孫章華，霍曉舟，陳美鳳

(1 山東省菏澤生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，山東 菏澤 274000；2 菏澤學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，山東 菏澤 274015)

鹽酸多柔比星(Doxorubicin hydrochloride，DOX)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖(1)所示。它是蒽醌類抗生素，由于其具有良好的抗氧化作用，有很好的抗腫瘤作用[1-2]。DOX藥物常被用于誘導(dǎo)多種惡性腫瘤的緩解，包括急性白血病，骨肉瘤，手-足綜合征，尤其用于乳腺癌和肺癌[3-5]。但是過多劑量，會(huì)使不可逆性充血性心力衰竭的危險(xiǎn)性大大增加[6-7]。因此，對(duì)DOX的高靈敏分析對(duì)藥物控制有十分重要的意義。

目前，檢測(cè)DOX的分析方法主要有電泳分析法[8-10]、液相色譜法[11-13]與熒光法[14-15。但是這些方法有的步驟繁瑣，有的耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑或者檢測(cè)成本高，需要專門的技術(shù)人才。由于DOX具有電化學(xué)活性，近幾年來，電化學(xué)方法中的化學(xué)修飾電極應(yīng)用到了的DOX的檢測(cè)中[16-19]?；瘜W(xué)修飾電極對(duì)電化學(xué)活性物質(zhì)的檢測(cè)方法具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、選擇性好、預(yù)處理程序簡(jiǎn)單、樣品分析所需時(shí)間短、成本低和便于在線檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。電化學(xué)方法可以模擬DOX在體內(nèi)通過電子轉(zhuǎn)移來清除氧自由基的過程，即類似于在電極上發(fā)生了氧化還原反應(yīng)，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

三聚氰胺具有良好的電催化特性和較大的比表面積，是一種良好的電極修飾材料，在電化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣泛，已有文獻(xiàn)報(bào)道將其用于玻碳電極的電化學(xué)修飾[20-21]，但通過電聚合的方法將其修飾在GCE的表面，制備成具有導(dǎo)電性能好的PMel/GCE電極，并應(yīng)用于研究DOX的電化學(xué)行為，還未見報(bào)道。這種方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、線性范圍寬和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于DOX注射劑的檢測(cè)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；三電極體系：飽和 Ag/AgCl電極(SCE)作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，GCE或PMel/GCE為工作電極；KQ-100型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；78HW-1數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，金壇市江南儀器廠；SYZ-550二次水來自于石英亞沸高純水蒸餾器,金壇市江南儀器廠。

DOX，阿拉丁試劑有限公司；注射用DOX藥劑購(gòu)買于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院；不同pH的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)由Na2HPO4(西隴化工股份有限公司)和檸檬酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)配制。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)中的用水均為二次蒸餾水。

1.2 PMel/GCE的制備

將GCE在麂皮上用濕潤(rùn)的氧化鋁粉末拋光，依次在硝酸、乙醇和水中超聲清洗30 s/次，然后用二次蒸餾水沖洗干凈，晾干。將電極置于含有0.1 mol·L-1KCl的5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)]6溶液中進(jìn)行循環(huán)掃描，當(dāng)峰電流達(dá)到基本穩(wěn)定，電流差小于80 mV時(shí)，即完成了電極的清洗和活化，取出電極清洗吹干。然后將電極置于含2.0 mol·L-1的Mel溶液(pH=8.0)PBS中，用循環(huán)伏安法(CV)以20 mV·s-1的掃速在-1.2～2.0 V電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描14段，取出電極清洗待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

測(cè)試中，加入一定量pH=4.0 PBS中 、DOX標(biāo)準(zhǔn)溶液，攪拌180 s，在-1.0～0.6 V電位范圍內(nèi)，以100 mV·s-1掃描速率進(jìn)行循環(huán)掃描，然后記錄峰電位和峰電流。在每次掃描結(jié)束后，首先將電極置于pH=4.0的PBS循環(huán)掃描至峰電流消失，然后用二次蒸餾水沖洗，濾紙吸干后，即可進(jìn)行下一次測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 DOX的電化學(xué)行為和電極反應(yīng)過程

圖1為PMel/GCE測(cè)定空白溶液(a)、裸電極(b)和PMel/GCE(c)在相同實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定DOX溶液的循環(huán)伏安曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DOX在裸電極上的氧化峰、還原峰電流較小，ipa=-13.92 μA，Epa=- 0.37 V，ipc=16.44 μA，Epc=-0.53 V，而在三聚氰胺修飾電極上的氧化峰、還原峰電流增大較為明顯，分別為：ipa=-46.51 μA，Epa=-0.29 V，ip=44.15 μA，Epc=-0.46 V。在優(yōu)化條件下，DOX在PMel/GCE上氧化峰電流、還原峰電流分別是在裸電極上的3.34倍、2.69倍，由此可見，電極上修飾了Mel膜，一定程度上提高了測(cè)定DOX的靈敏度。說明Mel膜對(duì)DOX電化學(xué)氧化還原具有一定的催化作用，使DOX在PMel/GCE的電子傳遞速率加快。因?yàn)閕pa/ipc=1.05≈1，ΔE=0.17 V，所以DOX在PMel/GCE的該反應(yīng)為可逆反應(yīng)。

圖1 PMel/GCE測(cè)定空白溶液(a)、裸電極測(cè)定DOX溶液(b)、PMel/GCE測(cè)定DOX溶液(c)的循環(huán)伏安曲線(c=2.00×10-5 mol·L-1，pH=5.0，v=100 mV·s-1)Fig.1 Cyclic voltammograms (CVs) of PMel/GCE in PBS (a)， DOX at bare GCE (b) and PMel/GCE (c)

2.2 最佳電化學(xué)聚合條件的討論

2.2.1 修飾底液pH的影響

為了探究該實(shí)驗(yàn)條件下修飾底液pH對(duì)電極反應(yīng)催化性能的影響，在-1.2～2.0 V范圍內(nèi)，以60 mV·s-1掃描速率聚合14段，DOX在pH=8.0的修飾液中得到的電極上的氧化峰電流達(dá)到最大值。故本實(shí)驗(yàn)選pH=8.0的PBS為修飾底液。

2.2.2 聚合段數(shù)的選擇

掃描段數(shù)影響聚合物膜修飾電極的厚度。固定高電位為2.0 V，低電位為-1.2 V，掃描速率為100 mV·s-1，聚合底液濃度為2.0 mol·L-1的三Mel溶液中，只改變掃描段數(shù)進(jìn)行修飾電極，然后分別測(cè)定濃度為2.00×10-5mol·L-1的DOX，比較氧化峰的電流值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)聚合段數(shù)為14段時(shí)，DOX在修飾電極上的響應(yīng)最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇聚合段數(shù)為14段。

2.2.3 聚合掃速的選擇

掃描速率對(duì)電極的性能也有影響。固定高電位為2.0 V，低電位為-1.2 V，聚合底液為2.0 mol·L-1的Mel溶液，聚合掃描段數(shù)為14段，只改變掃描速率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：掃描速率為20 mV·s-1時(shí)，DOX在修飾電極上的響應(yīng)電流達(dá)到最大值，故本實(shí)驗(yàn)選用的掃描速率為20 mV·s-1。

聚合高、低電位的選擇 Mel修飾聚合的電位對(duì)電極的性能產(chǎn)生一定影響。其它聚合條件不變，改變聚合高、低電位分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：高電位為2.0 V，低電位為-1.2 V，此時(shí)DOX在修飾電極上的響應(yīng)電流達(dá)到最大。

綜上所述，2.0 mol·L-1的Mel溶液在pH=8.0的聚合底液，電位為-1.2～2.0 V，聚合段數(shù)為14段，掃描速率為20 mV·s-1條件下聚合，得到的修飾電極對(duì)DOX催化性能最好。

2.3 聚合循環(huán)伏安曲線

圖2為Mel在最佳聚合條件下的循環(huán)伏安圖。由圖2可知，隨掃描段數(shù)的增加，峰電流增加，但增加幅度逐漸減小，最后趨于穩(wěn)定，表明Mel在電極表面發(fā)生了聚合反應(yīng)。

圖2 Mel聚合過程中的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammogram (CV) of the Mel polymerization

2.4 測(cè)定DOX的最佳實(shí)驗(yàn)條件

2.4.1 測(cè)定底液pH的影響

測(cè)定底液pH對(duì)電極性能有較大的影響，固定測(cè)定高電位為1.0 V，低電位為-1.0 V，掃描速率為100 mV·s-1，DOX的濃度為2.00×10-5mol·L-1，只改變測(cè)定底液的pH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖3)。結(jié)果表明：在pH 2.2～8.0的范圍內(nèi)，當(dāng)pH=4.0時(shí)，DOX在PMel/GCE電極上的氧化峰電流達(dá)到最大值。故本實(shí)驗(yàn)選pH=4.0的PBS為測(cè)定底液。除此之外，實(shí)驗(yàn)還表明，DOX氧化峰電位與pH值有良好的線性關(guān)系，隨著pH值的升高，氧化峰向著負(fù)方向移動(dòng)，在pH 2.2～8.0之間，當(dāng)pH值增加時(shí)，氧化峰電位(Epa)呈線性下降，其線性回歸方程為Epa=0.0014-0.068pH，相關(guān)系數(shù)R=0.9983(見圖3插圖)，其線性方程的斜率的絕對(duì)值為0.068 V，接近能斯特的理論電勢(shì)值0.059 V。所以DOX在氧化過程中涉及質(zhì)子的參與，并且質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)等于電子轉(zhuǎn)移數(shù)。

2.4.2 掃描速率的影響

固定電位為-1.0～1.0 V，DOX的濃度為2.00×10-5mol·L-1，緩沖液pH=4.0，只改變掃描速率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著掃描速率的不斷增加，氧化峰電流也隨之增大。如果掃描速率太低，氧化峰電流較小，不利于檢測(cè)，在掃描速率為100 mV·s-1時(shí)，峰形較好，另外如果掃描速率太大，使得檢出限降低，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故本實(shí)驗(yàn)選用的掃描速率為100 mV·s-1。氧化峰值與掃描速率ν1/2呈線性關(guān)系:ipa=9.72×10-7ν1/2+3.11×10-8(mV·s-1)1/2，R=0.9973，說明DOX在PMel/GCE上的反應(yīng)過程為擴(kuò)散過程。

2.5 工作曲線和檢出限

稱取0.05799 g的DOX固體粉末，然后再用二次蒸餾水溶解并定容在50 mL容量瓶中，最后配制成2.00×10-3mol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，用循環(huán)伏安法對(duì)DOX進(jìn)行測(cè)定(圖3)。在濃度范圍為8.00×10-8～4.00×10-5mol·L-1內(nèi)與其氧化峰電流分別呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(如圖3插圖所示)，其線性方程為：ipa= 3.64+2.75c (μmol·L-1)，相關(guān)系數(shù)分別為R=0.9944。在空白溶液中逐漸加入DOX，使DOX的濃度緩慢增加，進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)加入的DOX含量為8.00×10-9mol·L-1時(shí)，檢測(cè)到了氧化峰，因此DOX的檢出限為8.00×10-9mol·L-1。

圖3 同濃度的DOX在PMel/GCE上的循環(huán)伏安曲線 (插圖為DOX的濃度與氧化峰電流的關(guān)系曲線)Fig.3 CVs of difierent concentrations of DOX at PMel/GCE

2.6 電極的重現(xiàn)性

用循環(huán)伏安法對(duì)DOX進(jìn)行平行測(cè)定六次，氧化峰電流值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.9% (n=6)。所以PMel/GCE對(duì)DOX的測(cè)定具有良好的重現(xiàn)性。

對(duì)濃度為2.00×10-5mol·L-1的DOX進(jìn)行干擾測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在允許相對(duì)誤差(±5.0%)的范圍內(nèi)，200倍的葡萄糖、KCl和NaCl；100倍的Ca2+、Mg2+，樣品中可能存在得乳糖和對(duì)羥基苯甲酸甲酯等物質(zhì)不干擾實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。

2.7 樣品的測(cè)定

10 mg注射DOX樣品，加入一定量pH=4.0的PBS溶解，定容于10 mL的容量瓶中配成樣品溶液。按照上述實(shí)驗(yàn)條件，用循環(huán)伏安法對(duì)實(shí)際樣品溶液進(jìn)行回收率的測(cè)定(表1)(n=6)?；厥章蕿?5.0%～105%，因此，PMel/GCE可以對(duì)實(shí)際樣品中的DOX含量進(jìn)行靈敏測(cè)定。

表1 實(shí)際樣品中鹽酸多柔比星的測(cè)定結(jié)果(n=6)Table 1 Determination results of DOX in real samples (n=6)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中制備了PMel/GCE，用于測(cè)定DOX，其線性范圍寬，檢出限低?？捎糜趯?shí)際樣品中DOX的檢測(cè)，回收率為95.0%～105.0%，重現(xiàn)性強(qiáng)，抗干擾性好，在分析領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊得的應(yīng)用前景。