。2010年Minton研究組發(fā)表了使用ClosTron技術(shù)對(duì)艱難梭菌毒素基因的研究結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)Toxin A和Toxin B都具有細(xì)胞毒性，并都能夠單獨(dú)在倉(cāng)鼠模型中誘導(dǎo)腸道疾病的發(fā)生[15]。

ClosTron系統(tǒng)的核心元件二型內(nèi)含子(GroupⅡintron) 是具有催化活性的核酶，其剪接機(jī)制與Ⅰ型內(nèi)含子的剪接相似，也需要形成一個(gè)套索的中間體，通過(guò)5′-2′磷酸二酯鍵將剪接的位點(diǎn)連接到一起。與Ⅰ型內(nèi)含子不同的是Ⅱ型內(nèi)含子具有自我剪接的功能(核酶活性)，不需要剪接體和核小RNA (snRNA) 的參與，也不需要ATP供能[48]。

ClosTron系統(tǒng)借助Ⅱ型內(nèi)含子“歸巢”效應(yīng)，即具有核酶活性Ⅱ型內(nèi)含子RNA在IEP (Intron encoded protein) 的協(xié)助下，插入DNA鏈靶位點(diǎn)的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)任意靶基因的插入失活。來(lái)源于乳酸球菌的Ll.ltrBⅡ型內(nèi)含“歸巢”過(guò)程分為兩個(gè)階段(圖4)。第一階段，Ⅱ型內(nèi)含子RNA前體“自我拼接”形成套索RNA和重組的外顯子(圖4A)[49]；第二階段，套索RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)輔助下“歸巢”至靶DNA位點(diǎn)[50](圖4)。

圖4 ClosTron系統(tǒng)的自我剪接及“歸巢”[48-49]

綜上所述，Ⅱ型內(nèi)含子由具有核酶催化活性的Ⅱ型內(nèi)含子RNA和IEP組成。Ⅱ型內(nèi)含子RNA“自我拼接”成套索RNA，套索RNA與IEP形成核糖核蛋白復(fù)合體(RNPs)，RNPs通過(guò)“歸巢”效應(yīng)特異性地插入、失活靶基因，該過(guò)程可以通過(guò)重新編碼內(nèi)含子識(shí)別位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)打靶位點(diǎn)的“重編程”[51]。

4 基于Himar1C9的艱難梭菌隨機(jī)失活工具(2010年)

如前文所述，Tn916轉(zhuǎn)座子被用于艱難梭菌基因編輯[10]，然而，Tn916轉(zhuǎn)座子識(shí)別位點(diǎn)特異性高，突變體庫(kù)豐度低，不適合改造成基因組隨機(jī)失活工具[16]。來(lái)源于角蠅的Himar1C9轉(zhuǎn)座子，屬于mariner/Tc1轉(zhuǎn)座子家族[52-53]，靶向TA二核苷酸識(shí)別位點(diǎn)[54]，可以在多種微生物基因組中活躍跳躍[55-56]。其轉(zhuǎn)座過(guò)程如圖5所示，DNA雙鏈被轉(zhuǎn)座子切割出2 nt粘性末端，產(chǎn)生3′-羥基。切割產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座子可在染色體中跳躍，插入基因組中其他TA位點(diǎn)[54]。Mimar19轉(zhuǎn)座子靶序列識(shí)別范圍廣，且相對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)，因此構(gòu)建突變株單插入率高達(dá)98.3%；不僅如此，Himar1可自我催化完成轉(zhuǎn)座全過(guò)程，無(wú)需其他蛋白輔助，便于打靶載體構(gòu)建。因此，Cartman等將Himar1C9改造成了艱難梭菌隨機(jī)突變工具，并應(yīng)用該工具建立了艱難梭菌R20291突變體庫(kù)。對(duì)該突變體庫(kù)的篩選，獲得了芽孢復(fù)蘇蛋白酶基因突變株和嘧啶生物合成營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因突變株。

5 基于codA基因的精確基因失活系統(tǒng)(2012年)

Cartman等將來(lái)源于大腸桿菌的胞嘧啶脫氨基酶基因(Cytosine deaminase gene，) 作為負(fù)篩選標(biāo)記，在艱難梭菌中建立了無(wú)痕基因編輯系統(tǒng)。CodA蛋白催化胞嘧啶脫氨基形成尿嘧啶。該酶底物特異性不高，也可以催化無(wú)毒嘧啶類(lèi)似物5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC) 為具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)。5-FU在尿嘧啶磷酸生物合成轉(zhuǎn)移酶(Uracil phosphoribosyltransferase，EC 2.4.2.9) 的催化下，經(jīng)過(guò)下游反應(yīng)不可逆地抑制胸腺嘧啶合成酶的活性(核苷酸生物合成的關(guān)鍵酶)，并錯(cuò)誤地將5-FU引入DNA和RNA中，導(dǎo)致宿主死亡。利用CodA可將無(wú)毒5-FC轉(zhuǎn)化為較強(qiáng)細(xì)胞毒性的5-FU的特性，將基因與尿素磷酸轉(zhuǎn)移酶(UPP) 基因共表達(dá)，作為反向篩選標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)艱難梭菌無(wú)痕的靶向基因敲除(圖6)。有趣的是，單交換的艱難梭菌在BHIS平板上形成的菌落因比未發(fā)生單交換菌株形成的菌落大，可以直觀地通過(guò)菌落的大小判斷是否發(fā)生單交換，因此該質(zhì)粒骨架也被形象地稱(chēng)為“假自殺”質(zhì)粒[18]。

圖5 mariner/Tc1轉(zhuǎn)座子家族轉(zhuǎn)座模型[16]

圖6 基于codA基因的無(wú)痕基因失活過(guò)程[18]

6 基于非等長(zhǎng)同源臂偶聯(lián)等位交換的艱難梭菌精確、無(wú)痕基因編輯技術(shù)(2013年)

2012年Heap等發(fā)表了非等長(zhǎng)同源臂偶聯(lián)等位交換(Allele-coupled exchange，ACE) 基因編輯方法[57]。該方法基于Δ突變株(乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶突變株，orotate phosphoribosyltransferasemutant)和非等長(zhǎng)同源臂偶聯(lián)等位交換，可通過(guò)不同長(zhǎng)度同源臂精確控制單、雙交換發(fā)生的次序，從而實(shí)現(xiàn)高效、無(wú)痕基因敲除?；蚴青奏念^生物合成的必需基因?；诨蚩蓪?shí)現(xiàn)雙向篩選：1) 該基因缺失，會(huì)造成突變株無(wú)法從頭合成尿嘧啶，導(dǎo)致細(xì)菌死亡；2) 該基因存在，可將5-FU摻入DNA和RNA分子中，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。換言之，基因缺失突變株不能在尿嘧啶限制性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而含有基因的菌株不能在含有5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid，5-FOA，可轉(zhuǎn)化為5-FU)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。因此，基因可作為正向(含有生存) 和負(fù)向(含有基因死亡) 篩選標(biāo)記[57]。ACE方法對(duì)于不能直接轉(zhuǎn)化自殺質(zhì)粒、難于遺傳改造的菌株(如艱難梭菌、熱纖梭菌等)具有重要意義，可以極大地加速突變的篩選速度，且不會(huì)像ClosTron技術(shù)一樣在基因組中引入外源DNA片段，因此可減少極性效應(yīng)的產(chǎn)生和提高基因突變株染色體的穩(wěn)定性。

使用ACE方法構(gòu)建基因突變株的過(guò)程如圖7A所示，敲除載體包含、、、RepH復(fù)制蛋白，以及基因上游同源臂(LHA，約300 bp)、α片段和下游同源臂(RHA，約1 200 bp)。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化艱難梭菌后，在氯霉素培養(yǎng)基中篩選發(fā)生單交換的菌株(圖7A)。單交換菌株擴(kuò)增后再涂布在5-FOA平板上，發(fā)生單交換菌株因含有基因被淘汰(負(fù)篩選)。發(fā)生雙交換的菌株因基因缺失而對(duì)5-FOA具有抗性，即獲得Δ突變株。Δ突變株因?qū)?-FOA具有抗性且在尿嘧啶限制性培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，用作后續(xù)基因敲除的底盤(pán)細(xì)胞。

以Δ突變株作為底盤(pán)細(xì)胞，突變株構(gòu)建過(guò)程如圖7B所示。敲除載體包含300 bp上游同源臂、攜帶突變的基因和1 200 bp下游同源臂，另外還包含來(lái)源于產(chǎn)孢梭菌的基因(與630菌株基因僅有65%同源性，可降低同源重組概率，圖7B)。該載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入630后，首先在氯霉素培養(yǎng)基中篩選單交換菌株。由于未發(fā)生單交換的質(zhì)粒會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)負(fù)擔(dān)，因此在氯霉素平板上形成小菌落。相反，發(fā)生單交換的菌落，因?yàn)榭股鼗蛞呀?jīng)整合進(jìn)入基因組，營(yíng)養(yǎng)負(fù)擔(dān)小，形成較大菌落。挑取發(fā)生單交換的大菌落涂布于含有5-FOA的平板上，單交換菌株因攜帶外源基因，所以對(duì)5-FOA敏感，因此發(fā)生雙交換的ΔΔ菌株能夠生存下來(lái)。

在獲得目標(biāo)基因的突變株后，基因被自身的啟動(dòng)子或強(qiáng)啟動(dòng)子回補(bǔ)至艱難梭菌基因組中，以確保突變株的鑒定在尿嘧啶合成充分的情況下進(jìn)行(圖7)。利用ACE技術(shù)，作者在艱難梭菌菌株中成功敲除了、(Cysteine protease)、(Mannitol-1-phosphate) 基因[19]。Δ產(chǎn)芽孢能力比野生型菌株低104倍，Δ菌株對(duì)S-layer protein A (SlpA) 蛋白切割效率急劇降低，Δ喪失了甘露醇利用能力[19]。

7 CRISPR-Cas9系統(tǒng)(2017–2018年)

串聯(lián)規(guī)律間隔短回文序列(Cluster regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR) 和CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein，Cas) 組成的CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種RNA和Cas蛋白介導(dǎo)的細(xì)菌和古菌免疫系統(tǒng)[58]。最近幾年，來(lái)源于化膿性鏈球菌的CRISRPR-Cas9元件被廣泛應(yīng)用于原核生物和真核生物的精確基因編輯[58-72]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)有2個(gè)主要的組分：1) Cas9效應(yīng)蛋白；2) 用于指導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別靶位點(diǎn)的crRNA (CRISPRRNA)和tracrRNA (-activating crRNA)。Cas9效應(yīng)蛋白與crRNA、tracrRNA組成蛋白質(zhì)核酸復(fù)合體(RNP) 能夠特異性的識(shí)別PAM序列(Protospacer adjacent motif，PAM，5′-NGG-3′) 前的20 nt核苷酸，并在Cas9核酸內(nèi)切酶的作用下產(chǎn)生雙鏈DNA平末端缺口(Double-strand break，DSB)。為了簡(jiǎn)化CRISPR-Cas9系統(tǒng)，Mali等將crRNA和tracrRNA整合在一起，形成單一嵌合型導(dǎo)向RNA (Single chimeric guide RNA，sgRNA)，sgRNA同樣具有指導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別靶位點(diǎn)的功能[73]。在真核生物中，DSB缺口可以通過(guò)非同源性末端連接系統(tǒng)修復(fù)(Nonhomologous end-joining repair pathway，NHEJ)，并在修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生插入/刪除突變，從而導(dǎo)致基因編碼的蛋白質(zhì)讀碼框發(fā)生移碼突變，造成靶基因的失活。然而，在大多原核生物中，由于缺乏NHEJ酶系，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因組雙鏈中產(chǎn)生DSB后，微生物細(xì)胞不能自主修復(fù)，產(chǎn)生DNA復(fù)制缺陷，導(dǎo)致宿主細(xì)菌死亡。當(dāng)基因打靶質(zhì)粒提供DSB切割位點(diǎn)兩側(cè)同源臂時(shí)，斷裂基因組發(fā)生依賴(lài)同源重組的基因修復(fù)，(Homology-directed repair，HDR)，其結(jié)果為：1) 細(xì)菌得以存活；2) 依賴(lài)同源臂，引入DNA突變(插入、缺失、刪除等)[74]。

圖7 基于ACE的艱難梭菌精確、無(wú)痕基因編輯技術(shù)[19]

艱難梭菌中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)由McAllister等于2017年建立。該系統(tǒng)使用脫水四環(huán)素誘導(dǎo)啟動(dòng)子() 驅(qū)動(dòng)密碼子優(yōu)化的Cas9基因的表達(dá)，使用改造后的谷氨酸脫氫酶()啟動(dòng)子啟動(dòng)sgRNA表達(dá)，靶基因() 同源臂被放在結(jié)合轉(zhuǎn)移元件和啟動(dòng)子之間(圖8)。該系統(tǒng)對(duì)基因(Selenophosphate synthetase) 的敲除效率為20%–50%，Δ突變株生長(zhǎng)速度極度降低，缺失了將硒元素螯合進(jìn)入硒蛋白的能力[28]。CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用，克服了ClosTron基因失活時(shí)插入二型內(nèi)含子而產(chǎn)生的極性效應(yīng)(基因插入引起的上、下游基因表達(dá)變化) 和ACE方法需要先構(gòu)建ΔΔ底盤(pán)細(xì)胞，敲除靶基因后再回補(bǔ)基因的繁瑣過(guò)程，是目前艱難梭菌基因編輯工具中最簡(jiǎn)單、高效的方法。

圖8 CRISPR-Cas9技術(shù)敲除艱難梭菌Spo0A基因和敲入PpFbFpm基因[29]

2018年，本課題組(王邵花、洪偉等) 獨(dú)立構(gòu)建了一套CRISPR-Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)以乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子啟動(dòng)Cas9蛋白的表達(dá)，以小RNA啟動(dòng)子(sRNAP) 啟動(dòng)sgRNA的表達(dá)。使用該質(zhì)粒系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了630菌株的A基因的敲除(圖8A) 和厭氧綠色熒光蛋白基因的敲入(圖8B)，效率分別為：80%和100%[29]。表型分析結(jié)果表明，Δ突變株產(chǎn)生芽孢的能力急劇下降，基因插入突變株在熒光顯微鏡下可見(jiàn)明顯的綠色熒光信號(hào)[29]。

8 CRISPR-Cpf1系統(tǒng)(2018年)

與CRISPR-Cas9系統(tǒng)相似，CRISPR-Cpf1系統(tǒng)也是基于核酸內(nèi)切酶的細(xì)菌免疫系統(tǒng)。CRISPR-Cpf1系統(tǒng)來(lái)源于U112菌株[70]，與Cas9相比CRISPR-Cpf1具有以下獨(dú)特的特點(diǎn)：1) Cpf1核酸酶僅由單一crRNA導(dǎo)向，不需要tracrRNA參與；2) Cpf1核酸內(nèi)切酶識(shí)別富含T的PAM序列(5′-TTTN-3′)，更適合低GC含量微生物基因編輯(如艱難梭菌)；3) Cpf1在遠(yuǎn)離PAM序列端，將DNA雙鏈切割為粘性末端[65]。

我們研究組將CRISPR-Cpf1系統(tǒng)開(kāi)發(fā)成了高效艱難梭菌基因編輯“工具箱”[30]。該“工具箱”中的核心“工具”為CRISPR-Cpf1打靶質(zhì)粒(圖9)，其組成如下：基因在乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子()的啟動(dòng)下表達(dá)，基因下游緊跟一個(gè)終止子()；以小RNA啟動(dòng)子(Small RNA promoter，sRNAP) 啟動(dòng)基因的表達(dá)。根據(jù)CRISPR-Cpf1系統(tǒng)僅需crRNA無(wú)需tracrRNA的特點(diǎn)，我們提出了一步組裝法(One step assembly, OSA)。該方法將與靶基因上、下游同源臂同時(shí)組裝，從而將基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建周期縮短至原來(lái)的一半，僅用兩天時(shí)間就可以獲得基因打靶載體。除此之外，我們還為OSA方法開(kāi)發(fā)了靶位點(diǎn)尋找和突變引物設(shè)計(jì)軟件(OSAprimer finder，OPF)，可以在1分鐘內(nèi)設(shè)計(jì)好構(gòu)建打靶載體所需的引物。OSA方法與OPF工具結(jié)合，極大地提高了艱難梭菌的基因編輯效率[30]。

圖9 使用CRISPR-Cpf1技術(shù)實(shí)現(xiàn)在艱難梭菌基因編輯[30]

我們使用以上建立的CRISPR-Cpf1“工具箱”，針對(duì)630菌株()、()、()、、()、() 基因進(jìn)行了靶向基因敲除，基因敲除效率從25%–100%不等。并首次在630菌株中實(shí)現(xiàn)了使用同一載體同時(shí)編輯兩個(gè)基因(和)。另外，CRISPR-Cpf1技術(shù)還實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)達(dá)49 kb的基因座敲除，這是目前艱難梭菌中最長(zhǎng)的靶基因敲除成功案例。另外，基于該系統(tǒng)的打靶質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)連續(xù)傳代的方式丟失，因此能夠?qū)崿F(xiàn)抗性基因的回收，從而實(shí)現(xiàn)使用同一篩選標(biāo)記連續(xù)敲除不同基因(如和基因)。綜上所述，我們開(kāi)發(fā)的CRISPR-Cpf1“工具箱”可以極大加速艱難梭菌基因編輯進(jìn)程，為揭示艱難梭菌生理生化特征、致病機(jī)制和開(kāi)發(fā)對(duì)抗CDI的新療法提供技術(shù)支持[30]。

9 基因編輯系統(tǒng)展望

本文綜述了艱難梭菌基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程和最新進(jìn)展。2002–2004年之間，艱難梭菌限制性?xún)?nèi)切酶系統(tǒng)得以揭示、克隆了pCD6復(fù)制子、實(shí)現(xiàn)了外源質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移，這些方法的建立、元件的獲得，為艱難梭菌基因編輯技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。艱難梭菌基因編輯技術(shù)經(jīng)歷了反義RNA、隨機(jī)轉(zhuǎn)座子、ClosTron技術(shù)、ACE技術(shù)、CRISPR-Cas技術(shù)等不同階段[10-11,16,19,25,29,30]。實(shí)現(xiàn)了從隨機(jī)基因失活到靶向基因失活、從低效率基因失活到高效基因失活的技術(shù)進(jìn)步(表1)。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，艱難梭菌毒力基因在CDI發(fā)生過(guò)程中的作用[14]、孢子產(chǎn)生機(jī)制()[12]、腸壁黏附機(jī)制(，)[10,30,40,75]、抗生素抗性基因功能(，) 等得以闡明[30]。由此可見(jiàn)快速、高效、準(zhǔn)確的基因編輯技術(shù)，在艱難梭菌致病機(jī)制、生理、生化特征的研究過(guò)程中起到了核心作用，在未來(lái)可能進(jìn)一步影響CDI的防治措施和策略的制定，為更好地預(yù)防和控制CDI感染提供理論支持。

除了外源性CRISPR-Cas系統(tǒng)，艱難梭菌內(nèi)源性CRISPR-Cas也是研究的熱點(diǎn)。在217株艱難梭菌基因組中，內(nèi)源性IB型(type IB)CRISPR- Cas系統(tǒng)存在于保守的基因組位點(diǎn)[76]。深度轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)630菌株Ⅰ型CRISPR系統(tǒng)(typeⅠ) 具有高度的轉(zhuǎn)錄活性[77]。Boudry等的研究闡明了在630和R20291菌株中的ⅠB型CRISPR系統(tǒng)的作用機(jī)制，并在體外驗(yàn)證了該系統(tǒng)的活性[78]。630和R20291分別編碼12個(gè)和13個(gè)可能的CRISPR陣列，其中5個(gè)定位于原噬菌體 (Prophage) 區(qū)域。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下，630和R20291分別有12個(gè)和9個(gè)CRISPR陣列都處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。體外實(shí)驗(yàn)表明該系統(tǒng)在大腸桿菌中具有雙鏈DNA靶向切割活性。由此可見(jiàn)，艱難梭菌內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)具有改造成為基因編輯工具的潛力?！敖壖堋逼D難梭菌內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)用于其基因編輯，無(wú)需外源表達(dá)Cas9/Cpf1效應(yīng)蛋白，因此可極大地降低打靶載體的分子量，提高外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率，從而提高基因編輯的成功率。使用ⅠB型CRISPR系統(tǒng)完成基因編輯已有先例，如張杰等使用酪丁酸梭菌內(nèi)源性的CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建的基因編輯工具，編輯酪丁酸梭菌產(chǎn)溶劑代謝通路，獲得了目前為止最高的丙酮-丁醇-乙醇產(chǎn)量[79]。由此可見(jiàn)，在艱難梭菌中建立內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)也很有可能進(jìn)一步提高艱難梭菌基因編輯效率。

表1 艱難梭菌中不同基因編輯方法比較

CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因組中產(chǎn)生的DSB有兩種修復(fù)方式，一種是HDR，一種是NHEJ。在大多數(shù)原核生物中，沒(méi)有NHEJ修復(fù)方式。Yang 等在恥垢分枝桿菌中測(cè)試了14種Cas效應(yīng)蛋白，發(fā)現(xiàn)CRISPR-FnCpf1_cg系統(tǒng)能夠在該菌株中實(shí)現(xiàn)NHEJ型的基因編輯[80]。NHEJ型DSB修復(fù)具有修復(fù)速度快、載體構(gòu)建簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)(無(wú)需同源臂)。但是NHEJ的實(shí)現(xiàn)需要宿主中具備N(xiāo)HEJ支持酶系統(tǒng)。遺憾的是，艱難梭菌并不具備N(xiāo)HEJ酶系。在艱難梭菌中外源表達(dá)NHEJ支持酶系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)NHEJ型DBS修復(fù)，可能進(jìn)一步提高其基因編輯的效率。

CRISPR-Cas系統(tǒng)在艱難梭菌中的成功建立，極大地加快了艱難梭菌基因編輯效率。該系統(tǒng)具有高效、無(wú)痕、操作簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)，也賦予了基因編輯超高的靈活性。王義等使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在拜氏梭菌中實(shí)現(xiàn)了單堿基編輯[71]，在基因組編輯的精度上有了較大提升，對(duì)于精確改變核心基因的功能具有重要意義。目前，單堿基編輯在艱難梭菌中尚未見(jiàn)報(bào)道，可能是未來(lái)研究的重要方向。

目前艱難梭菌基因編輯方法的研究還有以下不足：1) 艱難梭菌轉(zhuǎn)化效率較低。實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化是基因編輯的最重要的前提條件，然而目前艱難梭菌僅適用于轉(zhuǎn)化效率較低的轉(zhuǎn)化方法。因此，進(jìn)一步提高艱難梭菌外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率，可以提升其基因編輯效率，如開(kāi)發(fā)高效的電轉(zhuǎn)化方法等。2) CRISPR-Cas系統(tǒng)在艱難梭菌中是否存在脫靶現(xiàn)象尚未闡明。有報(bào)道稱(chēng)，Cas9蛋白在微生物中具有毒性[74]，毒性的產(chǎn)生可能與Cas9異常脫靶有關(guān)。在未來(lái)的研究中，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析打靶嚴(yán)謹(jǐn)位點(diǎn)的特征，從而設(shè)計(jì)出更加精確的“基因剪刀”是CRISPR-Cas系統(tǒng)需要解決的技術(shù)難題之一。目前，針對(duì)艱難梭菌中的CRISPR-Cas9脫靶的問(wèn)題還沒(méi)有深入研究。因此，借鑒其他物種中解決CRISPR系統(tǒng)脫靶問(wèn)題的方法，進(jìn)一步完善和改進(jìn)該系統(tǒng)是未來(lái)重要的研究方向。3) 艱難梭菌高通量基因編輯方法尚待開(kāi)發(fā)。目前在艱難梭菌中的基因編輯技術(shù)主要針對(duì)單基因和最多兩個(gè)基因的編輯[74]。有報(bào)道稱(chēng)，使用轉(zhuǎn)座子攜帶的dCas9系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)在多個(gè)物種中、調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)[81]。這種高通量基因編輯方式，對(duì)于研究病原微生物對(duì)抗生素的耐藥性及治療“超級(jí)”細(xì)菌的感染患者提供了新的思路?？赡茉诓痪玫膶?lái)，面對(duì)耐藥艱難梭菌，也許我們可以首先通過(guò)該方法，改變其對(duì)抗生素的敏感性，從而使用現(xiàn)有的抗生素有效地根除CDI。

綜上所述，艱難梭菌的基因編輯系統(tǒng)在過(guò)去的20年間取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。這些進(jìn)步推動(dòng)了艱難梭菌生理、生化特征、致病機(jī)制、治療及防控的研究。隨著以上機(jī)制的闡明，相信在不久的將來(lái)，臨床醫(yī)生可以更好地預(yù)防和治療CDI。

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Advances ingenome editing

Wei Hong1,2, Wen Wan3, Guzhen Cui4, Zhizhong Guan1,2, Xiaolan Qi1,2, and Wenfeng Yu1,2

1 Key Laboratory of Endemic and Ethnic Diseases,Ministry of Education, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China 2 Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Guizhou Province, Guiyang 550004, Guizhou, China 3 Department of Pathology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China 4 Department of Microbiology,School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China

is a Gram-positive, spore-forming, obligate anaerobic bacterium, and the main cause of hospital-associated diarrhea. In recent years, with the presence of virulent strains (i.e., ribosome type 027), the prevalence and mortality events have increased. Thus, studies on physiological and biochemical characteristics, and pathogenic mechanisms ofhave been performed. The development of efficient and stable genome-editing methods foris urgent for the dissection of its physiological and pathogenic mechanism. For example, ClosTron technology plays a key role in study of the relationship betweentoxins (Toxin A and Toxin B) and its pathogenicity. This article reviews the history, recent progress and future prospects ofgenome-editing technologies.

,infection (CDI), genome editing,gene function research, pathogenic mechanism

洪偉, 萬(wàn)雯, 崔古貞, 等. 艱難梭菌基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(2): 210–225.

Hong W, Wan W, Cui GZ, et al. Advances ingenome editing. Chin J Biotech, 2020, 36(2): 210–225.

May 2, 2019;

July 10, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31560318, 31601012, 31760318, U1812403), Guizhou Science and Technology Project (Qiankehepintairencai No. [2017]5652).

Wei Hong. Tel: +86-851-86752814; E-mail: hongwei@gmc.edu.cn

10.13345/j.cjb.190171

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31560318，31601012，31760318，U1812403)，貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目黔科合平臺(tái)人才 (No. [2017]5652) 資助。

2019-10-30

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191030.0939.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)