馬 濤 ，張李躬 ，何志燦 ，俞穗珍 ，肖新速 ，王興進(jìn)

（1.古田縣食用菌研發(fā)中心，福建 古田 352200；2.福建省食用菌產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建 古田 352200；3.寧德市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建 寧德 352100）

銀耳（Tremella fuciformis） 又稱(chēng)白木耳，是我國(guó)傳統(tǒng)的食（藥）用菌，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素以及礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分，被認(rèn)為是“滋補(bǔ)的珍品，餐桌上的美食”，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-4]。福建省古田縣被譽(yù)為“中國(guó)食用菌之都”，其銀耳年產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的90%以上[5]。新鮮銀耳泡發(fā)時(shí)間短、燉煮時(shí)間短，口感嫩滑、糯性十足，綠色健康無(wú)污染。伴隨著物聯(lián)網(wǎng)的飛速發(fā)展以及人民生活水平的提高，新鮮銀耳越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞，然而其保質(zhì)時(shí)間短，若儲(chǔ)存不當(dāng)，一段時(shí)間后會(huì)腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生米酵菌酸。米酵菌酸是由椰毒假單胞菌（Pseudomonas cocovenenans） 產(chǎn)生的一種毒素，其耐熱性強(qiáng)，對(duì)人體細(xì)胞具有強(qiáng)烈的毒性作用[6-10]。若保存得當(dāng)，新鮮銀耳中的米酵菌酸含量可以得到有效控制。國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道了高效液相色譜法[11-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]測(cè)定銀耳中米酵菌酸，所采用樣品為干銀耳，對(duì)于新鮮銀耳的研究未有相關(guān)報(bào)道。通過(guò)研究不同儲(chǔ)存方式條件下新鮮銀耳的保存周期，為消費(fèi)者提供保存新鮮銀耳的科學(xué)依據(jù)，為古田縣食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供科學(xué)的指導(dǎo)性意見(jiàn)，促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 原料與設(shè)備

新鮮銀耳，古田縣晟農(nóng)農(nóng)業(yè)專(zhuān)業(yè)合作社；米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度 96.94%），美國(guó)Sigma公司；Milli-Q制備的純凈水；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇、冰乙酸、甲酸、氨水均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Waters XEVO TQD高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Waters公司；KQ-300超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；R-201B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物科技有限公司；SH2-C循環(huán)水式真空泵，河南太康科教廠；HSC-12A氮吹儀，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；P-SAX固相萃取柱，月旭科技（上海）股份有限公司；0.22 μm疏水性PTFE針式濾器，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品儲(chǔ)存

取帶菌棒與不帶菌棒的新鮮銀耳樣品，分別于真空和常壓條件下保存；2種壓強(qiáng)條件下分別設(shè)溫度梯度為35℃、25℃、15℃、4℃、-20℃。每2天分別采集不同儲(chǔ)存方式下的樣品1次，連續(xù)采集20次。

1.2.2 色譜柱條件

Waters BEH C18色譜柱（2.18 nm×100 nm×1.7 μm），柱溫 30℃，進(jìn)樣量 1.0 μL，流速 0.2 mL·min-1。流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相D：0.01 mol·mL-1乙酸銨。

1.2.3 離子源

電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為負(fù)離子模式；脫溶劑氣溫度400℃；脫溶劑氣流速900 L·min-1；監(jiān)測(cè)離子對(duì)為485.3/441.1、485.3/397.2，定量離子對(duì)為485.3/441.1。

1.2.4 樣品處理

稱(chēng)取新鮮銀耳約10.0 g于100 mL錐形瓶中，倒入甲醇氨水提取液100 mL；錐形瓶搖晃數(shù)下后放置于陰暗處1 h；將靜置提取1 h后的錐形瓶放入超聲波清洗器超聲30 min；過(guò)濾提取液；取濾液50 mL倒入100 mL梨形瓶中，置于80℃水浴中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至濾液濃縮至3 mL左右；依次用甲醇5 mL和水5 mL活化固相萃取柱，保持柱體濕潤(rùn)；濃縮液過(guò)固相萃取柱，待濃縮液過(guò)完柱后，再依次用水5 mL和甲醇5 mL淋洗，棄去淋洗液；用甲酸甲醇7 mL洗脫，收集洗脫液；將洗脫液氮吹近干，定容，過(guò)膜，上機(jī)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與目標(biāo)離子對(duì)

分別用濃度 0、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1、200.0 μg·L-1的米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。相關(guān)系數(shù)為0.998 022，加標(biāo)回收率為88.4%，監(jiān)測(cè)離子對(duì)為485.3/441.1、485.3/397.2，定量離子對(duì)為485.3/441.1，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖見(jiàn)圖1。

2.2 不同貯藏溫度對(duì)米酵菌酸的影響

35℃時(shí)，部分新鮮銀耳3 d開(kāi)始出現(xiàn)綠霉并逐漸開(kāi)始出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，但未檢出米酵菌酸。在5 d時(shí)，4種保存條件下的新鮮銀耳均開(kāi)始出現(xiàn)米酵菌酸，這是因?yàn)槎嗵鞘酋r銀耳的重要成分，在貯藏過(guò)程中為椰毒假單胞菌繁殖提供營(yíng)養(yǎng)，引起新鮮銀耳的變質(zhì)和腐敗[17]。

25℃時(shí)，部分新鮮銀耳7 d開(kāi)始出現(xiàn)綠霉并逐漸開(kāi)始出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，但未檢出米酵菌酸；在9 d時(shí)，4種保存條件下的新鮮銀耳均開(kāi)始出現(xiàn)米酵菌酸。由此推測(cè)，22℃～25℃最有利于新鮮銀耳的生長(zhǎng)，且菌棒仍可給予新鮮銀耳的繼續(xù)存放提供一定的營(yíng)養(yǎng)成分，從而延長(zhǎng)了儲(chǔ)存時(shí)間。

15℃時(shí)，4種保存條件下的新鮮銀耳到13 d時(shí)均開(kāi)始出現(xiàn)米酵菌酸，且部分新鮮銀耳開(kāi)始出現(xiàn)綠霉并開(kāi)始出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。這說(shuō)明，15℃條件下銀耳表面的微生物仍能緩慢生長(zhǎng)。

4℃時(shí)，4種保存條件下的新鮮銀耳在27 d均開(kāi)始出現(xiàn)米酵菌酸，且部分新鮮銀耳開(kāi)始出現(xiàn)綠霉并開(kāi)始出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。說(shuō)明4℃冷藏抑制了新鮮銀耳的呼吸作用和酶活力，延緩營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解[18]，使得新鮮銀耳在貯藏過(guò)程中的新陳代謝活動(dòng)維持在較低水平，同時(shí)抑制其他微生物的侵染，延緩變質(zhì)，延長(zhǎng)保質(zhì)期。

-20℃時(shí)，4種保存條件下的新鮮銀耳始終沒(méi)有米酵菌酸的檢出。這是因?yàn)殂y耳鮮品本身含水量大，在-20℃超低溫貯藏處于冷凍狀態(tài)，極大限度地降低其新陳代謝并有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)，可顯著提高新鮮食用菌的貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)貯藏期限[19]。因此，溫度對(duì)新鮮銀耳的儲(chǔ)存影響很大，新鮮銀耳保存溫度越高，越不利于新鮮銀耳的保存。

2.3 35℃和25℃下不同狀態(tài)新鮮銀耳米酵菌酸含量變化

35℃和25℃下不同狀態(tài)新鮮銀耳米酵菌酸含量見(jiàn)表1。

表1 35℃和25℃下不同狀態(tài)新鮮銀耳米酵菌酸含量Tab.1 The bongkrekic acid content of different status of fresh Tremella fuciformis under 35℃ and 25℃

由表1可知，35℃時(shí)，新鮮銀耳常壓未帶菌棒米酵菌酸的含量在5 d達(dá)到最高值25.30 μg·kg-1，新鮮銀耳常壓帶菌棒9 d達(dá)到最大值13.00 μg·kg-1，新鮮銀耳真空未帶菌棒米酵菌酸的含量在15 d達(dá)到最大值7.70 μg·kg-1，新鮮銀耳真空帶菌棒15 d達(dá)到最大值16.35 μg·kg-1。25℃時(shí)，新鮮銀耳常壓未帶菌棒米酵菌酸含量在9 d達(dá)到最大值4.80 μg·kg-1，新鮮銀耳常壓帶菌棒11 d達(dá)到最大值6.65 μg·kg-1，新鮮銀耳真空未帶菌棒米酵菌酸含量在15 d時(shí)達(dá)到最大值6.10 μg·kg-1，新鮮銀耳真空帶菌棒27 d達(dá)到最大值 6.85 μg·kg-1。15℃和 4℃下不同狀態(tài)新鮮銀耳米酵菌酸含量見(jiàn)表2。

如表2所示，15℃時(shí)新鮮銀耳常壓未帶菌棒米酵菌酸的含量在第25天時(shí)達(dá)到最大值為6.55 μg·kg-1，新鮮銀耳常壓帶菌棒在第21天達(dá)到最大值，為12.80 μg·kg-1，新鮮銀耳真空未帶菌棒米酵菌酸的含量在第21天時(shí)達(dá)到最大值為5.00 μg·kg-1，新鮮銀耳真空帶菌棒第23天達(dá)到最大值為7.75 μg·kg-1。4℃時(shí)新鮮銀耳常壓未帶菌棒米酵菌酸的含量在第35天時(shí)達(dá)到最大值為5.45 μg·kg-1，新鮮銀耳常壓帶菌棒第35天達(dá)到最大值為6.75 μg·kg-1，新鮮銀耳真空未帶菌棒米酵菌酸的含量在第35天時(shí)達(dá)到最大值為3.50 μg·kg-1，新鮮銀耳真空帶菌棒在第23天達(dá)到最大值，為7.25 μg·kg-1。以上各溫度下不同儲(chǔ)存狀態(tài)的新鮮銀耳雖然有米酵菌酸檢出，但均遠(yuǎn)低于GB 7096食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食用菌及其制品中限量（0.25 mg·kg-1）要求。

同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)帶菌棒條件下保存的新鮮銀耳比不帶菌棒保存的新鮮銀耳時(shí)間久，這是因?yàn)閹Ь粜迈r銀耳菌袋料仍可給銀耳的保存提供一定的營(yíng)養(yǎng)成分。真空包裝更有利于新鮮銀耳的儲(chǔ)存，這是因?yàn)闊o(wú)氧環(huán)境件能夠抑制新鮮銀耳的呼吸作用和酶活力，減緩營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)真空條件和常壓條件下不同儲(chǔ)存溫度時(shí)新鮮銀耳產(chǎn)生的米酵菌酸進(jìn)行檢測(cè)分析，剖析了不同儲(chǔ)存方式米酵菌酸的產(chǎn)生時(shí)間以及濃度變化情況。結(jié)果表明，溫度對(duì)新鮮銀耳的儲(chǔ)存影響很大，新鮮銀耳貯藏溫度越高，椰毒假單胞菌活性越大，銀耳越容易腐爛，越不利于新鮮銀耳的保存；真空包裝和帶菌棒等處理方式可以有效降低銀耳中米酵菌酸的含量，延長(zhǎng)保質(zhì)期。

綜上，建議商家在寄送新鮮銀耳時(shí)應(yīng)盡可能使用冷鏈物流運(yùn)輸帶菌棒和真空包裝的新鮮銀耳，并縮短運(yùn)輸時(shí)間。同時(shí)廣大消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)帶菌棒新鮮銀耳后應(yīng)盡早食用，并于4℃或冷凍保存，使得鮮銀耳在貯藏過(guò)程中的新陳代謝活動(dòng)維持在最低的水平上，延緩變質(zhì)、延長(zhǎng)保質(zhì)期。