王雙慧，葛麗蓉，陳佳明，丁皇宇，陳忠法，王 偉

（浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江省生物工程一流學科實驗室，浙江寧波 315100）

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的集約化和科技化發(fā)展，人工授精技術在現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中受到越來越多的關注。人工授精技術的應用可以有效降低生產(chǎn)成本，并加快優(yōu)良基因推廣。目前豬精液普遍在15～20℃進行液態(tài)保存[1]，最常用的保存溫度為16.5～17℃，低于此溫度會嚴重影響豬精子的存活率[2]。豬精子對低溫的應激非常敏感[3]，但溫度太高又會導致精液的保存時間縮短。因此，研制出適合豬精子低溫保存的稀釋液，是解決豬精液液態(tài)保存的關鍵[4]。

人工冬眠可降低機體對各種病理刺激的反應[5-6]。鑒于豬精子對環(huán)境溫度的高敏感性，本實驗擬以冬眠合劑（主要成分為氯丙嗪和異丙嗪）為基礎，配制豬精液的常溫和低溫稀釋液，以誘導細胞休眠的方式來延長豬精液的保存時間，為豬精液保存提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 豬精液從浙江愛卡畜牧有限公司購買，采精后經(jīng)過預稀釋，并于2 h 內(nèi)送到實驗室。以存活率＞90% 的精液為合格，精液保存的密度范圍在1.2×108～1.5×108。本實驗中精液的稀釋、分裝和保存過程均為無菌操作。

本實驗用到的化學試劑均為國產(chǎn)AR 級別，無菌耗材購買自BBI 公司。配制冬眠合劑用的氯丙嗪和異丙嗪購買自TCI 公司，青霉素/鏈霉素雙抗購買自碧云天生物技術研究所，吉姆薩染液購買自Solarbio 公司，用到的顯微成像系統(tǒng)為Leica DM2500 系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 冬眠合劑對常規(guī)保存溫度下精液保存的影響 冬眠合劑的配方：準確稱取氯丙嗪0.1 g 和異丙嗪0.1 g，在50 mL PBS 中混合均勻后，用0.22 μm 濾器除菌待用。Modena 常溫稀釋液的配方為（1 L）[7-8]：葡萄糖27.5 g、檸檬酸鈉1.0 g、EDTA-Na22.35 g、碳酸氫鈉1.0 g、Tris 5.65 g、檸檬酸2.9 g。用0.22 μm 的濾器進行過濾除菌，冷凍保存，使用時4℃解凍后再添加雙抗。在15℃條件下，Modena 常溫稀釋液中按0、1/10、1/20、1/40、1/80 和1/160 添加冬眠合劑，通過測定精子活率篩選出冬眠合劑的最佳添加濃度。然后在17、14、12、10℃下，研究冬眠合劑對豬精液保存的影響。對照為添加PBS 溶液的Modena 常溫稀釋液。在處理后的1、3、5、7 d，實驗結束時進行精子涂片，吉姆薩染色觀察精子的形態(tài)學變化，采用組織學方法對精子的頂體、頭部及頸部的形態(tài)學進行分析。精子活率的測定參考陳軍的方法[9]進行。

1.2.2 冬眠合劑對低溫條件下精液保存的影響 低溫保存稀釋液的配方（1 L）[7-8]：葡萄糖30.0 g、蔗糖40.0 g、青霉素0.6 g、離心后備用的卵黃20 mL。先用棉花蘸取無水乙醇將整個雞蛋外殼進行全面消毒，然后用鑷子柄部輕輕敲打雞蛋稍尖一頭，用鑷子將雞蛋殼小心取出，僅露一個小洞，將雞蛋翻轉，讓蛋清自然流出，流出大部分后繼續(xù)去除蛋殼，將剩余的蛋黃和少量蛋清倒于事先準備好的濾紙上，輕輕搖晃濾紙，讓卵黃和蛋清分離，最后用一次性注射器（去除針頭）插入整個完整的卵黃中吸取卵黃，不要吸取卵黃膜。將卵黃與水按比例配制成20% 的卵黃液，離心取上清液備用。以低溫保存稀釋液為基礎，在10、8、6、4℃條件下，研究冬眠合劑對豬精液保存的影響。冬眠合劑配方和添加比例同1.2.1。

1.3 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差來表示，且所有實驗均重復3 次。實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行處理，經(jīng)單因素方差分析（ANOVA），差異顯著性檢驗采用Turkey 檢驗法進行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果

2.1 常溫稀釋液中添加冬眠合劑對精子活率的影響 如圖1 所示，在常溫稀釋液中添加冬眠合劑，在15℃條件下保存7 d，1/40 的添加比例效果最好，而1/10 的添加比例效果最差。精液在保存5 d 后，活率迅速降低，在保存7 d 后對照組活率為零。因此，選擇冬眠合劑的添加量為1/40，保存時間為7 d。

如圖2 所示，在17、14、12、10℃ 4 個溫度條件下分別添加冬眠合劑，17℃效果最好，添加冬眠合劑3 d后精子活率顯著高于對照組，且保存7 d 后精子活率還有40%以上。而12℃和10℃保存條件下，冬眠合劑組和對照組保存效果差異均不顯著。

2.2 低溫稀釋液中添加冬眠合劑對精子活率的影響 如圖3 所示，在低溫稀釋液中添加冬眠合劑，在8℃條件下保存7 d，1/40 的添加比例效果最好，而1/10 的添加比例效果最差。從第3 天開始1/10 組保存的精子活率為0，第7 天時1/20 組的精子活率為0。因此，選擇冬眠合劑的添加量為1/40。

如圖4 所示，在10、8、6、4℃ 4 個溫度條件下分別添加冬眠合劑，8℃效果最好，保存9 d 后，精子活率高于60%；保存14 d 后，精子活率仍高于25%。添加冬眠合劑7 d 后，10、8、6℃精子活率顯著高于對照組。而4℃保存條件下，對照組在5 d 時精子活率為0。

2.3 稀釋液中添加冬眠合劑對豬精子形態(tài)學的影響 本實驗保存后的精子完整性很好，頭部形狀規(guī)則、染色均勻。進一步研究精子的狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)保存溫度（17℃）條件下保存7 d 后，PBS 對照組精子常趨向于聚集狀態(tài)（圖5-A），且稀釋液中的細胞碎片很多；冬眠合劑實驗組精子也趨向于聚集的狀態(tài)，但是稀釋液中的細胞碎片并不明顯（圖5-B）。而低溫條件下（8℃）保存14 d 后，PBS 對照組和冬眠合劑組的精子均呈均勻分布，且稀釋液中的細胞碎片很少（圖5-C，5-D）。

3 討 論

本實驗通過在豬精液稀釋液中添加冬眠合劑（氯丙嗪和異丙嗪）顯著提高了保存精子活率，并顯著延長了精液的保存時間；經(jīng)過篩選，常溫保存條件下17℃為最佳保存溫度，冬眠合劑添加比為1/40；低溫保存條件下8℃為最佳保存溫度，冬眠合劑添加比為1/40；其中效果最好的是8℃低溫稀釋液，添加冬眠合劑保存9 d后，精子活率可以達到60%。此外，本實驗通過形態(tài)學分析發(fā)現(xiàn)，添加冬眠合劑可以明顯降低稀釋液中的精子碎片，有利于保持精子形態(tài)學的完整性。經(jīng)比較，常溫17℃下保存的稀釋液中添加冬眠合劑對豬精液保存時間效果優(yōu)于稀釋液中添加維生素類對豬精子保存的結果[10]，其效果也優(yōu)于曲酸[11]和原花青素[12]對豬精液保存時間的影響結果；而低溫稀釋液中添加冬眠合劑對延長豬精液保存時間效果高于茶多酚[13]和大豆卵磷脂[14]對豬精液低溫保存的影響，以及稀釋劑中添加蔗糖和乳糖的結果[15]。

抗氧化劑能有效促進豬精液的體外保存效果[16]。本實驗用到的冬眠合劑成分為氯丙嗪和異丙嗪，皆屬于吩噻嗪類藥物。由于吩噻嗪母核極易被氧化，表現(xiàn)出很強的細胞抗氧化能力[17]。因此氯丙嗪和異丙嗪可以降低精子的過氧化損傷，從而增加精子保存的時間和存活率。已有研究表明，氯丙嗪和異丙嗪通過改變葡萄糖代謝[18]和抑制葡萄糖攝取[19]來抑制神經(jīng)細胞被氧化。推測在豬精液保存過程中，氯丙嗪和異丙嗪也發(fā)揮了類似的作用。

鈣離子在精子運動中起著重要作用，精子的運動在某些特征上類似于平滑肌。氯丙嗪是鈣調(diào)蛋白抑制劑，可降低精子對鈣離子的反應，從而抑制精子的運動[20]。當豬精子處于一種“冷休克”狀態(tài)時，可有效緩解精子對能量的消耗[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸和氯丙嗪混合使用可改善雜交公牛解凍后精液質(zhì)量[21]。此外，吩噻嗪類藥物還具有抑制細胞凋亡[22]和抗菌的效果[23]，因此表現(xiàn)出更有利于精子保存的效果。

綜上所述，冬眠合劑（氯丙嗪和異丙嗪）的添加有助于提高精子的抗氧化能力和抑制精子的運動，從而延長豬精液的低溫和常溫的保存時間?？梢源藶榛A，開發(fā)出新型的豬精液稀釋液。